蘇拉明通過抑制纖維增生和炎癥反應(yīng)減輕小鼠的瘢痕增生*

林 康， 蘇海燕， 虞 慶， 蔣良福， 高偉陽△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1手外整形科， 2兒童內(nèi)分泌科， 浙江 溫州 325000)

增生性瘢痕(hyperplasia scar，HPS)是一種復(fù)雜的皮膚纖維增生性疾病，以伴有傷口過度的愈合反應(yīng)為特征[1]。HPS患者的生活質(zhì)量嚴重受損，常常因為疤痕而引起身體、心理和社會上的不適[2]。已有的研究結(jié)果表明，成纖維細胞的異常增殖和活化與瘢痕形成密切相關(guān)[3]。在HPS中，活化的成纖維細胞因長時間保持活化而導(dǎo)致瘢痕收縮，通常會造成患者肢體的殘疾和功能障礙。因此，在瘢痕形成中起重要作用的成纖維細胞的過度激活和功能亢進是HPS形成的根源[4]。近年來研究人員一直致力于尋找能降低成纖維細胞功能并減少瘢痕形成的藥物來為臨床帶來新的治療策略。

蘇拉明(suramin)是多磺化萘基脲類的衍生物，具有減輕特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚組織損傷的作用[5]。近年來有研究表明，蘇拉明在減少腹膜纖維化、慢性腎纖維化及增生性眼病的纖維化方面具有良好的效果[6-7]。此外，蘇拉明能通過抑制單核巨噬細胞THP1中環(huán)二核苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cyclic AMP-GMP，cGAMP)和cGAMP合成酶(cGAMP synthase，cGAS)的表達來調(diào)節(jié)干擾素β(interferon-β,IFN-β)水平，從而起到抗炎的作用。同時，有研究表明，蘇拉明具有抑制細胞增殖作用[8]，由此，可以推測，蘇拉明可以通過抑制成纖維細胞的增殖和炎癥反應(yīng)的發(fā)生來預(yù)防增生性瘢痕的形成，但目前關(guān)于這方面的研究尚且缺乏。本研究擬通過建立增生性瘢痕小鼠模型并給予蘇拉明以探究蘇拉明對瘢痕形成的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

1.1實驗動物 8周齡的成年雌性BALB/c小鼠24只，體重為(25.5±3.4) g，小鼠均來自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(浙)2015-0001]，飼養(yǎng)溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物房[SYXK(浙)2018-0017]，飼養(yǎng)環(huán)境保持在室溫(20±6) ℃，相對濕度(60±10)%。給予動物房14 h光照/10 h黑暗光周期，小鼠可以自由攝食和飲水。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，進行HPS造模。

1.2實驗試劑 蘇拉明(YJ-25986R，上海雅吉生物科技有限公司)；HE染液試劑盒(ZKP-E151004，蘇州澤科生物有限公司)；免疫組化試劑盒(GT-2123156，上海科順生物公司)；TRIzol試劑和RIPA緩沖液(2330和3532，Sigma)；PVDF膜和SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(PB5240和18090200，Thermo Fisher Scientific)；RT-qPCR定量試劑盒(RR071A，TaKaRa); 抗IL-6、TGF-β1和α-SMA抗體(13029、19832和25439，Cell Signaling Technology)； II 抗(ab9482，Abcam)；小鼠IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β1 ELISA試劑盒(a10042、a10091、J20376和a10655，上海江萊生物公司)。

2 方法

2.1HPS模型的構(gòu)建 根據(jù)文獻[9]描述的方法制作HPS模型，在每只小鼠的背中線制作長度為2 cm的切口，然后用6-0尼龍縫合線重新縫合。在縫合線移除后的第4天，使用固定拉伸機械裝置拉伸傷口，拉伸開始于切割后第4天并持續(xù)至第14天。在拉伸期間，通過經(jīng)皮涂覆給藥的方法向治療組的小鼠瘢痕部位涂抹蘇拉明溶液，以同樣的方法向模型組小鼠給予生理鹽水，給藥頻率為每天1次，即每組分別給藥10 d。小鼠隨機分為3組：模型(model)組、低劑量蘇拉明治療組(5 mg/kg)和高劑量蘇拉明治療組(10 mg/kg)，每組8只小鼠。模型組小鼠在實驗全程給予生理鹽水，低劑量蘇拉明治療組、高劑量蘇拉明治療組小鼠在制備成HPS模型后的第4天起，每天一次分別給予5 mg/kg和10 mg/kg的蘇拉明溶液。給藥10 d后，拍照瘢痕區(qū)域，并用ImageJ軟件統(tǒng)計瘢痕表面積；然后給予過量麻醉藥物處死小鼠，收集疤痕組織。

2.2HE染色 將瘢痕組織用石蠟包埋和4%多聚甲醛固定過夜。切成5 μm切片后，切片脫蠟后再水化，然后按照HE染色試劑盒操作步驟，進行常規(guī)HE染色。

2.3ELISA檢測 取100 mg瘢痕組織置于玻璃勻漿器中，并加入500 μL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)和100 μL裂解液進行勻漿。將勻漿液在4 ℃條件下600×g離心10 min。取上清液經(jīng)BCA定量總蛋白濃度后，取50 μL上清液按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測瘢痕組織提取物中IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β1含量。IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β1水平根據(jù)標準曲線進行量化。

2.4免疫組化染色 5 μm厚度的瘢痕組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，滴加3%的過氧化氫室溫孵育10 min，PBS洗3次。然后5%羊血清封閉切片30 min。接著向切片滴加1∶500稀釋的IL-6和TGF-β1的 I 抗，并在4 ℃冰箱中過夜。PBS洗切片3次后，向切片滴加1∶500稀釋的與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的 II 抗，并在室溫下孵育45 min。PBS洗切片3次后，滴加DAB顯色液并孵育1 min，用蘇木精染核1 min并用1%的鹽酸乙醇分化，水洗返藍。常規(guī)脫水后，甘油樹脂封片。隨后使用顯微鏡觀察，并隨機拍攝6個視野，利用ImageJ軟件分析切片中IL-6和TGF-β1陽性細胞數(shù)。

2.5免疫熒光觀察 瘢痕組織經(jīng)4%多聚甲醛和蔗糖脫水后，經(jīng)OCT包埋，制作冰凍組織。然后經(jīng)冰凍切片機切6 μm厚度的切片。切片干燥后，0.5% Triton X-100通透切片10 min，然后滴加1∶500稀釋的針對α-SMA的 I 抗，并在4 ℃冰箱中過夜。PBS洗切片3次后，向切片滴加1∶500稀釋的TRITC-IG II 抗并在室溫避光下孵育45 min。PBS洗切片3次后，滴加DAPI染核5 min。甘油樹脂封片。隨后使用熒光顯微鏡觀察，并隨機拍攝6個視野，利用ImageJ軟件分析切片中α-SMA陽性細胞數(shù)。

2.6RT-qPCR實驗 將100 mg瘢痕組織在液氮中徹底研磨，然后用注射器和針頭將其均勻地分開。根據(jù)TRIzol試劑盒說明書指示，提取瘢痕組織總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒把總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用定制α-SMA引物和RT-qPCR試劑盒，根據(jù)說明書在Power SYBR Green PCR儀進行RT-qPCR。α-SMA的正向引物序列為5’-GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3’，反向引物序列為5’-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’，反向引物序列為5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’。以GAPDH為內(nèi)參照，α-SMA的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

2.7Western blot實驗 使用RIPA裂解液從皮膚瘢痕組織中提取總蛋白，采用BCA蛋白測定法測定蛋白質(zhì)的濃度。取每組20 μg的蛋白質(zhì)，行10%SDS-PAGE。用5%的BSA封閉膜上的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點，然后加入抗α-SMA抗體，在4 ℃過夜。第2天，將膜與 II 抗一起溫育。使用增強的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)使條帶可視化，并使用ImageJ軟件定量分析目的條帶。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析后Bonfferoni檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 蘇拉明減少機械牽拉后瘢痕形成的總表面積

在外用蘇拉明10 d后(切口后第4天至第14天)，與未用蘇拉明的HPS小鼠(模型組)相比，低、高劑量蘇拉明治療組瘢痕形成的總表面積均顯著減少(P<0.01),見圖1。這一結(jié)果提示，蘇拉明在HPS小鼠模型上的局部應(yīng)用可抑制由機械拉伸誘導(dǎo)的瘢痕形成。

Figure 1.The surface area of scars in HPS mice was reduced after suramin treatment. A: representative macroscopic images of scar area in different groups; B: statistical data of gross surface area of scar formation in different groups. The scale bar=5 mm. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsmodel group.

圖1 蘇拉明處理后HPS小鼠瘢痕表面積減少

2 蘇拉明降低機械牽拉后瘢痕橫截面積與瘢痕抬高指數(shù)

未用蘇拉明的HPS小鼠瘢痕橫截面面積大，可達1.5 mm2，瘢痕抬高指數(shù)高，可達3 mm2；而給予低、高劑量蘇拉明治療組小鼠瘢痕橫截面面積均顯著減少(P<0.05或P<0.01)，瘢痕抬高指數(shù)均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖2。這一結(jié)果提示，蘇拉明可減輕由機械牽拉造成的瘢痕形成程度。

Figure 2.The scar cross-sectional area and scar elevation index of HPS mice were decreased after suramin treatment. A: representative HE staining images of scar tissues in HPS model mice; B: the statistical data of cross-sectional area of scars in different groups; C: the statistical data of scar elevation index in different groups. The scale bar=400 μm. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖2 蘇拉明處理后，HPS小鼠瘢痕橫截面積減少，瘢痕抬高指數(shù)降低

3 蘇拉明抑制瘢痕組織中α-SMA表達

與未用蘇拉明的HPS小鼠(模型組)相比，低、高劑量蘇拉明治療組瘢痕組織中α-SMA陽性細胞比例顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖3A,α-SMA mRNA表達水平(P<0.05或P<0.01)和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01),見圖3B、3C。

4 蘇拉明抑制瘢痕組織中IL-6與TGF-β1表達

免疫組化結(jié)果顯示，與未用蘇拉明的HPS小鼠(模型組)相比，低、高劑量蘇拉明治療組瘢痕組織中TGF-β1陽性細胞數(shù)和IL-6陽性細胞數(shù)均顯著降低(P<0.01)，見圖4。該結(jié)果表明，蘇拉明能減少瘢痕組織中IL-6與TGF-β1的表達。

5 蘇拉明降低瘢痕組織中炎癥因子含量

ELISA結(jié)果顯示，與未用蘇拉明的HPSs小鼠(模型組)相比，低、高劑量蘇拉明治療組瘢痕組織中IL-6、IL-10、TNF-α和TGF-β1含量均顯著降低(P<0.01)，見圖5。

討 論

30%～90%的患者能發(fā)生HPS，其特征是真皮病理性過度纖維化和傷口愈合異常[1,10]。除畸形的外觀和顯著的功能障礙外，還可能出現(xiàn)紅斑、色素沉著不足或過多、瘙癢，灼熱和潰瘍等癥狀表現(xiàn)[11]。目前對HPS的治療仍是一個棘手的問題，現(xiàn)有的治療策略包括壓力療法、放射療法和皮質(zhì)類固醇激素治療,然而，這些方法都有其自身的局限性。一項薈萃分析的結(jié)果顯示，壓力療法并未改善瘢痕總體評分[12]，原因與壓力衣的不適感造成患者依從性低有關(guān)[13]；皮質(zhì)類固醇激素治療也會導(dǎo)致高復(fù)發(fā)率和預(yù)后不良[10]；放射治療雖是一種有效的治療方法然而對機體產(chǎn)生的副作用也較強[14]。因此，尋找一種安全且有效的藥物來減少HPS發(fā)生成為亟待解決的問題。近期一項對青光眼濾過性手術(shù)后抗瘢痕化治療的研究顯示[15]，蘇拉明是一種抗瘢痕化效率高、副作用少、安全性好的治療藥物，提示蘇拉明具有較好的抗瘢痕效果，因此本研究選取蘇拉明作為研究抗瘢痕效果的藥物。

Figure 3.The expression of α-SMA in scar tissues of HPS mice was decreased after suramin treatment. A: the expression of α-SMA was detected by immunofluorescence staining; B: the mRNA expression of α-SMA was detected by RT-qPCR; C: the protein expression of α-SMA was detected by Western blot. The scale bar=200 μm. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vsmodel group.

圖3 蘇拉明處理后HPS小鼠瘢痕組織中α-SMA表達降低

在這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)在機械負荷誘導(dǎo)的小鼠模型中局部應(yīng)用蘇拉明能顯著減少瘢痕總表面積、瘢痕橫截面大小和降低瘢痕抬高指數(shù)，表明蘇拉明能顯著抑制HPS的形成。成纖維細胞的過度增殖與機體炎癥反應(yīng)的過度激活是HPS形成重要的病理生理基礎(chǔ)[16]。成纖維細胞的異常增殖將導(dǎo)致瘢痕肥大[17]，而活化的成纖維細胞會過度表達α-SMA。α-SMA是成纖維細胞標記物，與瘢痕攣縮密切相關(guān)。以往的研究顯示，隨著增生性瘢痕的增生和減退過程中，α-SMA的表達量明顯呈由強至弱的變化，二者之間有較強的關(guān)聯(lián)性[18]，因此α-SMA的表達量可間接反映成纖維細胞的增殖情況。本研究結(jié)果表明，蘇拉明可抑制疤痕組織中α-SMA表達，提示蘇拉明可抑制成纖維細胞的活性。過度的炎癥反應(yīng)已被證實在過度瘢痕形成中起主導(dǎo)作用，傷口部位的角質(zhì)形成細胞可分泌大量的細胞因子，導(dǎo)致瘢痕肥大[1]。以往關(guān)于蘇拉明對角質(zhì)形成細胞影響的研究也表明，蘇拉明可使參與炎癥反應(yīng)的基因表達產(chǎn)物減少[19]，我們的研究結(jié)果也提示蘇拉明可能通過減少細胞分泌炎癥因子來抑制HPS的形成。TGF-β1是與傷口愈合和組織纖維化密切相關(guān)的促纖維細胞因子，廣泛參與成纖維細胞增殖、活化和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成[20-21]。IL-6可通過誘導(dǎo)Th1細胞反應(yīng)將急性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)楦缘拇倮w維化狀態(tài)，從而導(dǎo)致組織修復(fù)受損[22]。鑒于此，本研究進一步檢測TGF-β1和IL-6的存在來明確蘇拉明對瘢痕形成過程中炎癥反應(yīng)的影響。我們的研究結(jié)果顯示，蘇拉明以劑量依賴的方式顯著降低HPS模型小鼠中TGF-β1和IL-6的水平，表明蘇拉明可抑制促纖維化炎癥因子的產(chǎn)生來抑制瘢痕的過度增生。此外，以往的研究也曾顯示 TNF-α和IL-10在慢性炎癥纖維化中發(fā)揮重要的作用[23-24]，為了進一步探究蘇拉明在瘢痕形成過程中與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，本研究檢測TNF-α和IL-10水平，結(jié)果顯示，使用蘇拉明可降低HPS模型中TNF-α和IL-10水平，且蘇拉明給藥劑量越高時降低幅度越大，提示蘇拉明可能通過降低炎癥因子的水平，從而起到延緩纖維化過程的作用。

Figure 4.The expression of TGF-β1 and IL-6 in scar tissues of HPS mice was decreased after suramin treatment. A: the representative immunohistochemical staining images of TGF-β1 and IL-6 in scar tissues; B: the statistical data of TGF-β1 positive cells; C: the statistical data of IL-6 positive cells. The scale bar=400 μm. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsmodel group.

圖4 蘇拉明處理后HPS小鼠瘢痕組織中TGF-β1和IL-6表達降低

Figure 5.The levels of IL-6, IL-10, TGF-β1 and TNF-α in the scar tissues of the HPS mice were reduced after suramin treatment. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsmodel group.

圖5 蘇拉明處理后，HPS小鼠瘢痕組織中IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α的含量減少

綜上所述，本研究表明蘇拉明可通過抑制α-SMA表達來減緩纖維增生，并通過降低炎癥因子的水平來抑制炎癥的發(fā)生，從而抑制由機械牽拉所致的增生性瘢痕形成。本研究結(jié)果對其他纖維化疾病也具有一定的參考意義，但有待未來更多的研究來說明。