miR-128-3p靶向TCF4抑制黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

侯紹蔚， 張連清， 席海英， 趙愛玲， 侯 恒

(1山西大同大學醫(yī)學院, 2大同市第五人民醫(yī)院皮膚科, 3大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 山西 大同 037009)

黑色素瘤是一種惡性程度很高的腫瘤，是最致命的皮膚癌，其2年生成率為15%，5年生成率僅為5%。病理研究表明，黑色素瘤內(nèi)有很多免疫細胞，可以據(jù)此開發(fā)針對免疫系統(tǒng)的治療藥物。近年來，利用人體自身免疫系統(tǒng)靶向治療的方法已初見成效[1-3]。研究表明，機體內(nèi)各種腫瘤都存在對應(yīng)的原癌基因和抑癌基因，原癌基因被激活、抑癌基因被抑制與腫瘤的發(fā)生有直接關(guān)系[4]。研究表明，微小RNA-128-3p(microRNA-128-3p,miR-128-3p)可以通過靶向抑癌基因抑制T淋巴細胞白血病、肝癌細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖，其低表達可能提示患者的不良預(yù)后[5-8]。Wnt信號通路通常與機體器官發(fā)生相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4，TCF4)是其重要調(diào)節(jié)蛋白，高表達TCF4可異常激活該通路使β-catenin轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，競爭性結(jié)合TCF4，形成β-catenin/TCF4復(fù)合物，與此同時聚集且激活TCF4下游的轉(zhuǎn)錄因子，最終導(dǎo)致細胞異常增殖和腫瘤發(fā)生[9-12]。本文以人黑色素瘤A375細胞為研究對象，探究高表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的調(diào)控作用及其作用機制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

DMEM細胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自Gibco；miR-128 mimic和pcDNA-TCF4(pc-TCF4)由上海吉瑪生物設(shè)計合成；Lipfectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自Thermo Fisher；I抗和II抗均購自Abcam；RIPA裂解液購自Sigma；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；Dual-Luciferase? Report報告基因試劑盒購自Promega；EdU試劑盒購自廣州銳博生物有限公司；Matrigel購自Invitriogen。

PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人惡性黑色素瘤A375細胞株購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。用含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，融合率達到85%以上進行傳代培養(yǎng)。

2.2細胞轉(zhuǎn)染 將細胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，用培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整為1×109/L，每孔接種1 mL細胞懸液。將培養(yǎng)板置于上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書采用Lipofectamine 2000將miR-128 mimic和/或pc-TCF4轉(zhuǎn)染到A375細胞，轉(zhuǎn)染4 h后更換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后進行相關(guān)檢測。

2.3RT-qPCR 將細胞隨機分為對照(control)組和miR-128 mimic組。control組加入正常細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，miR-128 mimic組加入含有miR-128 mimic的轉(zhuǎn)染液進行培養(yǎng)。48 h后用Trizol試劑提取細胞RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成miR-128-3p的cDNA，進行PCR擴增后，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒對cDNA進行檢測，以GAPDH為內(nèi)參照。實驗所用引物由上海生工設(shè)計合成。miR-128-3p 上游引物序列為5’-UCACAGUGAACCGGUCUCUUU-3’，下游引物序列為5’-AGAGACCGGUUCACUGUGAUU-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游引物序列為5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。

2.4螢光素酶報告基因?qū)嶒?首先，通過生物信息預(yù)測TCF4在miR-128-3p上的結(jié)合位點，并對結(jié)合位點片段進行擴增。隨后將擴增片段插入pcDNA載體上，構(gòu)建TCF4野生型質(zhì)粒。利用基因位點突變技術(shù)將結(jié)合位點片段中部分核苷酸突變，構(gòu)建TCF4突變型質(zhì)粒。用TCF4野生型質(zhì)?；騎CF4突變型質(zhì)粒和miR-128 mimic對A375細胞進行共轉(zhuǎn)染，根據(jù)Dual-Luciferase? Report報告基因試劑盒說明書檢測各組螢光素酶活性。

2.5EdU染色檢測細胞增殖 取第3代A375細胞，接種于96孔板內(nèi)，每孔接種2×107/L細胞懸液200 μL，細胞貼壁后，換終濃度為10 μmol/L的EdU培養(yǎng)液，孵育48 h，每組設(shè)3個重復(fù)孔。棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，多聚甲醛固定30 min，按照說明書加入Apollo染色反應(yīng)液30 min后，再加入Hoechst染色反應(yīng)液30 min，最后用PBS清洗1遍。每組每個孔隨機取3個視野在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)并拍照。EdU陽性細胞在綠光激發(fā)下發(fā)紅色熒光，Hoechst陽性細胞在紫外光激發(fā)下發(fā)藍色熒光。EdU陽性細胞標記率(%)=發(fā)紅色熒光細胞數(shù)/發(fā)藍色熒光細胞數(shù)×100%。

2.6細胞侵襲實驗 將轉(zhuǎn)染后細胞傳代接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，細胞密度為4×108/L，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell小室下層則加入正常細胞培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽拭去小室上層細胞，用結(jié)晶紫將遷移至小室下層的A375細胞染色，每組隨機選取5個視野對染色細胞進行基數(shù)統(tǒng)計。實驗至少重復(fù)3次，每組6個復(fù)孔。

2.7Western blot實驗 將細胞隨機分為control組、miR-128 mimic組、pc-TCF4組和miR-128 mimic+pc-TCF4(mimic+pc-TCF4)組，用miR-128 mimic和/或pc-TCF4轉(zhuǎn)染A375細胞后，用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調(diào)平。每組取等量蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，以1 ∶1 000的濃度加入抗TCF4、E-cadherin、vimentin、cyclin D和c-Myc的I抗，4 ℃孵育過夜。第2天棄去I抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入II抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學處理

用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行檢驗。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 miR-128-3p與TCF4的靶向關(guān)系

生物信息預(yù)測結(jié)果顯示，miR-128-3p序列上存在連續(xù)的TCF4結(jié)合位點，見圖1A。同時，采用螢光素酶報告實驗進一步確定了miR-128-3p和TCF4的靶向關(guān)系。實驗結(jié)果顯示miR-128-3p能顯著降低TCF4野生型質(zhì)粒的螢光素酶活性(P<0.01)，當TCF4上結(jié)合位點突變后，miR-128-3p對TCF4質(zhì)粒螢光素酶活性的抑制作用消失，見圖1D。

Figure 1.Targeting relationship between miR-128-3p and TCF4. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group;△△P<0.01vspc-TCF4 wt group.

圖1 miR-128-3p與TCF4的靶向關(guān)系

2 過表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞表達TCF4的影響

RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明，miR-128 mimic組miR-128-3p的表達水平較control組顯著升高(P<0.01)，見圖1B，說明過表達成功。與control組比較，miR-128 mimic組的TCF4相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，pc-TCF4組的TCF4相對蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；同時，miR-128 mimic+pc-TCF4組與pc-TCF4組相比較，TCF4的相對蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),見圖1C，提示過表達miR-128-3p可以靶向抑制黑色素瘤A375細胞TCF4的蛋白表達。

3 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞增殖

EdU標記的A375細胞孵育48 h后，鏡下觀察EdU陽性細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，與control組比較，miR-128 mimic組的陽性細胞標記率顯著降低(P<0.01)，而pc-TCF4組的陽性細胞標記率顯著升高(P<0.01)，同時，mimic+pc-TCF4組的陽性細胞標記率較pc-TCF4組顯著降低(P<0.01)，見圖2。這提示miR-128-3p可以通過靶向調(diào)節(jié)TCF4的表達抑制黑色素瘤A375細胞的增殖。

Figure 2.The effect of miR-128-3p on the proliferation of melanoma A375 cells (Apollo and Hoechst staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖2 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞增殖的影響

4 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲能力

采用侵襲實驗檢測過表達miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明與control組比較，miR-128 mimic組的侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，而pc-TCF4組侵襲細胞數(shù)顯著增加(P<0.01)；同時，mimic+pc-TCF4組與pc-TCF4組比較，侵襲細胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，見圖3。這表明miR-128-3p可通過抑制TCF4的表達降低黑色素瘤A375細胞的侵襲能力。

Figure 3.The effect of miR-128-3p on the invasion ability of melanoma A375 cells (crystal violet staining, ×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖3 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞侵襲能力的影響

5 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞EMT的發(fā)生

將各組細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)可見，與control組比較，miR-128 mimic組細胞形態(tài)多呈卵圓形或方形，排列緊密；pc-TCF4組細胞形態(tài)多呈長梭形，排列疏松；而mimic+pc-TCF4組較pc-TCF4組相比，細胞形態(tài)多呈梭形，但細胞排列更為緊密，見圖4A。

Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-128-3p后對黑色素瘤A375細胞EMT標志物表達的影響，結(jié)果顯示與control組比較，miR-128 mimic組的E-cadherin表達水平顯著升高，vimentin表達水平顯著降低(P<0.01)。而與control組比較，pc-TCF4組E-cadherin表達水平顯著降低，vimentin表達水平顯著升高(P<0.01)。與pc-TCF4組相比，mimic+pc-TCF4組E-cadherin表達水平顯著升高，vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖4B。

綜上所述，miR-128-3p可通過抑制間充質(zhì)標志蛋白vimentin、增加上皮標志蛋白E-cadherin的表達而抑制A375細胞的EMT能力。

Figure 4.The effect of miR-128-3p on EMT of melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖4 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞EMT的影響

6 過表達miR-128-3p抑制黑色素瘤A375細胞TCF4下游靶基因的蛋白表達

Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-128-3p后對黑色素瘤A375細胞TCF4下游分子cyclin D和c-Myc表達的影響，結(jié)果顯示,與control組比較，miR-128-mimic組cyclin D和c-Myc的蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，而pc-TCF4組兩者的表達水平均顯著升高(P<0.01)；同時，mimic+pc-TCF4組兩者的表達水平較pc-TCF4組顯著降低(P<0.01)，見圖5。這提示過表達miR-128-3p可以顯著抑制TCF4下游分子cyclin D和c-Myc的表達水平。

Figure 5.The effects of miR-128-3p on the protein expression of cyclin D and c-Myc in the melanoma A375 cells. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vspc-TCF4 group.

圖5 miR-128-3p對黑色素瘤A375細胞cyclin D和c-Myc蛋白表達的影響

討 論

研究表明，人體有超過60%的蛋白質(zhì)編碼基因上都具有miRNAs的結(jié)合位點，在細胞生長、增殖、凋亡和遷移過程中具有重要的調(diào)控作用，同時可以通過調(diào)控蛋白編碼基因的表達影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。但是miR-128-3p與TCF4的靶向關(guān)系還未得到證實。本實驗研究表明，miR-128-3p可以靶向結(jié)合TCF4而抑制其表達，而pc-TCF4能明顯減弱miR-128-3p對TCF4表達的抑制作用。

影響腫瘤細胞增殖是miRNAs抑制腫瘤/癌癥發(fā)生發(fā)展的重要機制。大量研究表明，miR-199a/b-3p在多種癌癥中表現(xiàn)出抑癌基因和抑制細胞增殖的作用，包括肝癌、甲狀腺乳頭狀癌、子宮內(nèi)膜樣腺癌、腎細胞癌、骨肉瘤、卵巢癌和胃癌[4]。雙螢光素酶報告分析證實miR-330-3p靶向TPX2,負向調(diào)節(jié)TPX2的表達，從而抑制黑色素瘤細胞的增殖[15]。miR-128-3p也可以通過靶向抑癌基因抑制T淋巴細胞白血病、肝癌細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖[5-8]。靶向調(diào)控TCF4可以抑制人成纖維細胞的增殖[16]。為了探討miR-128-3p能否通過靶向TCF4調(diào)控黑色素瘤A375細胞的增殖能力，本實驗發(fā)現(xiàn)，TCF4能促進A375細胞增殖，但miR-128-3p能通過靶向抑制TCF4的表達而降低黑色素瘤A375細胞的增殖。

另外，研究表明，可通過調(diào)控miR-128-3p的表達抑制基底細胞樣乳腺癌細胞遷移[17]，同時miR-128-3p的過表達也可以靶向調(diào)節(jié)DJ-1基因的表達而促進肝癌細胞的凋亡，從而對抗癌藥索拉菲尼產(chǎn)生較好的反應(yīng)[18]，且miR-128-3p可以抑制高度惡性非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥性[19]。但miR-128-3p對黑色素瘤細胞遷移能力的影響還未見報道。本文研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤A375細胞過表達miR-128-3p后侵襲細胞數(shù)量明顯減少，說明miR-128-3p能抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲，同時，過表達TCF4后，侵襲細胞數(shù)量明顯增加。說明，TCF4能增強A375細胞的侵襲能力，但miR-128-3p能通過靶向抑制TCF4的表達而抑制A375細胞的侵襲能力。

EMT是指上皮細胞失去極性和細胞獲得間充質(zhì)特性從而增加細胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的過程[20-21]，是多種腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的重要過程。E-cadherin被認為是此過程的基礎(chǔ)，E-cadherin參與并介導(dǎo)細胞之間相互黏附，是一種重要的細胞黏附因子，與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有不可分割的聯(lián)系，它的低表達或者表達缺失被認為是腫瘤EMT的關(guān)鍵步驟[22]。研究發(fā)現(xiàn)[23]，犬腎臟上皮細胞過度表達TCF4能增加細胞侵襲能力，從而加速腫瘤EMT的發(fā)生，其中可見上皮標志蛋白E-cadherin的明顯下調(diào)和間充質(zhì)標志蛋白vimentin的表達上升。miR-128-3p能作為腫瘤抑制因子通過靶向ZEB1抑制食管鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移和EMT[24]。另有報道稱，通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，miR-128-3p可以抑制非小細胞肺癌EMT[19]。為了證明miR-128-3p能否靶向TCF4抑制黑色素瘤細胞的EMT，我們通過實驗發(fā)現(xiàn)：在倒置顯微鏡下，過表達miR-128-3p的細胞形態(tài)呈卵圓形或方形并且排列緊密；同時可高表達上皮標志蛋白E-cadherin,低表達間充質(zhì)標志蛋白vimentin，而TCF4可以減弱miR-128-3p對E-cadherin和vimentin的調(diào)節(jié)作用。這說明在A375細胞中miR-128-3p可抑制A375細胞之間極性喪失，阻止其向間充質(zhì)細胞發(fā)展，降低細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，抑制A375細胞EMT的發(fā)生。

當Wnt信號通路激活時，β-catenin轉(zhuǎn)移到核內(nèi)競爭性結(jié)合TCF4形成β-catenin/TCF4復(fù)合物，激活TCF4下游的轉(zhuǎn)錄因子，如cyclin D和c-Myc，最終導(dǎo)致細胞異常增殖和腫瘤發(fā)生[10]。研究表明，Wnt信號的突變異常激活TCF4靶基因可以促進結(jié)直腸癌的惡性轉(zhuǎn)化[25]。本實驗過表達miR-128-3p后發(fā)現(xiàn)黑色素瘤A375細胞內(nèi)cyclin D和c-Myc蛋白表達水平均有明顯下調(diào)，但同時表達TCF4后，兩者的表達水平明顯上調(diào)。這說明miR-128-3p能靶向抑制TCF4對cyclin D和c-Myc蛋白表達水平的上調(diào)作用。

綜上所述，本文初步探討了miR-128-3p在黑色素瘤A375細胞增殖、侵襲和EMT中的作用，說明miR-128-3p可以通過靶向抑制TCF4表達而實現(xiàn)對A375細胞增殖、侵襲和EMT的抑制作用，為進一步研究miR-128-3p在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了新的思路。