降酸酵母結(jié)合乳酸菌對(duì)‘黑虎香’葡萄酒酸度的影響

鐘映雪，張曉芳，楊瑞群，陶芳，南立軍,2*，李雅善,2*（

1. 楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南楚雄 675000；2. 云南省高校葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，云南楚雄 675000）

黑虎香（Fox）是美洲葡萄和夏葡萄的雜交品種，果穗長(zhǎng)，圓錐形，皮厚而多肉，青黑色，色澤鮮艷，酸甜可口，可溶性固形物含量可達(dá)17%以上，耐貯運(yùn)[1]。在云南楚雄表現(xiàn)為粒大、有籽、糖高、酸高，多用作鮮食，只有少部分用于釀酒。

由于生態(tài)條件、品種特性及栽培方式等差異，造成葡萄原料酸度過(guò)高，釀出的葡萄酒品質(zhì)不佳，所以需要降酸，來(lái)協(xié)調(diào)其口感。目前，葡萄酒降酸的主要方法有化學(xué)降酸法、物理降酸法、微生物降酸法[2]，以及與低酸葡萄汁混合來(lái)平衡酸度。以前葡萄酒生產(chǎn)中普遍采用物理降酸法和化學(xué)降酸法，只能作用于酒石酸而不能對(duì)生理代謝較為活躍的蘋果酸起作用，對(duì)酒的負(fù)面影響較大，而且常引起葡萄酒的瓶?jī)?nèi)發(fā)酵[3]。生物降酸法主要是利用乳酸菌將蘋果酸降解為乳酸，而導(dǎo)致酸降低的主要微生物是明串珠菌、乳酸桿菌、葡萄球菌和酵母菌[4-5]。有大量研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母共有18屬70余種。其中一些酵母菌株具有降解蘋果酸的能力。新西蘭由于氣候相對(duì)冷涼，葡萄含酸量較高，廣泛采用酵母菌株Lalvin-D432和Lalvin-71B降酸[6]。本試驗(yàn)采用降酸酵母和乳酸菌降低‘黑虎香’葡萄酒中的酸度，進(jìn)而改進(jìn)‘黑虎香’葡萄酒的口感。

目前，大多數(shù)紅葡萄酒都使用蘋果酸-乳酸發(fā)酵降酸，耗時(shí)較長(zhǎng)；另一種途徑是利用粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）降酸。在蘋果酸-酒精發(fā)酵（MAF）中將蘋果酸分解為乙醇和CO2，從而達(dá)到降酸的目的。該方法能保持酒的清爽感與口感，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵和降酸同步進(jìn)行[3]。

1 材料與方法

1.1 原料與輔料

1.1.1 原料

‘黑虎香’葡萄于2019年4月5日購(gòu)于楚雄市東興農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，顆粒飽滿、色深、皮厚、無(wú)核，可用來(lái)釀酒。

1.1.2 輔料

帝伯仕（Diboshi）降酸酵母，帝伯仕乳酸菌（FML EXPERTISE S），來(lái)自法國(guó)。安琪酵母，安琪酵母股份有限公司提供。果膠酶，來(lái)自南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與試劑

電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。UV-5500紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。PB-10酸度計(jì)。HWS26電熱恒溫水浴鍋。TG328A分析天平，上海精科儀器廠。

1.3 方法

為了在正常發(fā)酵條件下研究降酸酵母在‘黑虎香’葡萄酒中的降酸作用，每一罐樣品中加入200 mg/L安琪酵母，同時(shí)使用4組不同濃度的帝伯仕降酸酵母啟動(dòng)酒精發(fā)酵，并分別命名為罐1、罐2、罐3和罐4。酒精發(fā)酵過(guò)程中每天測(cè)定還原糖、總酸、pH、可溶性固形物、色度、單寧含量，酒精發(fā)酵結(jié)束后分析降酸酵母對(duì)‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及對(duì)上述基本指標(biāo)的影響，結(jié)合降酸效果及各項(xiàng)指標(biāo)含量，選擇出最佳降酸酵母用量的一組，并將本組繼續(xù)進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵試驗(yàn)。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，將4組不同濃度（0、5 mg/L、10 mg/L和15 mg/L）的帝伯仕乳酸菌添加進(jìn)上述選出的‘黑虎香’葡萄酒中，啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵，每隔5 d測(cè)一次總酸、色度、pH，研究乳酸菌對(duì)‘黑虎香’葡萄酒的降酸效果及對(duì)pH、色度的影響，選出最佳乳酸菌添加量。

1.3.1 基本指標(biāo)的測(cè)定方法

糖、酸和揮發(fā)酸依據(jù)GB/T 15038—2006總糖、總酸和揮發(fā)酸的測(cè)定方法[7]；密度瓶法測(cè)酒度[8]；分光光度計(jì)法測(cè)色度[9]；高錳酸鉀滴定法測(cè)單寧[10]；pH示差法測(cè)花色苷[11]；折光儀法測(cè)可溶性固形物[12]。

1.3.2 工藝流程關(guān)鍵控制點(diǎn)用恒溫水浴鍋將溫度控制在20～22 ℃。為了防止發(fā)酵過(guò)快，導(dǎo)致降酸酵母作用效果不明顯的現(xiàn)象發(fā)生，將溫度盡量控制的較低。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料基本指標(biāo)值

原料各項(xiàng)基本指標(biāo)含量如表1。此批‘黑虎香’葡萄原料糖度較低而總酸較高，用來(lái)研究微生物降酸效果可極大的提高試驗(yàn)顯著性，原料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)良好，pH正常，花色苷、色度、單寧和可溶性固形物含量均較好。

表1 原料基本指標(biāo)數(shù)值Table 1 Value of basic indicators of raw materials

2.2 酒精發(fā)酵期間溫度和比重的變化

2.2.1 罐1

4月5日，原料入罐。第2天下午開始發(fā)酵，葡萄醪上浮并伴有大量起泡產(chǎn)生，果香濃郁。第3天，進(jìn)入發(fā)酵旺盛期，能略微聞到酒香，但果香占主導(dǎo)，底部出現(xiàn)白色酒石沉淀。第4天，酒香越發(fā)濃郁，果香略微減弱，白色酒石沉淀增多。至第6天，發(fā)酵開始減弱，底部白色酒石以及其他沉淀增多。至第7天，發(fā)酵幾近終止。之后，開始皮渣分離。

罐1使用的是200 mg/L安琪酵母（不加降酸酵母），其發(fā)酵特性是對(duì)酒精發(fā)酵的啟動(dòng)最慢，直至4月6日下午，酒精發(fā)酵速度才加速，一直持續(xù)到4月9日，開始減慢，直至發(fā)酵終止。發(fā)酵期間溫度起著重要作用，4月5～6日溫度快速上升，之后下降；4月8日降到最低點(diǎn)，然后又快速上升；4月10日上升到最高，然后緩慢下降；到4月12日又開始上升。整個(gè)發(fā)酵期間，溫度變化范圍始終保持在20～22 ℃（圖1）。

圖1 罐1的發(fā)酵曲線Figure 1 Fermentation curve of tank 1

2.2.2 罐2

4月5日，原料入罐。第2天，有少許小氣泡產(chǎn)生，果香濃郁，溫度上升。4月7～8日，發(fā)酵旺盛，葡萄醪上浮，伴有大量氣泡產(chǎn)生，酒香出現(xiàn)，但果香占主導(dǎo)，比重明顯降低，底部出現(xiàn)白色酒石沉淀。之后，發(fā)酵減弱，酒香濃郁，底部白色酒石及其它沉淀增多，比重降低緩慢至趨于平緩。4月12日，酒精發(fā)酵基本結(jié)束，氣泡微弱，葡萄醪香氣幾近散失，比重維持不變。皮渣分離。

如圖2所示，酒精發(fā)酵啟動(dòng)后，發(fā)酵基質(zhì)溫度明顯上升。之后通過(guò)水浴鍋恒溫控制溫度，才使溫度逐漸趨于平衡，酒精發(fā)酵平穩(wěn)進(jìn)行；葡萄汁比重開始下降，其下降速度先慢后快再變慢，4月6日開始快速下降，4月8日減慢，4月9日發(fā)酵速度幾乎停滯，反映出酒精發(fā)酵速度趨勢(shì)。與此同時(shí)，溫度在4月6日上升到最高，然后下降，在4月8日降到最低點(diǎn)，又逐漸上升至最高，保持3 d，進(jìn)行輕微的波動(dòng)。

圖2 罐2的發(fā)酵曲線Figure 2 Fermentation curve of tank 2

2.2.3 罐3

4月5日，原料入罐。第2天，開始發(fā)酵，葡萄醪上浮并伴有少量氣泡產(chǎn)生，果香濃郁。第3天，發(fā)酵旺盛，略微聞到酒香，但果香占主導(dǎo)，底部出現(xiàn)白色酒石沉淀。第4天，酒香突出，果香開始減弱，白色酒石沉淀增多。至4月11日，發(fā)酵減弱，酒香濃郁，皮渣上浮十分緩慢。4月12日，酒精發(fā)酵結(jié)束，氣泡微弱。皮渣分離。

如圖3所示，4月5日原料入罐后，從6日開始比重下降速度增快（比2號(hào)罐快）；至4月7日，發(fā)酵速度開始減慢，4月9日發(fā)酵速度極慢，并于4月11日后趨于平緩，下降速度很快趨近于0。溫度的波動(dòng)趨勢(shì)與圖2相似。

2.2.4 罐4

4月5日，原料入罐。第2天發(fā)酵啟動(dòng)，葡萄醪上浮并伴有少量起泡產(chǎn)生，果香濃郁。

第4天，發(fā)酵進(jìn)入旺盛期，酒香逐漸濃郁，果香略微減弱，白色酒石沉淀增多。至4月10日，發(fā)酵開始減弱，酒香濃郁，底部白色酒石及其它沉淀增多。在4月12日時(shí)，氣泡微弱，葡萄醪香氣幾近散失。之后開始皮渣分離。

在4個(gè)處理罐中，罐4最先啟動(dòng)酒精發(fā)酵。因此，在發(fā)酵前期，發(fā)酵速度極快，4月6～8日為快速發(fā)酵期，之后迅速減慢，4月10日發(fā)酵速度幾乎為0，逐漸趨于平緩；當(dāng)比重不再發(fā)生變化時(shí)，開始皮渣分離（圖4）。總體上，罐4溫度的變化趨勢(shì)與上述幾罐相似，不同的是罐4的發(fā)酵溫度在4月9日是所有處理中最高的，達(dá)到了23 ℃。但到發(fā)酵后期，發(fā)酵基質(zhì)溫度降低，此時(shí)無(wú)需再頻繁降溫。

圖3 罐3的發(fā)酵曲線Figure 3 Fermentation curve of tank 3

圖4 罐4的發(fā)酵曲線Figure 4 Fermentation curve of tank 4

2.3 酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化

2.3.1 罐1

罐1前期啟動(dòng)發(fā)酵最慢。如表2至表5所示，罐1酸度最高?！诨⑾恪咸丫浦锌偹嵩诰凭l(fā)酵第3天達(dá)到最大值，此后則緩緩降低，而還原糖前3天下降速度較慢，之后開始快速下降，相應(yīng)可溶性固形物下降也較為規(guī)律，色度先升高后降低，但是在4組對(duì)比試驗(yàn)中，罐1色度保留最完整，單寧含量先降低后升高再降低，后趨于平衡，最終罐1和罐2單寧含量最高。pH值在發(fā)酵過(guò)程中較為穩(wěn)定。

2.3.2 罐2

罐2酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化情況如表3所示，在發(fā)酵過(guò)程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸呈先升高后降低的趨勢(shì)。酒精發(fā)酵第4天，酸度開始逐漸降低，發(fā)酵第7天下降速度趨于0。因此，酵母的降酸效果較為明顯。從表3中可看出，‘黑虎香’葡萄酒前期發(fā)酵速度較快，還原糖下降極快，但是發(fā)酵過(guò)程中pH較為穩(wěn)定，可溶性固形物含量逐漸降低，總酸、色度不斷上升，并在發(fā)酵第3天達(dá)到最大值，而后呈下降趨勢(shì)。單寧含量先降低，而后在第3天達(dá)到最大值，此后則不斷下降，直至發(fā)酵后期趨于平衡。

2.3.3 罐3

罐3酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化情況如表4所示，添加200 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸，在發(fā)酵第3天達(dá)到最大值10.78 g/L，此后酸度開始下降，且下降效果明顯。發(fā)酵過(guò)程中，還原糖、可溶性固形物逐漸降低，并且都是前期下降效果明顯，后期趨于平緩，pH值在4組對(duì)比試驗(yàn)中最為穩(wěn)定，色度、單寧呈先上升后下降的趨勢(shì)，并在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定?；ㄉ剀?、單寧含量越高，葡萄酒顏色越深，色度值也越高。

2.3.4 罐4

罐4酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化情況如表5所示，酒精發(fā)酵過(guò)程中，色度與總酸在第3天達(dá)到最大值，此時(shí)葡萄酒的顏色最深。此后開始下降?？偹嵩诘?天下降幅度最大，后期下降較為平緩。還原糖和可溶性固形物前4天下降速度非常迅速，分別降低到了8.00 g/L和8.4%，之后逐漸降低，而pH在整個(gè)試驗(yàn)期間較為穩(wěn)定。單寧含量在入罐第2天下降，第3天則上升，第4天達(dá)到最大值，之后則緩緩下降，發(fā)酵后期則趨于平衡。

2.4 酒精發(fā)酵結(jié)束后基本指標(biāo)的變化

酒精發(fā)酵結(jié)束后，殘?zhí)呛孔畹偷氖枪?，為3 g/L；總酸含量最低的是罐2和罐3，為7.69 g/L；酒精度最高的是罐3，為7.78% vol；花色苷濃度最高的是罐3，為263.3 g/L；可溶性固形物含量最高的為罐1和罐3，均為6.4%；單寧含量最高為罐1和罐2，為0.75 g/L，罐3的單寧含量為0.58 g/L；色度值最大的是罐1，為25.16，其次是罐2，為24.3；揮發(fā)酸均保持在較低水平；pH值均在正常范圍，故選用200 mg/L降酸酵母發(fā)酵而成的葡萄酒（罐3）進(jìn)行接下來(lái)的乳酸菌降酸試驗(yàn)。

2.5 蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化

2.5.1 pH

采用上述200 mg/L降酸酵母發(fā)酵而成的葡萄酒加入帝伯仕乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵。圖5所示，蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間4組的pH值均穩(wěn)定在3.28～3.42。其中，添加了10 mg/L乳酸菌的一組比其它3組更穩(wěn)定，即添加了10 mg/L乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的‘黑虎香’葡萄酒穩(wěn)定性優(yōu)于添加了5 mg/L和15 mg/L的兩組，也優(yōu)于不添加乳酸菌的對(duì)照組。添加5 mg/L乳酸菌的酒樣變化最明顯，變化幅度最大，最不穩(wěn)定。

表2 罐1酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化Table 2 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 1

表3 罐2酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化Table 3 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 2

表4 罐3酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化Table 4 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 3

表5 罐4酒精發(fā)酵期間基本指標(biāo)的變化Table 5 Change of basic indexes during the alcoholic fermentation in tank 4

2.5.2 總酸

蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間總酸的變化情況如表6所示，不添加乳酸菌的處理酸度值發(fā)生了略微變化，而進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵的其他3個(gè)處理，酸度發(fā)生了較大變化。表6顯示，5 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.34 g/L，10 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.83 g/L，15 mg/L乳酸菌處理30 d后酸度降低0.68 g/L。綜上所述，乳酸菌降酸效果最好的為添加10 mg/L乳酸菌處理。

2.5.3 色度

如表7所示，至發(fā)酵第30天，不添加乳酸菌的處理色度最高，為9.94，但是下降幅度最??；3個(gè)處理依次為10 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，至發(fā)酵第30天，分別降低至8.68、8.20和7.21，下降幅度由快至慢依次為添加15 mg/L、5 mg/L、10 mg/L處理。進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵的其他3個(gè)處理中，色度最低的為添加了15 mg/L乳酸菌，最高的為添加了10 mg/L乳酸菌，葡萄酒進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵可以穩(wěn)定葡萄酒，因此，總體上添加10 mg/L乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵是最佳的選擇，不但色度保留效果最好，而且葡萄酒穩(wěn)定性也是最好的。

圖5 蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間pH的變化Figure 5 Changes in pH during malolactic fermentation

表6 蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間總酸的變化Table 6 The change of total acid during malolactic fermentation

表7 蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間色度的變化Table 7 Chromaticity change during malolactic fermentation

3 討論與結(jié)論

4月6日，罐1酒精發(fā)酵才緩緩啟動(dòng)，但啟動(dòng)發(fā)酵后發(fā)酵速度加快（圖1），這與安琪酵母發(fā)酵特性有關(guān)[13]。在4組對(duì)比試驗(yàn)中，罐1色度保留最完整，單寧含量最高。單寧含量先降低后升高再降低，后趨于平衡。pH在發(fā)酵過(guò)程中較為穩(wěn)定，表明葡萄酒較穩(wěn)定[14]。

酒精發(fā)酵啟動(dòng)后，發(fā)酵基質(zhì)溫度明顯上升（圖2），主要是酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量CO2氣體和熱量[15]，升高了發(fā)酵基質(zhì)的溫度。比重下降速度趨近于0時(shí)，意味著酒精發(fā)酵即將結(jié)束，這與栗甲等[16]研究結(jié)果一致。

在發(fā)酵過(guò)程中，添加150 mg/L降酸酵母的‘黑虎香’葡萄酒中的總酸呈先升高后降低的趨勢(shì)（表3），是因?yàn)榫凭l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了大量有機(jī)酸[17]，提高了酸度。發(fā)酵第4天，酸度開始逐漸降低，第7天下降速度趨于0，表明降酸酵母確實(shí)具有降酸作用，并且在酒精發(fā)酵終止后隨即終止[18]。

不添加乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵的葡萄酒酸度有略微變化，而其他酒樣的酸度均發(fā)生了較大變化（表6），證明乳酸菌在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中具有一定降酸作用[19]。pH穩(wěn)定性與葡萄酒穩(wěn)定性有關(guān)，pH穩(wěn)定性越高，葡萄酒越穩(wěn)定[14]。蘋果酸-乳酸發(fā)酵期間4組樣品的pH均穩(wěn)定在3.28～3.42，變化不大，因此，4組葡萄酒均較穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)降酸酵母和乳酸菌發(fā)酵后，葡萄酒的穩(wěn)定性得到了很大提高。

如表7所示，不添加乳酸菌的酒樣色度最高。添加乳酸菌后色度開始降低，主要因?yàn)槿樗峋軌蚺cSO2結(jié)合的物質(zhì)，如丙酮酸、α-酮戊二酸等釋放出游離SO2，而SO2與花色苷結(jié)合，導(dǎo)致‘黑虎香’葡萄酒色度降低[20-21]。

降酸酵母作為釀酒酵母的一種，最大的特點(diǎn)是能夠在葡萄酒發(fā)酵期間起一定降酸作用[22]。本次試驗(yàn)啟動(dòng)酒精發(fā)酵采用的是帝伯仕降酸酵母[23]，其特點(diǎn)為耐酸、適應(yīng)性強(qiáng)、發(fā)酵啟動(dòng)較快、發(fā)酵溫度范圍廣（18～28 ℃）。能夠降低葡萄酒酸度，使口感更加柔和。能夠保持葡萄本身特有的香氣，在本試驗(yàn)中有明顯的體現(xiàn)。因此，具有很大的發(fā)展前景。

利用降酸酵母將部分蘋果酸轉(zhuǎn)化成乙醇和CO2，或利用乳酸菌將部分蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，都可柔和葡萄酒中的酸，避免因加入過(guò)多化學(xué)降酸劑導(dǎo)致質(zhì)量下降，降低葡萄酒酸度，改善葡萄酒口感[3]。采用不同量的降酸酵母與乳酸菌進(jìn)行試驗(yàn)，探究?jī)煞N微生物對(duì)‘黑虎香’葡萄酒降酸效果的影響，篩選出最佳的‘黑虎香’葡萄酒降酸工藝，對(duì)其它品種的葡萄酒或果酒的降酸也具有一定的參考價(jià)值。綜上所述，‘黑虎香’葡萄酒酒精發(fā)酵過(guò)程中，使用帝伯仕降酸酵母的3組酒精發(fā)酵啟動(dòng)較快，使用安琪酵母的一組酒精發(fā)酵啟動(dòng)較慢。啟動(dòng)‘黑虎香’葡萄酒發(fā)酵的最佳降酸酵母用量為200 mg/L，發(fā)酵過(guò)程中能夠降低1.03 g/L的酸。

酒精發(fā)酵結(jié)束后，不添加乳酸菌發(fā)酵的一組樣品的酸度值變化甚微，色度保留較好。添加乳酸菌的3組樣品中，添加10 mg/L乳酸菌使總酸降低了0.83 g/L，pH變化最平穩(wěn)，色度值最高，為8.68，色度保留最完整，降酸效果最好，酒的穩(wěn)定性最好。