響應(yīng)面優(yōu)化馬鮫魚魚皮膠原蛋白的提取工藝

□ 朱航 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院

□ 戴聰杰（通訊作者） 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院

馬鮫魚肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，既是寶貴的海洋生物資源，也是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的海產(chǎn)優(yōu)質(zhì)魚類，其主要分布于我國(guó)東海、黃海、渤海等海域[1]。我國(guó)作為漁業(yè)大國(guó)，水產(chǎn)品加工處理所產(chǎn)生的下腳料(魚皮、魚骨、魚內(nèi)臟等)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)原材料的加工部分[2]，而這些下腳料也擁有著豐富的膠原蛋白、鈣質(zhì)、魚油等資源。如水產(chǎn)品加工處理后的下腳料能夠得到充分利用，不僅可以增加魚類的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更有利于環(huán)境的綠色發(fā)展。其中，由于膠原蛋白具有止血增生、生物降解、生物相容、抑制衰老、美容護(hù)膚等作用，故深受研究者的青睞[3]。膠原蛋白常用的提取方法有熱水抽提法、酸提法、酶提法、鹽提法和堿提法等，且不同方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[4-5]。本研究擬采用熱水浸提法和酸提法，以馬鮫魚下腳料——魚皮為材料，提取馬鮫魚魚皮膠原蛋白，以期優(yōu)化馬鮫魚魚皮膠原蛋白的提取工藝，為馬鮫魚高值化提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：福建省崇武縣某魚卷加工企業(yè)提供的馬鮫魚新鮮魚皮，在-20℃以下環(huán)境中保存。

試劑：乙酸、L-羥脯氨酸、硫酸、一水檸檬酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙酸鈉、氯胺T、對(duì)二甲氨基苯甲醛、正丙醇、異丙醇、高氯酸、殼聚糖，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4A型，常州國(guó)華電器有限公司；

分光光度計(jì)，V-1800型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

冷凍低俗離心機(jī)，L535R型，湘儀離心機(jī)有限公司；

IKA手握式組織勻漿機(jī)，T10 basic型，艾卡儀器設(shè)備有限公司；

多通道智能加熱磁力攪拌器，SP200-2T型，杭州米歐儀器有限公司；

電腦恒溫層析柜，CXG-1型，上海青浦滬西儀器廠；

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮的預(yù)處理

新鮮的馬鮫魚魚皮中含有大量的魚肉、魚刺、脂肪等雜質(zhì)，通過(guò)手工處理和試劑浸泡——經(jīng)H2O2和NaOH等加工處理進(jìn)行脫脂肪、脫腥、脫雜蛋白[6-7]，做到無(wú)損害處理魚皮。

1.3.2 熱水浸提法[8-9]的單因素試驗(yàn)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定熱水浸提法單因素試驗(yàn)的基本條件為：料液比1∶60、浸提溫度50℃、浸提時(shí)間6h，通過(guò)控制變量來(lái)分析各單因素對(duì)魚皮膠原蛋白提取率的影響。稱取0.5g魚皮溶脹，在浸提溫度50℃、浸提時(shí)間6h條件下，料液比分別以1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90勻漿提取；在料液比為1∶60、浸提時(shí)間為6h條件下，溫度分別采用30、40、50、60、70、80℃勻漿提??；在料液比1∶60、浸提溫度50℃條件下，浸提時(shí)間設(shè)置為3、4、5、6、7、8h勻漿提取。然后測(cè)定羥脯氨酸濃度，計(jì)算膠原蛋白提取率。

1.3.3 酸提法[10-11]的單因素試驗(yàn)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定酸提法單因素試驗(yàn)的基本條件為：料液比1∶70、乙酸濃度0.5mol/L、浸提時(shí)間12h，通過(guò)控制變量來(lái)分析各單因素對(duì)魚皮膠原蛋白提取率的影響。稱取0.5g魚皮溶脹，在乙酸濃度0.5mol/L、浸提時(shí)間12h條件下，料液比以1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100勻漿提?。辉诹弦罕?∶70、浸提時(shí)間12h條件下，乙酸濃度采用0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0mol/L勻漿浸提；在料液比1∶70、乙酸濃度0.5mol/L條件下，浸提時(shí)間設(shè)置為3、6、9、12、15、18 h勻漿提取，且提取均處于4℃下磁力攪拌。然后測(cè)定羥脯氨酸濃度，計(jì)算膠原蛋白提取率。

1.3.4 馬鮫魚膠原蛋白提取率的測(cè)定

馬鮫魚魚皮處理完畢后，在5000r/min冷凍離心20min后取若干體積上清液，采用國(guó)標(biāo)測(cè)定羥脯氨酸法[12]繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率的測(cè)定。（注：羥脯氨酸為膠原蛋白特異性氨基酸，若顯色過(guò)程出現(xiàn)白色沉淀而未出現(xiàn)正常紅色顯色反應(yīng)，需在測(cè)定前調(diào)整水解液的pH值，避免等電點(diǎn)。）

膠原蛋白提取率（%）=提取液中羥脯氨酸含量×11.1/魚皮中膠原蛋白理論含量×100（式中：11.1為換算系數(shù)[13]）

1.3.5 響應(yīng)面分析

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Design Expert8.0軟件選取合適的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，對(duì)馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合[14-15]，得出最優(yōu)的馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為：Y=0.22X＋0.0062，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，說(shuō)明該線性回歸方程具有意義，試驗(yàn)所得吸光度可以換算成羥脯氨酸含量。

2.2 料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)馬鮫魚魚皮膠原蛋白熱水浸提法的影響

圖2 料液比、浸提時(shí)間、浸提溫度對(duì)熱水浸提法的影響

圖3 料液比、浸提時(shí)間、乙酸濃度對(duì)酸提法的影響

由圖2可知，在浸提溫度50℃、浸提時(shí)間6h條件下，當(dāng)料液比較低時(shí)，魚皮勻漿不能充分地分散于體系之中，導(dǎo)致膠原蛋白提取率偏低；隨著料液比增加，提取率開(kāi)始逐步增大；當(dāng)料液比為1∶70時(shí)提取率最高，其后提取率出現(xiàn)輕微波動(dòng)，其可能是勻漿過(guò)程不徹底或測(cè)定處理的操作不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е?。在料液?∶60，浸提時(shí)間6h條件下，提取率隨溫度的升高迅速提高，在50℃時(shí)出現(xiàn)峰值；而后開(kāi)始逐漸降低，這可能由于浸提溫度過(guò)高，魚皮的膠原纖維組織發(fā)生收縮現(xiàn)象，使膠原蛋白被束縛在魚皮組織之中無(wú)法溶出。在料液比為1∶60、浸提溫度為50℃條件下，提取率先快速上升而后趨近平緩或輕微降低，在6h左右提取率達(dá)到最大；之后，隨著浸提時(shí)間增加，魚皮勻漿液出現(xiàn)的懸浮物質(zhì)開(kāi)始增多，可能導(dǎo)致在后續(xù)分離處理中提取率下降。故選取1∶60、1∶70、1∶80，40℃、50℃、60℃，5h、6h、7h為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

2.3 料液比、浸提時(shí)間、乙酸濃度對(duì)馬鮫魚魚皮膠原蛋白酸提法的影響

由圖3可知，在乙酸濃度0.5mol/L、浸提時(shí)間12h條件下，當(dāng)料液比較低時(shí)，魚皮樣品不能完全浸泡在乙酸溶液中，膠原蛋白提取率不充分；隨著料液比增加，提取率開(kāi)始逐步增大，當(dāng)料液比為1∶70時(shí)提取率最高；其后提取率出現(xiàn)輕微波動(dòng)，膠原蛋白含量基本沒(méi)有增加。在料液比1∶70、浸提時(shí)間12h條件下，較低濃度的乙酸溶液有著可觀的提取率；隨著乙酸濃度逐漸增加，提取率先快速上升而后開(kāi)始逐漸降低，在乙酸溶液為0.5mol/L時(shí)提取率最高；出現(xiàn)此現(xiàn)象可能由于膠原蛋白在較低pH值的環(huán)境下會(huì)發(fā)生變形，不利于溶出。在料液比1∶70、乙酸濃度0.5mol/L條件下，提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速提高，在12h時(shí)提取率最大，而后開(kāi)始緩慢降低，這可能由于隨著浸提時(shí)間增加，魚皮肌原纖維結(jié)構(gòu)在酸性溶液中逐漸溶脹，促進(jìn)膠原蛋白溶出，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致魚肉組織懸浮物增多，影響后續(xù)的分離，使膠原蛋白造成浪費(fèi)。故選取1∶60、1∶70、1∶80，0.4mol/L、0.5mol/L、0.6moL/L，9h、12h、15h 為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

表1 熱水浸提法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 熱水浸提法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分別見(jiàn)表1、圖4。以料液比（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）作為響應(yīng)因子，馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率作為指標(biāo)，軟件分析得出二次回歸方程：馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率(%)=+87.36+4.75A+4.98B+3.68C+4.17AB+4.08AC+1.78BC-8.47A2-9.22B2-6.77C2，此法膠原蛋白提取率模型p＜0.05，表明該模型顯著；失擬項(xiàng)p＝0.632＞0.05不顯著，說(shuō)明此模型回歸方程擬合度較高。

圖4 料液比（A）、溫度（B）、時(shí)間（C）對(duì)馬鮫魚膠原蛋白提取率的影響

2.4.2 酸提法

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分別見(jiàn)表2、圖5。以料液比（A）、乙酸濃度（B）、時(shí)間（C）作為響應(yīng)因子，馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率作為指標(biāo)，得出二次回歸方程：馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取率(%)=+67.6+0.51A+0.56B+1.33C+0.52AB+0.25AC+0.25BC-1.76A2-1.76B2-1.54C2，此法膠原蛋白提取率模型p＜0.05，表明該模型顯著；失擬項(xiàng)p＝0.9995＞0.05不顯著，說(shuō)明此模型回歸方程擬合度較高。

表2 酸提法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖5 料液比（A）、乙酸濃度（B）、時(shí)間（C）對(duì)馬鮫魚膠原蛋白提取率的影響

3 結(jié)論

膠原蛋白的提取可以采用不同方法，而不同的方法又各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此不能僅將提取率這一項(xiàng)指標(biāo)作為判斷依據(jù)，還需進(jìn)一步研究對(duì)魚皮膠原蛋白提取方法加以說(shuō)明。本文采用熱水浸提法和酸提法提取馬鮫魚魚皮膠原蛋白，結(jié)合單因素和響應(yīng)面分析對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合實(shí)際情況得出熱水浸提法的最佳提取條件為：料液比1∶75、浸提溫度55℃、浸提時(shí)間6.5h，膠原蛋白提取率達(dá)到90.5%；酸提法最佳提取條件為：料液比1∶70、乙酸濃度0.5mol/L、時(shí)間13.5h，膠原蛋白提取率達(dá)到68.0%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)誤差較小，說(shuō)明模型擬合度高，可以較好地體現(xiàn)兩種方法對(duì)馬鮫魚魚皮膠原蛋白提取的情況。