棉葉中棉酚快速測(cè)定方法的改進(jìn)

方丹，邢榮花，徐雙嬌，馬磊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部棉花產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（安陽(yáng)），河南安陽(yáng)455000；2.中華人民共和國(guó)安陽(yáng)海關(guān)，河南安陽(yáng)455000）

棉酚（G）及相關(guān)物甲氧基半棉酚（DHG）、半棉酚酮（HGQ）、半棉酚（HG）、殺實(shí)夜蛾素（H1-4）等是棉花中重要的抗蟲性萜烯類次生物質(zhì)[1]，廣泛存在于棉族植株各部位的褐色點(diǎn)狀色素腺體中。國(guó)內(nèi)外對(duì)棉花抗蟲萜烯類化合物種類和抗蟲性能的研究表明，棉葉色素腺體內(nèi)的棉酚及其衍生物有助于棉花植株適應(yīng)不良環(huán)境，對(duì)棉花的多種病原菌和害蟲具有拮抗作用。 研究發(fā)現(xiàn)，棉酚在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值，表現(xiàn)出抑制精子產(chǎn)生和抗腫瘤作用，同時(shí)具有較強(qiáng)的毒副作用。

通常在棉花組織中呈游離狀態(tài)的棉酚稱為游離棉酚，與其他物質(zhì)（主要是蛋白質(zhì)）結(jié)合的稱為結(jié)合棉酚。至今已報(bào)道的游離棉酚的測(cè)定方法有比色法[2]、薄層色譜法[3]、紫外 - 可見分光光度計(jì)法[4-5]、核磁共振法（Nuclear magnetic resonance，NMR）[6-7]、高效液相色譜法 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[8-10]、 高效液相色譜 - 質(zhì)譜檢測(cè)法（HPLC-MS）[11-12]。 其中棉酚提取后與某種試劑發(fā)生反應(yīng)，以分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液的吸光度對(duì)棉酚進(jìn)行定性和定量分析的方法主要有間苯三酚法和苯胺法。Smith-苯胺法利用芳烴環(huán)上的醛基與苯胺反應(yīng)生成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定。高效液相色譜法，樣品中的棉酚被提取凈化后，不需要進(jìn)行衍生化，可直接上機(jī)測(cè)定，是目前最常用的方法。我國(guó)于2014年發(fā)布了GB 5009.148—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物性食品中游離棉酚的測(cè)定》，該標(biāo)準(zhǔn)適用于植物油或以棉籽餅為原料的其他液體食品中游離棉酚的測(cè)定[13]。 施琦貽[14]報(bào)道了以HPLC-ESIMS/MS 聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)蛋黃中棉酚殘留的研究，樣品經(jīng)丙酮提取后，以甲醇和1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸為流動(dòng)相，采用電噴霧負(fù)離子模式離子化、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定棉酚。 然而對(duì)于不同樣品基質(zhì)，提取溶劑的選取也會(huì)有所差別，導(dǎo)致棉酚提取率及測(cè)定結(jié)果存在差異。 因此，本研究著重對(duì)棉葉樣品的提取方法進(jìn)行討論并篩選出一種簡(jiǎn)單、快速的前處理方法，比較2 種測(cè)定方法，即紫外- 可見分光光度計(jì)法（Smith-苯胺法）和HPLC 法，通過(guò)分析測(cè)定結(jié)果的差異，建立準(zhǔn)確測(cè)定棉葉中棉酚的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1100 型高效液相色譜儀，DAD 檢測(cè)器，反相色譜柱：Eclipse Plus C18 柱 （填料粒徑 5 μm，內(nèi)徑 4.6 mm，長(zhǎng)度 250 mm），島津 UVmini-1240 紫外- 可見分光光度計(jì)，超聲清洗器，振蕩器，離心機(jī)，水浴鍋。

棉酚標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自Sigma 公司 （批號(hào)G8761-（±）-gossypol from cotton seeds，≥95%），所用試劑甲醇、丙酮、乙腈、乙醇、磷酸均為色譜純?cè)噭?，?gòu)自Sigma 公司，溶液 A（715 mL 乙醇，加冰醋酸 0.2 mL及乙醚200 mL，用超純水稀釋至1 000 mL），溶液B（3 g 抗壞血酸溶于 45 mL 溶液 A），苯胺（重蒸），試驗(yàn)均采用MiliQ 超純水。

1.2 植株材料

供試樣品采自試驗(yàn)田棉花，品種為石抗-126，種植于河南省安陽(yáng)縣，常規(guī)管理。

棉葉樣品采集后，液氮研磨真空干燥脫水備用。

1.3 色譜條件

HPLC 法，流動(dòng)相為甲醇與0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸混合液（體積比 85∶15），等度洗脫；流速：1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量 10 μL。

1.4 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用乙腈溶解，定容至50 mL 棕色容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg·L－1的棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱避光保存。

1.5 HPLC 法

1.5.1提取溶劑的對(duì)比試驗(yàn)。根據(jù)相似相容原理，在棉酚前處理過(guò)程中，采用有機(jī)溶劑來(lái)提取棉酚，分別以純丙酮、 乙腈/ 水/ 磷酸混合液 （體積比80∶20∶0.1）、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸混合液（體積比500∶500∶1）、異丙醇 / 正己烷混合液（體積比60∶40）為提取溶劑，進(jìn)行對(duì)比測(cè)定。

1.5.2測(cè)定過(guò)程。稱取粉碎樣品100 mg （精確至0.000 1 g）于離心管中，加入2 mL 提取溶劑——乙腈 / 水 / 磷酸混合液（體積比 80∶20∶0.1），超聲提取15 min，提取液離心分離，經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液按照“1.3 色譜條件進(jìn)樣10 μL”測(cè)定。

1.6 紫外-可見分光光度計(jì)法（Smith-苯胺法）

稱取粉碎樣品100 mg （精確至0.000 1 g）于250 mL 帶塞錐形瓶中，加入 3 mL 溶液 B 和 0.5 mL 濃鹽酸，混勻，再加入 20 mL 玻璃珠（直徑6 mm），3 min 后葉綠素褪色，加入 30 mL 乙醚后置于水浴中至沸騰，除去瓶中空氣，迅速加蓋瓶塞并振蕩10 min，減壓抽濾，濾液收集于50 mL 容量瓶中，用溶液A 稀釋至刻度，快速量取此液5 mL（3份），同時(shí)取 5 mL 溶液 A（3 份），置于 25 mL 容量瓶中，向其中2 份中加入0.5 mL 苯胺（重蒸），第三份作為參比溶液，一并置于75 ℃水浴中加熱40 min，冷卻后，用溶液A 將3 份溶液稀釋至刻度，在最大吸收波長(zhǎng)445 nm 處進(jìn)行比色測(cè)定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 法

2.1.1提取溶劑效果對(duì)比。常溫下，棉酚標(biāo)準(zhǔn)品呈黃色粉末，易溶于乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機(jī)試劑，不易溶于水及低沸點(diǎn)的石油醚、己烷[16]。棉酚溶液穩(wěn)定性差，極易被氧化而變質(zhì)。 因此，在測(cè)定棉酚的過(guò)程中，選用不同的提取溶劑[17]對(duì)比效果。測(cè)定結(jié)果（表1）表明，以乙腈/ 水/ 磷酸為提取溶劑時(shí)，提取效率最好，所得棉酚含量最高。 另外，棉酚在乙腈中的穩(wěn)定性比較好，該提取溶劑與流動(dòng)相互溶性好，提取后可直接測(cè)定，避免氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶時(shí)，目標(biāo)物的損失； 因此最終確定乙腈/ 水/磷酸混合液（體積比80∶20∶0.1）為合適的提取溶劑。

在以上確定的提取與色譜條件下，與棉酚標(biāo)準(zhǔn)品圖譜相比，以確定棉酚的峰，結(jié)果見圖1。

表1 不同提取溶劑下棉酚測(cè)定結(jié)果的對(duì)比

圖1 棉酚HPLC 檢測(cè)圖譜

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和靈敏度（外標(biāo)法）。精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 棉酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ) 備液 （1 000 mg·L－1） 于 10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容，得到質(zhì)量濃度分別為 20、30、40、50、60、70 mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3 色譜條件”進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)峰面積y與質(zhì)量濃度x進(jìn)行線性回歸，得回歸曲線（圖 2），其回歸方程為y＝167.75x－330.34，r＝0.999 5，表明棉酚在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。 棉酚的最低檢出限為 0.475 mg·L－1。

2.1.3精密度試驗(yàn)。取 40 mg·L－1的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3 色譜條件”進(jìn)行分析，在同一條件下連續(xù)進(jìn)樣 5 次，得到棉酚峰面積為 6 227.6、6 192.2、6 232.5、6 235.9、6 095.7，平均值為 6 196.8，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 0.95%（n＝5），表明本試驗(yàn)方法精密度良好。

圖2 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.1.4平行性與重復(fù)性測(cè)定。稱取6 份冷凍干燥后的樣品各100 mg，以上述乙腈/ 水/ 磷酸混合液為提取劑，振蕩、超聲15 min 提取，離心分離后，取上清液過(guò)孔徑0.22 μm 的微孔濾膜，上機(jī)測(cè)定棉酚的含量，所得數(shù)據(jù)如表2，表明該方法重復(fù)性好。

表2 棉酚HPLC 法平行性的測(cè)定結(jié)果

2.1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)。取待測(cè)樣品溶液，室溫下，分別在 0、1、3、6、10、12 h 依次測(cè)定，記錄峰面積分別為4 224.9、4 223.4、4 149.2、4 107.5、4 036.8、4 022.4，結(jié)果RSD為 2.13%（n＝6）。

2.1.6加標(biāo)回收率測(cè)定。精確稱取6 份已知棉酚含量的樣品 100 mg，分成2 組，每組3 個(gè)平行，每組分別加入棉酚標(biāo)準(zhǔn)品 0.04 mg、0.06 mg、0.10 mg 進(jìn)行測(cè)定，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得加標(biāo)后棉酚濃度，進(jìn)而得到其含量值，按下式計(jì)算回收率，所得回收率為80.15%～113.00%（表 3）。

加標(biāo)回收率（%）＝（樣液加標(biāo)后測(cè)定值－樣液測(cè)定值）/加標(biāo)量×100%。

表3 棉酚回收率的測(cè)定（HPLC 法）結(jié)果

2.2紫外-可見分光光度計(jì)法。按照1.6 所述方法對(duì)棉葉樣品進(jìn)行提取和測(cè)定，選擇不同的提取溶劑[純丙酮、正己烷 / 乙酸乙酯 / 乙酸（500∶500∶1）、異丙醇/ 正己烷（60∶40）、溶劑A]對(duì)比結(jié)果表明，以溶劑A 作提取溶劑時(shí)所得吸光度值最大，所得結(jié)果見表4。

表4 紫外-可見分光光度計(jì)法平行性的測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

棉花抗蟲萜烯類化合物是棉花自身重要的防御物質(zhì)。 在國(guó)內(nèi)外以往的一些研究報(bào)道中，關(guān)于棉花植株在一定生長(zhǎng)時(shí)期及主要器官中棉酚、半棉酚酮等萜烯類物質(zhì)的含量測(cè)定很多，如Mahoney 等[18]和Stipanovic 等[1]采用液相色譜法，對(duì)棉葉、花蕾及棉籽仁進(jìn)行提取、凈化、濃縮等前處理，測(cè)定萜烯類物質(zhì)含量，結(jié)果顯示棉葉中主要含有半棉酚酮和殺實(shí)夜蛾素，棉籽中只存在棉酚，花蕾中主要含有棉酚。 Benson 等[19]采用乙腈/ 水作為提取溶劑，不需要進(jìn)行凈化、濃縮步驟，采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定棉株綠色組織和花蕾中萜烯類物質(zhì)的含量，建立了快速、可靠、穩(wěn)定的測(cè)定方法。

本研究數(shù)據(jù)表明，Smith- 苯胺法測(cè)定結(jié)果與HPLC 法測(cè)定結(jié)果存在明顯差異。 Smith-苯胺法測(cè)定速度快、成本低，是利用棉葉中具有芳香醛結(jié)構(gòu)的化合物與苯胺反應(yīng)形成黃色物質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定，對(duì)棉酚不具有專一性，因此其結(jié)果反映棉葉中萜烯類物質(zhì)的總和，數(shù)值偏高；而HPLC 法測(cè)定的是棉葉萜烯類物質(zhì)中棉酚的含量。 所以，對(duì)于棉葉中棉酚物質(zhì)的檢測(cè)，HPLC 法是比較可靠的分析方法。

棉酚分子中含有多個(gè)酚羥基，具有弱酸性，在流動(dòng)相中加入少量磷酸，才能獲得峰形對(duì)稱的色譜峰。 本研究采用乙腈/水/磷酸混合液提取棉葉中的棉酚用于HPLC 分析，選擇甲醇/0.1%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸（體積比85∶15）為流動(dòng)相，不需要樣品的凈化、濃縮步驟，方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定。棉葉樣品色譜圖（圖1-B）中，除了棉酚，還有一個(gè)標(biāo)注“1”的峰，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀分析，該物質(zhì)是半棉酚酮，對(duì)此需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證，以期為棉花抗蟲和育種工作者提供技術(shù)支持。