豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白E0抗體間接ELISA檢測方法的建立及優(yōu)化

郭東光，陳明艷，朱艷平，李 鵬，岳 鋒，崔芳微,2，李文明,2，王金海，王選年

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種豬重要急性、烈性傳染病，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》中將其列為5種優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一[1-5]。疫苗免疫是目前預(yù)防和控制CSF發(fā)生和流行的重要手段[6-8]。

目前，常用的CSF疫苗主要有2種，一種是改良的活疫苗，其安全、有效，但不能從被免疫動(dòng)物中區(qū)分野毒感染動(dòng)物(Differentiation of infected from vaccinated animals，DIVA)[9]。另一種是E2亞單位疫苗，其能夠辨別野毒感染，但免疫接種后不能快速啟動(dòng)免疫反應(yīng)或不能通過胎盤傳遞給子代[10]。雖然標(biāo)記疫苗能夠區(qū)分DIVA，前提是要有準(zhǔn)確、有效的配套辨別檢測方法。由于CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E2是制備CSF標(biāo)記疫苗的主要靶標(biāo)蛋白。因此，最好的策略是對(duì)感染豬E0特異性抗體的鑒別[11]。

E0蛋白是CSFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有重要的血清學(xué)鑒別功能，能夠有效區(qū)分瘟病毒屬中的CSFV、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和邊界病病毒(Border disease virus,BDV)抗體，也是與CSF標(biāo)記疫苗配套使用的重要檢測蛋白[12-15]。相比傳統(tǒng)的血清中和試驗(yàn)，ELISA檢測技術(shù)更為方便可行，為臨床上CSFV血清抗體監(jiān)測提供了一種切實(shí)、可靠的檢測工具[16-17]。鑒于此，通過原核表達(dá)純化的E0重組蛋白，建立CSFV血清抗體的間接ELISA(E0-ELISA)檢測方法，一方面為臨床上CSFV血清抗體的篩查提供一種經(jīng)濟(jì)、方便的檢測手段，另一方面也為在CSFV感染后早期血清分析和后期的DIVA配套試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要材料 大腸埃希菌(E.coli)DH5α工程菌、Rostta(DE3)工程菌、質(zhì)粒pGEX-CSFV全長質(zhì)粒、原核表達(dá)載體pGEX-4T-2、豬瘟兔化陽性高免血清、CSFV抗體陽性血清140份、CSFV抗體陰性血清60份及豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV) 、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)抗體陽性血清若干份均由新鄉(xiāng)學(xué)院生物技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；普通TaqDNA 聚合酶，為北京鼎國公司產(chǎn)品；抗GST標(biāo)簽單克隆抗體為北京中杉金橋生物公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗均購于索萊寶公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗，北京博士德生物公司產(chǎn)品；脫脂奶粉購自美國Amresco 公司；酶標(biāo)板購自美國Thermo公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；CSFV抗體檢測試劑盒、PRV抗體檢測試劑盒、PRRSV抗體檢測試劑盒均為美國IDEXX公司產(chǎn)品；PCV抗體檢測試劑盒為武漢前科動(dòng)物生物制品有限公司產(chǎn)品；PPV抗體檢測試劑盒為深圳綠詩源生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定 將pGEX-4T-2-E0陽性克隆子轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)大腸桿菌并加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng) SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá)情況后，使用切膠回收方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。然后應(yīng)用豬瘟兔化陽性高免血清及抗GST標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行Western blot分析，鑒定重組蛋白的生物學(xué)活性。

1.2.2 抗原最佳包被質(zhì)量濃度和血清最適稀釋度的確定 通過方陣滴定法測定抗原最適包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋度，將E0蛋白分別按照0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL的質(zhì)量濃度包被96孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜，PBST洗滌3次；用含5%脫脂奶粉的PBST每孔200 μL，37 ℃封閉2 h，PBST洗滌3次；再分別加入CSFV抗體陽性血清和陰性血清，每孔50 μL，以第1孔1∶25依次作倍比稀釋，37 ℃作用30 min，PBST洗滌3次；然后每孔加入50 μL 1∶10 000稀釋羊抗豬二抗稀釋液， 37 ℃作用30 min；每孔加入80 μL底物顯色10 min后，每孔加入100 μL 2 mol/L硫酸進(jìn)行終止；最后在450 nm下測量各孔的OD值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)OD值接近1，且測量值/陰性值(P/N)>2.1時(shí)，即為抗原最佳包被質(zhì)量濃度和最適血清稀釋度。

1.2.3 間接ELISA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化 在上述條件的基礎(chǔ)上，又通過對(duì)抗原最佳包被時(shí)間(4 ℃過夜、37 ℃ 2 h、37 ℃ 3 h和37 ℃ 4 h)、封閉液的種類及用量(5%脫脂奶粉溶液、0.5% BSA、1% BSA和2% FBS)、封閉液作用時(shí)間(4 ℃ 過夜，37 ℃ 1、2、3、4 h)、血清最適作用時(shí)間(37 ℃下反應(yīng) 30、60、90、120 min)、二抗最佳稀釋比例(1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000、1∶20 000)和最適二抗孵育時(shí)間(37 ℃作用15 min、30 min、1 h、2 h)進(jìn)行優(yōu)化，450 nm下測量各組各孔的OD值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)P/N最大時(shí)，所對(duì)應(yīng)的條件即為最佳作用條件。

1.2.5 特異性分析 用上述已優(yōu)化方法檢測PCV、PPV、PRRSV、PRV豬陽性血清抗體樣品，以CSFV陽性血清和陰性血清為對(duì)照，檢測該方法的特異性。

1.2.6 敏感性分析 將CSFV抗體陽性血清進(jìn)行1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280稀釋，根據(jù)ELISA臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷該方法的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別用同一批制備(批內(nèi))的重組E0蛋白包被的96孔酶標(biāo)板和不同批次制備(批間)的重組E0蛋白包被的96孔酶標(biāo)板，分別將7份CSFV抗體陽性血清和3份陰性血清按已優(yōu)化方法分別重復(fù)檢測6次，進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，確定建立檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.8 符合率檢測 隨機(jī)選取用IDEXX CSF抗體檢測試劑盒檢測的200份豬血清樣品，再用建立的檢測方法檢測， 450 nm下測量OD值，根據(jù)臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，比較兩者的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白E0表達(dá)的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定

SDS-PAGE分析結(jié)果表明，pGEX-4T-2-E0陽性克隆子經(jīng)0.1～1.0 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)后，均在預(yù)期位置46.0 ku處出現(xiàn)了目的條帶，且IPTG濃度在1.0 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高(圖1)。Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白E0不僅與抗GST標(biāo)簽單克隆抗體反應(yīng)，而且還與豬瘟兔化陽性高免血清反應(yīng)，在46.0 ku左右也出現(xiàn)了特異性目的條帶(圖2)。以上結(jié)果表明，融合蛋白被正確表達(dá)且具有良好的生物學(xué)活性，純化后的 E0重組蛋白可以作為ELISA檢測方法的包被抗原。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1—6：IPTG濃度分別為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L； 7.未誘導(dǎo)對(duì)照； 8.pGEX-4T-2(DE3)空載體M.Protein molecular weight; 1—6.The dose of 1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mmoL/L of IPTG; 7.Uninduced control; 8.pGEX-4T-2(DE3) control圖1 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析結(jié)果 Fig.1 SDS-PAGE analysis results of recombinant protein expression

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.未誘導(dǎo)對(duì)照； 2.重組蛋白E0與豬瘟兔化陽性高免血清反應(yīng)； 3.重組蛋白E0與抗GST標(biāo)簽單克隆抗體反應(yīng)； 4.pGEX-4T-2(DE3)空載體M.Protein molecular weight; 1.Uninduced control; 2.Results of E0 recombinant protein with rabbit serum that anti CSFV; 3.Results of E0 recombinant protein with anti GST mAb; 4.pGEX-4T-2(DE3) control圖2 重組蛋白E0的Western blot 鑒定結(jié)果 Fig.2 Western blot identification results of E0 recombinant protein

2.2 抗原最適包被質(zhì)量濃度和待檢血清最適稀釋度

由表1可知，根據(jù)方陣滴度法判斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)OD值接近1，且P/N>2.1時(shí)，即為抗原最適包被質(zhì)量濃度和血清最適稀釋度。結(jié)果顯示，抗原最適包被質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL，待檢血清最適稀釋度為 1∶100。

表1 抗原最適包被質(zhì)量濃度和血清最適稀釋度測定結(jié)果Tab.1 The results of optimal antigen coating mass concentration and serum optimal dilution

2.3 E0-ELISA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，E0-ELISA最佳反應(yīng)條件分別為：抗原在37 ℃條件下包被1 h時(shí)，其P/N值最大，為4.230；使用5%脫脂奶粉溶液在 37 ℃條件下封閉 2 h時(shí)，P/N 值最大，為3.765；重組蛋白E0在37 ℃條件下封閉3 h時(shí)，P/N 值最大，為3.833；陽性血清在37 ℃條件下作用60 min時(shí)，P/N 值最大，為4.278；二抗在1∶5 000稀釋時(shí)，孵育時(shí)間45 min，P/N值達(dá)到最大。

2.4 E0-ELISA陰性臨界值

由表2可知，用E0-ELISA共檢測60份CSFV陰性血清，其陰性血清OD450平均值為0.313，標(biāo)準(zhǔn)差為0.019，根據(jù)公式:陰性臨界值=OD450+3SD，確定其陰性血清臨界值為0.370，當(dāng)樣本OD450<0.370時(shí),判斷為陰性，反之則判斷為陽性。

2.5 E0-ELISA的特異性分析

由表3可知，用E0-ELISA分別檢測PRV、PRRSV、PCV、PPV的豬陽性血清20份，且每份重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)立CSFV陽性和陰性對(duì)照，結(jié)果顯示，OD450均小于臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)0.370，全部判斷為陰性結(jié)果，說明該檢測方法具有良好的特異性。

表2 E0-ELISA陰性臨界值的測定結(jié)果Tab.2 The results of threshold for the E0-ELISA

2.6 E0-ELISA的敏感性分析

由圖3可知，用E0-ELISA對(duì)2倍倍比稀釋后的CSFV陽性抗體血清進(jìn)行檢測，當(dāng)血清稀釋至1∶640時(shí)，OD450仍大于所設(shè)定的臨界值判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果判斷為陽性，表明該方法敏感性良好。

表3 E0-ELISA的特異性分析結(jié)果Tab.3 Specificity analysis results for the E0-ELISA

圖3 E0-ELISA的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results for the E0-ELISA

2.7 E0-ELISA穩(wěn)定性分析

由表4可知，用同一批(批內(nèi))制備的重組蛋白E0包被的 96 孔酶標(biāo)板和不同批次(批間)制備的重組蛋白E0包被的 96 孔酶標(biāo)板，分別對(duì)7份陽性CSFV血清樣品和3份陰性血清樣品進(jìn)行檢測，得到批內(nèi)變異系數(shù)為1.99%～7.69%，批間變異系數(shù)為2.16%～9.23%，兩者均小于10%，說明該檢測方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表4 E0-ELISA 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Repeatability assay results for the E0-ELISA

2.8 E0-ELISA符合率分析

由表5可知，經(jīng)對(duì)200份豬血清樣品進(jìn)行檢測，IDEXX試劑盒共檢出140份CSFV血清陽性樣品和60份陰性樣品。E0-ELISA共檢測出150份CSFV血清陽性樣品和50份陰性樣品，其中在150份陽性樣品中有13份樣品IDEXX試劑盒檢測為陰性，在50份CSFV血清陰性樣品中有3份IDEXX試劑盒檢測為陽性。經(jīng)計(jì)算，與IDEXX CSFV血清抗體試劑盒相比，E0-ELISA檢測方法的的符合率為92.00%，敏感性為97.86%，特異性為78.33%。

表5 E0-ELISA符合率檢測結(jié)果Tab.5 The results of coincidence rate for the E0-ELISA

3 結(jié)論與討論

CSF標(biāo)記疫苗的應(yīng)用為CSF凈化提供了重要手段，前提條件是要具備配套的鑒別診斷方法，由于E2結(jié)構(gòu)蛋白是設(shè)計(jì)CSF標(biāo)記疫苗的首選蛋白，為此，臨床上對(duì)E0特異性抗體的檢測成為有效辨別CSFV野毒感染的重要檢測靶標(biāo)[11]。本研究以大腸桿菌中表達(dá)的CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E0為包被原，建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA檢測方法，經(jīng)鑒定該方法具有較高的敏感性，達(dá)到97.86%。PANNHORST等[18]設(shè)計(jì)并評(píng)價(jià)了2種使用細(xì)菌表達(dá)E0重組蛋白的間接ELISA(一種用于篩選，另一種用于確認(rèn))，2種ELISA都在感染后10 d內(nèi)檢測出不同毒株和基因型的CSFV特異性抗體，其能夠有效區(qū)分CSFV感染豬和CP7_E2alf疫苗免疫豬，其敏感性和特異性為95%。MEYER等[11]建立了檢測E0特異性抗體的雙抗原夾心ELISA，也可有效識(shí)別不同基因型CSFV E0特異性抗體，其敏感性僅為90.2%，特異性為93.8%。相比之下，在敏感性方面該方法要明顯優(yōu)于前人所建立的類似檢測方法。袁莉等[19]以E0蛋白為包被源也建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA檢測方法，結(jié)果表明,當(dāng)CSFV陽性血清稀釋至1∶640時(shí)，其結(jié)果判斷為陰性，而該方法當(dāng)血清稀釋至1∶1 280時(shí)結(jié)果判斷為陰性，說明本檢測方法的敏感性更高。從結(jié)果來看，雖然本檢測方法的特異性較低，這可能與本研究使用的臨床樣本較少相關(guān)，特別是陰性血清樣本較少，僅有60份。

CSF標(biāo)記疫苗是實(shí)施CSF凈化的重要手段。為進(jìn)一步證實(shí)該方法的可靠性，本研究對(duì)200份豬血清樣品的檢測結(jié)果表明，與IDEXX試劑盒的符合率達(dá)到92.00%。吳素麗等[20]以原核表達(dá)的E0蛋白為基礎(chǔ)建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA檢測方法，與IDEXX試劑盒相比，其符合率僅為83%。李鵬等[21]也以原核表達(dá)的E0蛋白為基礎(chǔ)建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA檢測方法，其總體符合率僅為89%。藺輝星等[22]以原核表達(dá)的E2蛋白建立了檢測CSFV血清抗體的間接ELISA檢測方法，其敏感性、特異性和符合率分別為 89.07%、77.59% 和 84.65%。與以上研究相比，本研究建立的檢測方法的準(zhǔn)確性和可靠性均明顯提升。

綜上所述，本研究成功建立一種經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、特異性好和敏感性高的CSFV血清抗體間接ELISA檢測方法，臨床上為CSFV抗體的監(jiān)測提供了一種經(jīng)濟(jì)、有效的檢測手段。本研究建立的檢測CSFV結(jié)構(gòu)蛋白E0抗體的ELISA檢測方法可以作為未來鑒別感染和免疫的候選方案，為未來我國實(shí)現(xiàn)CSF的凈化提供技術(shù)支持。