載鹽酸阿霉素液態(tài)氟碳脂質(zhì)體對(duì)乳腺癌治療效果

蘇 琳，賈 丹，許曉華*，胡 聰，黃 菊，譚筱林，賈亦真，王志剛，任建麗

(1.香港大學(xué)深圳醫(yī)院超聲科，廣東 深圳 518053；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所，重慶 400010)

超聲分子成像作為分子影像技術(shù)之一，具有無創(chuàng)、無毒、無輻射、實(shí)時(shí)、可重復(fù)應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)，且以靶向超聲造影劑為示蹤劑，可在分子水平對(duì)體內(nèi)組織器官進(jìn)行探查、顯像[1-2]。液態(tài)氟碳(fluorocarbon, PFH)作為一種可相變材料，在體外超聲輻照下，可發(fā)生液氣相變，增強(qiáng)超聲造影。阿霉素(hydrochloride, DOX)為兩親性蒽環(huán)類抗生素，抗腫瘤適應(yīng)證較廣，在血漿中消失迅速[3-4]，廣泛分布于心、肝、脾、肺、腎臟中，但其心臟毒性較大[5-7]。脂質(zhì)體包封抗腫瘤藥物可望提高藥物的靶向性、降低毒性。提高脂質(zhì)體靶向性，需延長(zhǎng)脂質(zhì)體在血液中的循環(huán)時(shí)間[8-9]。對(duì)脂質(zhì)體膜進(jìn)行改性修飾，可達(dá)到延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間的作用，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的治療作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜振蕩法制備載DOX的脂質(zhì)體，觀察該納米粒不同時(shí)間增強(qiáng)超聲顯影情況以及對(duì)人乳腺癌MAD-MB-231細(xì)胞治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 氫化大豆卵磷脂(hydrogenated soybean phosphatidylcholine, HSPC)、膽固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)(油脂株式會(huì)社)，DOX(Sigma公司)，cck-8試劑盒、Annexin-V/PI凋亡試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。二棕櫚酰磷脂酰甘油(dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, DPPG)、PFH(ElfAtochem公司)，人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究院)。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，低強(qiáng)度聚焦超聲(low intensity focused ultrasound, LIFU)診斷儀(重慶醫(yī)科大學(xué)影像研究所)，Zetasizer Nano ZS90光粒徑測(cè)量?jī)x(Malvern)，UV2500 UV-VIS紫外可見光分光光度計(jì)(島津公司)，高效液相色譜儀(TSP)，百勝M(fèi)ylab90型彩色超聲診斷儀(探頭頻率5～9 MHz)。

1.2 方法

1.2.1 脂質(zhì)體的制備 將DOX、HSPC、DPPG、PEG2000-DSPE、膽固醇以一定的質(zhì)量比例(1.0:5.0:2.0:1.5:1.5)溶于10 ml氯仿，裝入圓底燒瓶，密封；完全溶解后，將燒瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)2 h，蒸干氯仿，轉(zhuǎn)速80 rpm；待圓底燒瓶底部形成均勻脂膜后加入PBS溶液，將其置于恒溫箱內(nèi)緩慢振蕩直至水化完全；在冰浴條件下進(jìn)行聲振乳化(100 W，8 min)，乳化過程中同時(shí)逐滴加PFH，最后獲得乳白色混懸液，即為載藥液態(tài)氟碳Lip-PFH納米粒。通過低溫離心機(jī)(5 min，80 rpm)，采用不同質(zhì)量配比的DOX和磷脂(DOX:磷脂為1:3、1:5、1:8、1:10、1:12、1:15、1:20)制備Lip-PFH-DOX納米粒，并于冰箱保存。

1.2.2 基本特征觀察 將制備的Lip-PFH-DOX納米粒置于10 ml離心管，觀察其顏色，有無聚集和沉淀。透射電鏡下觀察納米粒的形態(tài)，并用馬爾文粒徑儀測(cè)量該納米粒的粒徑和電位。光鏡下觀察其形態(tài)并采用加熱板促使其相變，檢測(cè)相變溫度。

1.2.3 包封率和體外藥物釋放 將不同質(zhì)量配比的DOX和磷脂溶液以紫外分光光度計(jì)測(cè)量其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算包封率：藥物包封率=(Lip-PFH-DOX納米粒中包封的DOX質(zhì)量/Lip-PFH-DOX納米粒中加入DOX的總量)×100%。取適量載DOX脂質(zhì)體置于透析袋中，并隨機(jī)分為L(zhǎng)ip-PFH-DOX組和Lip-PFH-DOX+LIFU組，分別取100 ml葡萄糖溶液為透析外液，Lip-PFH-DOX+LIFU組給予超聲輻照(功率1 W/cm2，頻率1 MHz，占空比50%，時(shí)間30 s)。分別于5 h、24 h、48 h、72 h取2 ml透析外液，通過高效液相色譜法測(cè)定藥物在不同時(shí)間點(diǎn)的釋放率。

1.2.4 細(xì)胞毒性及增殖實(shí)驗(yàn) 體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板。隨機(jī)分為L(zhǎng)ip-PFH組、Lip-PFH-DOX組，每組5個(gè)孔。次日加入不同濃度(1、5、25、50、100 μg/ml)納米粒，分別培養(yǎng)24 h和48 h。PBS沖洗96孔板3次后，加入CCK-8試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后于酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

表1 2組不同時(shí)間DOX的釋放率(±s)

表1 2組不同時(shí)間DOX的釋放率(±s)

組別5 h24 h48 h72 hLip-PFH-DOX+LIFU組14.51±1.2329.43±2.4452.71±4.2352.74±4.03Lip-PFH-DOX組8.12±0.7420.41±1.6540.05±3.2241.71±3.36t值-12.04-5.74-4.33-5.34P值<0.01<0.010.010.06

圖1 Lip-PFH-DOX納米粒表征 A.透射電鏡下觀察; B.粒徑分布圖; C.電位分布圖

1.2.5 細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105/孔接種于6孔板孵育，隨機(jī)分為L(zhǎng)ip-PFH組、Lip-PFH-DOX組，并加入200 μl(濃度0.01 mg/ml)納米粒。分別于孵育24 h和48 h后，PBS洗去未連接納米粒，胰酶消化細(xì)胞后使用Annexin-V/PI凋亡試劑盒進(jìn)行染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 體內(nèi)外增強(qiáng)超聲顯像 稱取一定量瓊脂，加入適量脫氣水，微波爐加熱，攪拌至氣泡消失，將EP管底部插入凝膠并固定，待其冷卻凝固后取出制得帶孔的凝膠模型。向凝膠孔內(nèi)加入200 μl(濃度0.01 mg/ml)Lip-PFH-DOX納米粒，采用不同能量的LIFU(3、5、10 W)輻照10 min(工作5 s，間停 5 s)；采集輻照后聲像圖。建立裸鼠人乳腺癌MDA-MB-231模型，經(jīng)裸鼠尾靜脈注射適量納米粒，采用不同能量的LIFU(3、5、10 W)輻照10 min(工作5 s，間停5 s)腫瘤部位使納米粒發(fā)生相變，觀察腫瘤部位增強(qiáng)超聲表現(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，藥物釋放率的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lip-PFH-DOX納米粒的制備及表征 Lip-PFH-DOX納米粒呈紅色懸濁液，分散性好，在透射電鏡下觀察大小均一，殼層可見黑色顆粒分布(圖1A)。Lip-PFH-DOX納米粒的粒徑(340.81±68.54)nm(圖1B)，電位(-17.72±7.66)mV(圖1C)。

2.2 包封率和體外藥物釋放 當(dāng)DOX和磷脂質(zhì)量比例為1:10時(shí)，DOX的包封率最大(86.80±2.55)%。Lip-PFH-DOX納米粒在超聲輻照下，可發(fā)生液氣相變，并破裂。Lip-PFH-DOX組在48 h時(shí)DOX釋放達(dá)高峰。與Lip-PFH-DOX組相比，Lip-PFH-DOX+LIFU組藥物釋放率明顯增高(表1)。

2.3 細(xì)胞毒性及增殖實(shí)驗(yàn) 當(dāng)Lip-PFH納米粒的最大濃度達(dá)100 μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率仍可達(dá)95.18%。當(dāng)與不同濃度的Lip-PFH-DOX納米粒細(xì)胞孵育24 h，細(xì)胞存活率逐漸下降；孵育48 h，當(dāng)濃度為100 μg/ml時(shí)，存活率降低至45.00%(表2)。

表2 2組不同濃度納米粒孵育24 h和48 h的細(xì)胞存活率(%)

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) Lip-PFH組在孵育24 h和48 h后，細(xì)胞凋亡數(shù)量極少，Lip-PFH-DOX組在孵育48 h時(shí)細(xì)胞發(fā)生大量凋亡(圖2)。

2.5 體內(nèi)外增強(qiáng)超聲顯像 超聲輻照功率為3 W時(shí)，輻照10 min時(shí)Lip-PFH-DOX未發(fā)生變化；5 W時(shí)，有微弱信號(hào)產(chǎn)生；10 W時(shí)，大量納米粒發(fā)生相變，產(chǎn)生明顯的超聲信號(hào)(圖3)。在體內(nèi)也驗(yàn)證了這一結(jié)果。相同條件下，通過裸鼠尾靜脈注射該納米粒后，在腫瘤上方采用超聲刺激，同時(shí)觀察腫瘤內(nèi)部超聲信號(hào)的變化(圖4)。結(jié)果表明，注射進(jìn)入體內(nèi)的納米粒在EPR作用下聚集于腫瘤區(qū)域，通過超聲輻照，瘤內(nèi)超聲信號(hào)可明顯增強(qiáng)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組細(xì)胞凋亡情況 A.Lip-PFH組孵育24 h; B.Lip-PFH組孵育48 h; C.Lip-PFH-DOX組孵育24 h; D. Lip-PFH-DOX組孵育48 h

3 討論

研究[13]發(fā)現(xiàn)，制備所得Lip-PFH納米粒粒徑小，可穿過腫瘤血管內(nèi)皮間隙靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞，一定條件下發(fā)生相變形成微泡，既可提高超聲分子成像質(zhì)量，又能定位釋放藥物進(jìn)行靶向治療。PFH納米粒生物相容性好，在體內(nèi)通過肺部呼吸的方式清除。因此，液氣相變PFH納米粒能較好地解決微泡粒徑與增強(qiáng)超聲成像之間的矛盾，有望成為一種理想的新型超聲分子探針[14-15]。為實(shí)現(xiàn)理想超聲分子成像與靶向治療，除研制新型超聲分子探針外，還需結(jié)合超聲分子成像設(shè)備、超聲微泡觸發(fā)裝置以及后處理技術(shù)[16]。

本研究采用已成熟掌握的薄膜水化法和聲振法制備的Lip-PFH-DOX納米粒大小均一，分散性好[17-18]；在透射電鏡下納米粒表面有細(xì)小顆粒，提示DOX可被成功包裹；采用不同配比的藥脂比獲得DOX的最大包封率(86.80±2.55)%，提示DOX可被大量包裹進(jìn)入脂質(zhì)體，為靶向腫瘤藥物治療提供了基礎(chǔ)，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，DOX的釋放量逐漸增加，在48 h后達(dá)到最高值，并穩(wěn)定釋放，可促進(jìn)DOX的治療效果。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)[19]和流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lip-PFH-DOX納米粒對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，證實(shí)脂質(zhì)體的包裹不僅對(duì)DOX的細(xì)胞毒性作用無影響，還可緩慢釋放殺傷腫瘤細(xì)胞。超聲監(jiān)測(cè)對(duì)藥物的治療作用至關(guān)重要，包裹PFH的納米粒可在超聲激發(fā)下發(fā)生相變，促進(jìn)藥物靶向釋放，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)納米粒在腫瘤的聚集情況。

本研究體外、體內(nèi)超聲成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射Lip-PFH-DOX納米粒后，在裸鼠腫瘤部位具有更明顯的顯影效果，證實(shí)該超聲造影劑具有一定的超聲成像的功能和在腫瘤組織中積累的效應(yīng)，提示其在腫瘤的早期診斷與治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值，并證實(shí)包裹DOX和PFH的脂質(zhì)體在超聲實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)藥物聚集情況的同時(shí)可定點(diǎn)釋放藥物，減少藥物對(duì)正常器官的毒副作用，為乳腺癌的體內(nèi)治療奠定基礎(chǔ)，有望成為一種新型的診療一體化分子探針。

圖3 Lip-PFH-DOX納米粒體外增強(qiáng)超聲顯影 A.輻照功率3 W，輻照時(shí)間10 min； B.輻照功率5 W，輻照時(shí)間10 min； C.輻照功率10 W，輻照時(shí)間10 min

圖4 Lip-PFH-DOX納米粒體內(nèi)增強(qiáng)超聲顯影 A.注射納米粒前聲像圖； B.輻照功率3 W，輻照時(shí)間10 min； C.輻照功率5 W，輻照時(shí)間10 min； D.輻照功率10 W，輻照時(shí)間10 min

總之，本研究成功制備了包裹DOX和PFH納米粒，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外超聲顯影，同時(shí)該納米?？蓪?duì)MAD-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。