巨噬細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體α激活抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞活化及遷移*

王文偉， 王 霞， 孫艷宇， 于寶琪， 曲愛娟

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 重塑相關(guān)心血管疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100069)

高血壓性心臟重塑導(dǎo)致的心力衰竭目前仍是全球范圍內(nèi)心血管疾病死亡的主要原因之一[1-2]。心臟病理性重塑是病理刺激條件下心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子之間相互作用的病理過程，主要包括心臟炎癥、纖維化和肥厚等過程，而心臟纖維化是心臟重塑的主要病理改變。心臟成纖維細(xì)胞遷移到損傷部位并活化成為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞合成大量膠原導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積和膠原蛋白在間質(zhì)和血管周圍過多的累積，引起心肌僵硬度增加并導(dǎo)致心臟收縮或舒張功能障礙，加速心力衰竭進(jìn)展[3-4]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)功能失調(diào)在高血壓性心臟纖維化的病理生理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，其中血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)是RAS系統(tǒng)中導(dǎo)致高血壓性心臟纖維化最重要的效應(yīng)分子[5-6]。既往研究表明，Ang II刺激后的心臟組織招募大量的外周單核/巨噬細(xì)胞，激活的單核/巨噬細(xì)胞釋放大量炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，加劇心臟炎癥和纖維化，加速心力衰竭的進(jìn)程[7]。巨噬細(xì)胞在心臟纖維化重塑中發(fā)揮著重要作用[7]。過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)是過氧化物酶體增殖物激活受體家族的主要成員，內(nèi)源性配體主要是非飽和脂肪酸，外源性配體包括WY14643和貝特類藥物。PPARα具有重要的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，可減輕心臟梗死或損傷后炎癥反應(yīng)[8-9]，但是巨噬細(xì)胞PPARα在心臟纖維化中的作用目前尚不清楚。因此，本文將研究巨噬細(xì)胞PPARα在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞活化和遷移過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物操作均遵循首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例，實(shí)驗(yàn)方案得到首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

2 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞分別從8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠的骨髓和心臟中分離培養(yǎng)所得。

3 主要試劑

胰酶(#85450C-100G)和膠原酶II(#C6885-5G)購自Sigma；DMEM培養(yǎng)基(#10-013-CVR)和胎牛血清(#SH30406.02HI)購自Corning；D-Hanks液(#H1045-500)和青、鏈霉素(#P1400)購自Solarbio；PBS(#SH30256.01B,HyClone)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF; #315-02，PeproTech)；血管緊張素Ⅱ(#ab120183，Abcam)；WY14643(#A4305，MCE)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#A5001，Promega)；SYBR Green(#RR420A，TaKaRa)；RIPA裂解液(#C1053+)和脫脂奶粉(#P1622)購自普利萊；蛋白酶抑制劑HaltTMProtease Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher Scientific)；PVDF膜(#ISEQ00010,Immobilon)；、抗β-actin單克隆抗體(#ab8266，Abcam)；抗白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)多克隆抗體(#bs-4539R,BIoss)；抗collagen I多克隆抗體(#14695-1-AP)和抗collagen III多克隆抗體(#22734-1-AP)購自Proteintech；抗IL-β單克隆抗體(#12242)、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體(#48938)、羊抗兔IgG II抗(#7074)和羊抗小鼠IgG II抗(#7076)購自Cell Signaling Technology；RT-qPCR引物購自Sangon Biotech，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

Acta2: actin alpha 2, encoding α-SMA; Col1a2: collagen type Ⅰ alpha 2 chain; Col3a1: collagen type Ⅲ alpha 1 chain.

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1鼠骨髓巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 常規(guī)方法從小鼠脛骨和股骨中分離提取小鼠骨髓細(xì)胞，使用M-CSF(50 μg/L)誘導(dǎo)3 d使之分化為成熟的巨噬細(xì)胞后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。將分化的巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照(control)組、WY14643組(10 μmol/L處理30 h)、Ang II組(1 μmol/L刺激24 h)和Ang II+WY14643組(10 μmol/L WY14643預(yù)處理6 h后給予1 μmol/L Ang II刺激24 h)。

4.2小鼠心臟成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 酶消化法(0.07%胰酶和0.04%的膠原酶II的混合酶)分離小鼠心臟成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)并使用第2代心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。心臟成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為4組，分別給予上述巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4.3心臟成纖維細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 使用無菌槍頭在6孔板的細(xì)胞中由上而下以均勻的力度劃一條直線，用PBS 清洗掉細(xì)胞殘片，拍照后加入上述4組巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后結(jié)晶紫染色后拍照[10]。使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)劃痕區(qū)域遷移的細(xì)胞數(shù)目。

4.4總RNA提取和RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 利用TRIzol有機(jī)溶劑抽提法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)量濃度及質(zhì)控指標(biāo)后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。利用Bio-Rad CFX Connect Real-time System PCR儀進(jìn)行real-time PCR獲得可靠的擴(kuò)增曲線后，以β-actin為內(nèi)參照，通過ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，即目的基因相對(duì)表達(dá)量= 2-ΔΔCt[ΔΔCt=(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct-相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參Ct)-(對(duì)照組目的基因Ct-相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參照Ct)]。

4.5總蛋白提取和Western blot實(shí)驗(yàn) 利用RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白，蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，孵育I抗和II抗，利用化學(xué)發(fā)光法顯色發(fā)光，隨后使用ImageJ 進(jìn)行吸光度值分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。首先要評(píng)估數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，然后進(jìn)行正態(tài)分布數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的兩組數(shù)據(jù)采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的單因素比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Ang Ⅱ處理可下調(diào)巨噬細(xì)胞中PPARα的表達(dá)

體外給予巨噬細(xì)胞Ang II處理24 h后，RT-qPCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-1α mRNA水平以及PPARα mRNA水平的改變。結(jié)果顯示Ang Ⅱ明顯升高巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平(P<0.01)，同時(shí)顯著降低巨噬細(xì)胞中PPARα的mRNA水平(P<0.05)，見圖1。以上結(jié)果提示PPARα可能在Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

2 激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

體外給予巨噬細(xì)胞PPARα激動(dòng)劑WY14643處理后，觀察巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果顯示，WY14643可顯著降低Ang II誘導(dǎo)的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平(P<0.05)，見圖2A～C。Western blot結(jié)果顯示W(wǎng)Y14643也顯著降低Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子pro-IL-1β和IL-6的蛋白水平(P<0.05)，見圖2D。這提示激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

Figure 1.Ang II induced macrophage inflammatory response and significantly down-regulated PPARα expression. Macrophages were treated with Ang II for 24 h. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of IL-6 (A), IL-1β (B), TNF-α (C) and PPARα (D) in the macrophages. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 Ang II 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)顯著下調(diào)PPARα的表達(dá)

3 激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的活化

用上述巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞24 h，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，WY14643和Ang II聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基降低心臟成纖維細(xì)胞纖維化標(biāo)志物Col1a2、Col3a1和Acta2的mRNA水平(P<0.05)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)Y14643和Ang II聯(lián)合處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基降低心臟成纖維細(xì)胞中collagen I、collagen III (P<0.01)和α-SMA的蛋白水平(P<0.05)，見圖3。這提示激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的活化。

4 激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用

對(duì)心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)后，隨機(jī)加入上述4組巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，結(jié)果顯示Ang II處理的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基顯著增強(qiáng)心臟成纖維細(xì)胞的遷移(P<0.01)，而PPARα激動(dòng)劑WY14643聯(lián)合Ang II處理后的巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基明顯抑制心臟成纖維細(xì)胞的遷移(P<0.01)，見圖4。這提示PPARα激活可能通過減輕Ang Ⅱ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)抑制心臟成纖維細(xì)胞的遷移。

討 論

我們的研究結(jié)果顯示Ang II誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的同時(shí)顯著下調(diào)PPARα，而PPARα激動(dòng)劑WY14643可以顯著減輕Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)可顯著促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的活化和遷移，而PPARα激動(dòng)劑WY14643可通過減輕Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制心臟成纖維細(xì)胞的活化和遷移，從而提示巨噬細(xì)胞PPARα可能在免疫細(xì)胞參與的心臟纖維化過程中發(fā)揮重要的抑制作用。

既往研究表明，免疫炎癥反應(yīng)在高血壓心臟纖維化中發(fā)揮重要作用[11]，其中單核細(xì)胞和心臟常駐巨噬細(xì)胞是心臟組織修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。巨噬細(xì)胞通常分為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M1)和非經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(M2)兩型，分別發(fā)揮促炎和抗炎作用[11]。組織損傷后的初期，以M1型為主的心臟常駐巨噬細(xì)胞會(huì)分泌大量促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和趨化因子，從外周招募大量單核細(xì)胞遷移到損傷部分，并促進(jìn)這些單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型促炎巨噬細(xì)胞，加劇心臟炎癥反應(yīng)[7, 12]。巨噬細(xì)胞可通過分泌炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子，以及改變細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和MMP組織抑制劑平衡的方式，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)中細(xì)胞外基質(zhì)的生成，調(diào)節(jié)心臟纖維化[7, 13]。我們的研究表明Ang II顯著增加巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，而且巨噬細(xì)胞激活后的條件培養(yǎng)基明顯增加心臟成纖維細(xì)胞纖維化標(biāo)記物的mRNA和蛋白水平，這進(jìn)一步證實(shí)了Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化。

Figure 2.PPARα activation inhibited Ang II-induced expression of inflammatory cytokines in the macrophage. The macrophages were treated with WY14643 (10 μmol/L) and Ang II (1 μmol/L). RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of IL-6 (A), IL-1β (B) and TNF-α (C) in the macrophages. Western blot was used to detect the protein levels of pro-IL-1β and IL-6 in the macrophages (D). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsAng II group.

圖2 激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

Figure 3.Activation of PPARα inhibited macrophage (Mφ) inflammation-induced cardiac fibroblast activation. Cardiac fibroblasts were stimulated with the conditioned medium (CM) derived from the macrophages. RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of Col1a2 (A), Col3a1 (B) and Acta2 (C) in the cardiac fibroblasts. Western blot was used to determine the protein levels of collagen I, α-SMA and collagen III in the cardiac fibroblasts (D and E). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol Mφ CM group;#P<0.05,##P<0.01vsAng II Mφ CM group.

圖3 激活PPARα可抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞的活化

Figure 4.PPARα activation inhibited the migration ability of cardiac fibroblasts promoted by Ang II-induced macrophage inflammation. Wound-healing assay was applied to evaluate the migration ability of cardiac fibroblasts, and samples were photographed at 0 h and 6 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol Mφ CM group;##P<0.01vsAng II Mφ CM group.

圖4 PPARα激活抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用

PPARα除了在脂肪酸β氧化水平高的組織中廣泛表達(dá)，也在單核/巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[14-15]。既往報(bào)道激活后的PPARα可以負(fù)性調(diào)控促炎轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1和STAT的活性發(fā)揮抗炎作用[16]。WY14643是PPARα的外源性配體，在無配體結(jié)合時(shí)，PPARα和RXR形成的異源二聚體與轉(zhuǎn)錄共抑制因子結(jié)合，當(dāng)配體與PPARα結(jié)合后，PPARα和RXR形成的異源二聚體與轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合形成的復(fù)合物與靶基因啟動(dòng)子上的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。WY14643可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)換，降低 NOS-2和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并增加M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)[17]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARα激動(dòng)劑WY14643明顯減輕Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥，而且炎癥水平減輕的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清抑制心臟成纖維細(xì)胞纖維化標(biāo)志物的表達(dá)。這說明PPARα激活抑制Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，而且間接抑制心臟成纖維細(xì)胞活化和遷移。

既往研究表明巨噬細(xì)胞可以通過分泌的細(xì)胞因子和趨化因子激活成纖維細(xì)胞內(nèi)的TGFβ1/Smad2/3信號(hào)通路[7]，也可通過損傷信號(hào)分子激活成纖維細(xì)胞p38-MAPK非經(jīng)典信號(hào)通路促進(jìn)心臟纖維化[18]。但是PPARα激活導(dǎo)致巨噬細(xì)胞炎癥水平降低的機(jī)制以及巨噬細(xì)胞炎癥介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞活化的具體機(jī)制都需在巨噬細(xì)胞特異性敲除PPARα小鼠、體外骨髓源性巨噬細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞上進(jìn)一步探究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)可促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞的活化和遷移，且PPARα激活抑制了Ang II誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)對(duì)心臟成纖維細(xì)胞活化和遷移的促進(jìn)作用。