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    棉葉中棉酚快速測(cè)定方法的改進(jìn)

    2019-11-21 01:49:32方丹邢榮花徐雙嬌馬磊
    中國(guó)棉花 2019年10期
    關(guān)鍵詞:棉葉棉酚萜烯

    方丹,邢榮花,徐雙嬌,馬磊

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(安陽(yáng)),河南安陽(yáng)455000;2.中華人民共和國(guó)安陽(yáng)海關(guān),河南安陽(yáng)455000)

    棉酚(G)及相關(guān)物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚酮(HGQ)、半棉酚(HG)、殺實(shí)夜蛾素(H1-4)等是棉花中重要的抗蟲性萜烯類次生物質(zhì)[1],廣泛存在于棉族植株各部位的褐色點(diǎn)狀色素腺體中。國(guó)內(nèi)外對(duì)棉花抗蟲萜烯類化合物種類和抗蟲性能的研究表明,棉葉色素腺體內(nèi)的棉酚及其衍生物有助于棉花植株適應(yīng)不良環(huán)境,對(duì)棉花的多種病原菌和害蟲具有拮抗作用。 研究發(fā)現(xiàn),棉酚在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值,表現(xiàn)出抑制精子產(chǎn)生和抗腫瘤作用,同時(shí)具有較強(qiáng)的毒副作用。

    通常在棉花組織中呈游離狀態(tài)的棉酚稱為游離棉酚,與其他物質(zhì)(主要是蛋白質(zhì))結(jié)合的稱為結(jié)合棉酚。至今已報(bào)道的游離棉酚的測(cè)定方法有比色法[2]、薄層色譜法[3]、紫外 - 可見分光光度計(jì)法[4-5]、核磁共振法(Nuclear magnetic resonance,NMR)[6-7]、高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography,HPLC)[8-10]、 高效液相色譜 - 質(zhì)譜檢測(cè)法(HPLC-MS)[11-12]。 其中棉酚提取后與某種試劑發(fā)生反應(yīng),以分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液的吸光度對(duì)棉酚進(jìn)行定性和定量分析的方法主要有間苯三酚法和苯胺法。Smith-苯胺法利用芳烴環(huán)上的醛基與苯胺反應(yīng)生成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定。高效液相色譜法,樣品中的棉酚被提取凈化后,不需要進(jìn)行衍生化,可直接上機(jī)測(cè)定,是目前最常用的方法。我國(guó)于2014年發(fā)布了GB 5009.148—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物性食品中游離棉酚的測(cè)定》,該標(biāo)準(zhǔn)適用于植物油或以棉籽餅為原料的其他液體食品中游離棉酚的測(cè)定[13]。 施琦貽[14]報(bào)道了以HPLC-ESIMS/MS 聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蛋黃中棉酚殘留的研究,樣品經(jīng)丙酮提取后,以甲醇和1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸為流動(dòng)相,采用電噴霧負(fù)離子模式離子化、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定棉酚。 然而對(duì)于不同樣品基質(zhì),提取溶劑的選取也會(huì)有所差別,導(dǎo)致棉酚提取率及測(cè)定結(jié)果存在差異。 因此,本研究著重對(duì)棉葉樣品的提取方法進(jìn)行討論并篩選出一種簡(jiǎn)單、快速的前處理方法,比較2 種測(cè)定方法,即紫外- 可見分光光度計(jì)法(Smith-苯胺法)和HPLC 法,通過(guò)分析測(cè)定結(jié)果的差異,建立準(zhǔn)確測(cè)定棉葉中棉酚的方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    安捷倫1100 型高效液相色譜儀,DAD 檢測(cè)器,反相色譜柱:Eclipse Plus C18 柱 (填料粒徑 5 μm,內(nèi)徑 4.6 mm,長(zhǎng)度 250 mm),島津 UVmini-1240 紫外- 可見分光光度計(jì),超聲清洗器,振蕩器,離心機(jī),水浴鍋。

    棉酚標(biāo)準(zhǔn)品,購(gòu)自Sigma 公司 (批號(hào)G8761-(±)-gossypol from cotton seeds,≥95%),所用試劑甲醇、丙酮、乙腈、乙醇、磷酸均為色譜純?cè)噭?,?gòu)自Sigma 公司,溶液 A(715 mL 乙醇,加冰醋酸 0.2 mL及乙醚200 mL,用超純水稀釋至1 000 mL),溶液B(3 g 抗壞血酸溶于 45 mL 溶液 A),苯胺(重蒸),試驗(yàn)均采用MiliQ 超純水。

    1.2 植株材料

    供試樣品采自試驗(yàn)田棉花,品種為石抗-126,種植于河南省安陽(yáng)縣,常規(guī)管理。

    棉葉樣品采集后,液氮研磨真空干燥脫水備用。

    1.3 色譜條件

    HPLC 法,流動(dòng)相為甲醇與0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸混合液(體積比 85∶15),等度洗脫;流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量 10 μL。

    1.4 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

    稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品50 mg,用乙腈溶解,定容至50 mL 棕色容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃冰箱避光保存。

    1.5 HPLC 法

    1.5.1提取溶劑的對(duì)比試驗(yàn)。根據(jù)相似相容原理,在棉酚前處理過(guò)程中,采用有機(jī)溶劑來(lái)提取棉酚,分別以純丙酮、 乙腈/ 水/ 磷酸混合液 (體積比80∶20∶0.1)、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸混合液(體積比500∶500∶1)、異丙醇 / 正己烷混合液(體積比60∶40)為提取溶劑,進(jìn)行對(duì)比測(cè)定。

    1.5.2測(cè)定過(guò)程。稱取粉碎樣品100 mg (精確至0.000 1 g)于離心管中,加入2 mL 提取溶劑——乙腈 / 水 / 磷酸混合液(體積比 80∶20∶0.1),超聲提取15 min,提取液離心分離,經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,濾液按照“1.3 色譜條件進(jìn)樣10 μL”測(cè)定。

    1.6 紫外-可見分光光度計(jì)法(Smith-苯胺法)

    稱取粉碎樣品100 mg (精確至0.000 1 g)于250 mL 帶塞錐形瓶中,加入 3 mL 溶液 B 和 0.5 mL 濃鹽酸,混勻,再加入 20 mL 玻璃珠(直徑6 mm),3 min 后葉綠素褪色,加入 30 mL 乙醚后置于水浴中至沸騰,除去瓶中空氣,迅速加蓋瓶塞并振蕩10 min,減壓抽濾,濾液收集于50 mL 容量瓶中,用溶液A 稀釋至刻度,快速量取此液5 mL(3份),同時(shí)取 5 mL 溶液 A(3 份),置于 25 mL 容量瓶中,向其中2 份中加入0.5 mL 苯胺(重蒸),第三份作為參比溶液,一并置于75 ℃水浴中加熱40 min,冷卻后,用溶液A 將3 份溶液稀釋至刻度,在最大吸收波長(zhǎng)445 nm 處進(jìn)行比色測(cè)定[15]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 HPLC 法

    2.1.1提取溶劑效果對(duì)比。常溫下,棉酚標(biāo)準(zhǔn)品呈黃色粉末,易溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機(jī)試劑,不易溶于水及低沸點(diǎn)的石油醚、己烷[16]。棉酚溶液穩(wěn)定性差,極易被氧化而變質(zhì)。 因此,在測(cè)定棉酚的過(guò)程中,選用不同的提取溶劑[17]對(duì)比效果。測(cè)定結(jié)果(表1)表明,以乙腈/ 水/ 磷酸為提取溶劑時(shí),提取效率最好,所得棉酚含量最高。 另外,棉酚在乙腈中的穩(wěn)定性比較好,該提取溶劑與流動(dòng)相互溶性好,提取后可直接測(cè)定,避免氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶時(shí),目標(biāo)物的損失; 因此最終確定乙腈/ 水/磷酸混合液(體積比80∶20∶0.1)為合適的提取溶劑。

    在以上確定的提取與色譜條件下,與棉酚標(biāo)準(zhǔn)品圖譜相比,以確定棉酚的峰,結(jié)果見圖1。

    表1 不同提取溶劑下棉酚測(cè)定結(jié)果的對(duì)比

    圖1 棉酚HPLC 檢測(cè)圖譜

    2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度(外標(biāo)法)。精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液 (1 000 mg·L-1) 于 10 mL 棕色容量瓶中,用乙腈稀釋定容,得到質(zhì)量濃度分別為 20、30、40、50、60、70 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.3 色譜條件”進(jìn)行檢測(cè),對(duì)峰面積y與質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸,得回歸曲線(圖 2),其回歸方程為y=167.75x-330.34,r=0.999 5,表明棉酚在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。 棉酚的最低檢出限為 0.475 mg·L-1。

    2.1.3精密度試驗(yàn)。取 40 mg·L-1的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.3 色譜條件”進(jìn)行分析,在同一條件下連續(xù)進(jìn)樣 5 次,得到棉酚峰面積為 6 227.6、6 192.2、6 232.5、6 235.9、6 095.7,平均值為 6 196.8,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 0.95%(n=5),表明本試驗(yàn)方法精密度良好。

    圖2 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

    2.1.4平行性與重復(fù)性測(cè)定。稱取6 份冷凍干燥后的樣品各100 mg,以上述乙腈/ 水/ 磷酸混合液為提取劑,振蕩、超聲15 min 提取,離心分離后,取上清液過(guò)孔徑0.22 μm 的微孔濾膜,上機(jī)測(cè)定棉酚的含量,所得數(shù)據(jù)如表2,表明該方法重復(fù)性好。

    表2 棉酚HPLC 法平行性的測(cè)定結(jié)果

    2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。取待測(cè)樣品溶液,室溫下,分別在 0、1、3、6、10、12 h 依次測(cè)定,記錄峰面積分別為4 224.9、4 223.4、4 149.2、4 107.5、4 036.8、4 022.4,結(jié)果RSD為 2.13%(n=6)。

    2.1.6加標(biāo)回收率測(cè)定。精確稱取6 份已知棉酚含量的樣品 100 mg,分成2 組,每組3 個(gè)平行,每組分別加入棉酚標(biāo)準(zhǔn)品 0.04 mg、0.06 mg、0.10 mg 進(jìn)行測(cè)定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得加標(biāo)后棉酚濃度,進(jìn)而得到其含量值,按下式計(jì)算回收率,所得回收率為80.15%~113.00%(表 3)。

    加標(biāo)回收率(%)=(樣液加標(biāo)后測(cè)定值-樣液測(cè)定值)/加標(biāo)量×100%。

    表3 棉酚回收率的測(cè)定(HPLC 法)結(jié)果

    2.2紫外-可見分光光度計(jì)法。按照1.6 所述方法對(duì)棉葉樣品進(jìn)行提取和測(cè)定,選擇不同的提取溶劑[純丙酮、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸(500∶500∶1)、異丙醇/ 正己烷(60∶40)、溶劑A]對(duì)比結(jié)果表明,以溶劑A 作提取溶劑時(shí)所得吸光度值最大,所得結(jié)果見表4。

    表4 紫外-可見分光光度計(jì)法平行性的測(cè)定結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    棉花抗蟲萜烯類化合物是棉花自身重要的防御物質(zhì)。 在國(guó)內(nèi)外以往的一些研究報(bào)道中,關(guān)于棉花植株在一定生長(zhǎng)時(shí)期及主要器官中棉酚、半棉酚酮等萜烯類物質(zhì)的含量測(cè)定很多,如Mahoney 等[18]和Stipanovic 等[1]采用液相色譜法,對(duì)棉葉、花蕾及棉籽仁進(jìn)行提取、凈化、濃縮等前處理,測(cè)定萜烯類物質(zhì)含量,結(jié)果顯示棉葉中主要含有半棉酚酮和殺實(shí)夜蛾素,棉籽中只存在棉酚,花蕾中主要含有棉酚。 Benson 等[19]采用乙腈/ 水作為提取溶劑,不需要進(jìn)行凈化、濃縮步驟,采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定棉株綠色組織和花蕾中萜烯類物質(zhì)的含量,建立了快速、可靠、穩(wěn)定的測(cè)定方法。

    本研究數(shù)據(jù)表明,Smith- 苯胺法測(cè)定結(jié)果與HPLC 法測(cè)定結(jié)果存在明顯差異。 Smith-苯胺法測(cè)定速度快、成本低,是利用棉葉中具有芳香醛結(jié)構(gòu)的化合物與苯胺反應(yīng)形成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定,對(duì)棉酚不具有專一性,因此其結(jié)果反映棉葉中萜烯類物質(zhì)的總和,數(shù)值偏高;而HPLC 法測(cè)定的是棉葉萜烯類物質(zhì)中棉酚的含量。 所以,對(duì)于棉葉中棉酚物質(zhì)的檢測(cè),HPLC 法是比較可靠的分析方法。

    棉酚分子中含有多個(gè)酚羥基,具有弱酸性,在流動(dòng)相中加入少量磷酸,才能獲得峰形對(duì)稱的色譜峰。 本研究采用乙腈/水/磷酸混合液提取棉葉中的棉酚用于HPLC 分析,選擇甲醇/0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸(體積比85∶15)為流動(dòng)相,不需要樣品的凈化、濃縮步驟,方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定。棉葉樣品色譜圖(圖1-B)中,除了棉酚,還有一個(gè)標(biāo)注“1”的峰,通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀分析,該物質(zhì)是半棉酚酮,對(duì)此需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證,以期為棉花抗蟲和育種工作者提供技術(shù)支持。

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