陸地棉 GhRab7基因鑒定及酵母中鹽脅迫響應分析

劉凌云，李玉龍，王艷霞，李秀文，張 彤

(河南大學 生命科學學院，河南開封 475004)

Rab蛋白是一類分子質(zhì)量為20～30ku、在真核生物中廣泛存在的GTP結(jié)合蛋白，該類蛋白不僅通過調(diào)節(jié)囊泡的形成、運輸和錨定等行為參與胞內(nèi)膜系統(tǒng)融合過程，而且也作為信號分子參與調(diào)節(jié)各種生長發(fā)育及脅迫響應過程[1-3]。在這些Rab蛋白中，Rab7(RabG)相關蛋白負責調(diào)節(jié)內(nèi)吞物質(zhì)轉(zhuǎn)運到溶酶體降解的過程[4]。

值得注意的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些Rab7基因?qū)Ω珊怠Ⅺ}、低溫、脫落酸(ABA)、病菌等環(huán)境刺激發(fā)生響應。干旱和ABA強烈上調(diào)水稻OsRab7的轉(zhuǎn)錄，鹽脅迫時超表達OsRab7的轉(zhuǎn)基因水稻根尖液泡數(shù)量增多，脯氨酸含量增加[5]。水楊酸及病原菌均能誘導擬南芥AtRab7(RabG3e)的表達，超表達AtRab7轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)吞過程加快，鹽和滲透脅迫耐性增加，活性氧積累減少[6]。狼尾草PgRab7轉(zhuǎn)錄明顯受鹽、冷、干旱及IAA的誘導，超表達PgRab7的轉(zhuǎn)基因煙草隨著堿性磷酸酶活性增加，其對鹽和甘露醇的抗性也增加[7]。此外，干旱、鹽及ABA分別調(diào)節(jié)獐毛屬AeluropuslagopoidesAlRab7的表達，異源表達AlRab7的大腸桿菌在分別含有鹽、甘露醇、ABA及IAA的培養(yǎng)上生長更好[8]。這些研究結(jié)果暗示Rab7基因在植物中參與逆境脅迫尤其是鹽脅迫響應的功能可能是保守的。

土壤鹽分(NaCl)過度積累嚴重威脅作物的產(chǎn)量[9]，鹽脅迫影響植物種子萌發(fā)、營養(yǎng)及生殖生長等過程。棉花(GossypiumhirsutumL.)屬于中度耐鹽作物，但種植地土壤的鹽堿化嚴重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。2015年陸地棉參考基因組序列的發(fā)表，使通過棉花功能基因的研究改良棉花種質(zhì)以適應嚴苛的環(huán)境條件變得更加高效和方便[10]。轉(zhuǎn)錄組學研究剖析了棉花參與鹽脅迫響應的各種組分[11]。此外，發(fā)現(xiàn)棉花GhZFP1(zinc finger protein1)轉(zhuǎn)基因煙草鹽脅迫耐性增強[12]；擬南芥中超表達棉花GhCIPK6(calcineurin B-like(CBL)-interacting protein kinase6)也表現(xiàn)出耐鹽和耐旱特征[13]，但棉花耐鹽的詳細機制依然不清楚。本研究從陸地棉基因組中鑒定到一個Rab7類基因，命名為GhRab7。結(jié)果表明，GhRab7編碼207個氨基酸組成的一個小G蛋白，該蛋白具有典型的Rab類蛋白保守基序。酵母中異源表達GhRab7基因，表現(xiàn)出不耐鹽脅迫的特征；結(jié)合GhRab7啟動子序列含有多個鹽脅迫響應元件的結(jié)果分析，認為GhRab7可能在陸地棉應對土壤鹽脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

將紗布包裹的陸地棉(Gossypiumhirsutumacc. TM-1)種子浸濕后放入培養(yǎng)皿中，置于 25 ℃培養(yǎng)箱催芽。萌發(fā)后的幼苗移植于土壤：蛭石體積比為1∶1的培養(yǎng)缽內(nèi)，在16 h光/8 h暗， 26 ℃白天/20 ℃晚上的條件下長至第二片真葉出現(xiàn)。取真葉用錫箔紙包裹，液氮速凍備用。

1.2 陸地棉 GhRab7基因的鑒定和分析

從棉花功能基因組數(shù)據(jù)庫(https://cottonfgd.org/)中搜索并下載Rab7相關基因，通過ExPASy在線程序(http://web.expasy.org/)對相應基因編碼蛋白的分子質(zhì)量進行預測；分別用MEGA X和DNAMAN軟件進行系統(tǒng)進化樹構建(鄰接法，Bootstrap重復次數(shù)設定為1 000)和氨基酸序列保守性及同源性分析；選取GhRab7基因起始密碼子ATG上游2 000 bp序列通過PLACE網(wǎng)站(https://sogo.dna.affrc.go.jp/)進行植物鹽脅迫響應順式作用元件預測與分析。

1.3 GhRab7-pYES2表達載體的構建

利用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取陸地棉幼苗真葉總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增出624 bp的Gh_A13G0304(GhRab7)CDS序列，通過TA克隆連入pGEM-T載體(Promega公司)中，測序正確后，采用KpnI和XbaI(Takara公司)雙酶切方法將GhRab7編碼序列重組入酵母表達載體pYES2。PCR擴增所用引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)為5′-CCCGGTACCATGCCATCTCGCCGTAGAAC-3′和 5′-GGGTCTAGATCAACAGTCACATCCAGTTG-3′。

1.4 酵母轉(zhuǎn)化及鹽脅迫分析

通過醋酸鋰方法[14]分別將pYES2空載體和GhRab7-pYES2重組載體轉(zhuǎn)化入INVSC1酵母細胞并用缺乏尿嘧啶的SC培養(yǎng)基(SC-U培養(yǎng)基，購自北京泛基諾生物公司)篩選陽性克隆。然后將不同酵母株系陽性克隆在含有w=2%乳糖(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)的SC-U培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)12 h，菌液OD600調(diào)整至1.0，按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、 1∶10 000的體積比稀釋后取1 μL點到NaCl(200 mmol/L或300 mmol/L)+YPD培養(yǎng)基(20 g/L葡萄糖，20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，20 g/L瓊脂粉)上，將該培養(yǎng)基置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉 GhRab7基因及蛋白的分子特性

為了解棉花Rab7基因的功能，以Rab7為關鍵詞在陸地棉全基因組數(shù)據(jù)庫(cottonFGD，陸地棉，南京農(nóng)業(yè)大學組裝及基因注釋)中檢索到24個標記為Ras相關蛋白Rab7的候選基因(表1)，除了將5個CDS長度僅有225～576個核苷酸，編碼的氨基酸數(shù)低于200個的基因(Gh_A12G0832、Gh_D05G2587、Gh_D09G0431、Gh_D11G2824和Gh_Sca060638G01)在后續(xù)分析中予以舍棄外，余下19個潛在的Rab7基因CDS長度為615～702個核苷酸，編碼氨基酸個數(shù)在204～233內(nèi)，預測的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量也在22.76～26.25 ku，符合Rab蛋白的典型特征[15]。陸地棉是異源四倍體，其基因組分別來源于二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉。進一步的分析也發(fā)現(xiàn)，這19個潛在的Rab7基因在陸地棉A基因組(10個)和D基因組(9個)分布不同，分別分布于2、3、5、9、10、12和13號染色體，暗示Rab7成員在陸地棉基因組進化過程中存在差異分化。

2.2 陸地棉GhRab7蛋白系統(tǒng)進化分析

為了解陸地棉Rab7蛋白的系統(tǒng)進化關系，對19個潛在的棉花Rab7蛋白與雙子葉植物擬南芥AtRab7、單子葉植物水稻OsRab7一起進行了系統(tǒng)進化樹的構建。結(jié)果顯示，除個別蛋白外，大部分A基因組上編碼Rab7蛋白的棉花候選基因可聚類到D基因組相應的位置，如A基因組9號染色體Gh_A09G0788與D基因組上9號染色體Gh_D09G0791聚為一類(圖1)，由于陸地棉四倍體是由二倍體A和D基因組進化來的，因此這些結(jié)果進一步說明陸地棉可能同時具有A與D兩套基因，同時不排除Rab7基因在進化過程中只保留一組二倍體基因的可能[16]。陸地棉Gh_A13G0304和Gh_D13G0342與擬南芥和水稻Rab7蛋白在系統(tǒng)進化樹上位于同一個分支上，因此從進化關系來看，棉花這2個蛋白與擬南芥和水稻相應蛋白的親緣關系都非常近，暗示它們在植物中可能具有類似的功能。

表1 陸地棉 GhRab7基因的分子特性Table 1 Molecular characterization of GhRab7 genes in upland cotton

圖1 陸地棉GhRab7蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.1 Identification and phylogenetic analysis of Rab7 gene family in upland cotton

為進一步分析棉花與擬南芥、水稻Rab7蛋白間的關系，利用DNAMAN軟件對這些基因編碼的氨基酸序列進行了同源關系分析。結(jié)果顯示，棉花同一個Rab7蛋白與擬南芥、水稻Rab7蛋白氨基酸序列同源性均非常相近，但不同棉花候選Rab7蛋白與擬南芥和水稻同源性為50.4%～76.8%，說明這些候選Rab7蛋白在進化過程中發(fā)生了分歧，在功能上可能會有所差異；同時也注意到，棉花Gh_A13G0304編碼的蛋白與水稻和擬南芥一致性最高，分別達到76.8%和72%(圖2)。這些結(jié)果均暗示Gh_A13G0304可能是要尋找的棉花Rab7基因，將其命名為GhRab7。

黑色框代表棉花中與擬南芥和水稻Rab7同源性最高的蛋白 Black box represents that upland cotton Gh_A13G0304 shares the highest amino acid sequence identity withArabidopisisand rice

圖2 陸地棉與擬南芥、水稻Rab7蛋白同源性分析
Fig.2 The identify of Rab7 in upland cotton,Aradopsisand rice

2.3 陸地棉 GhRab7生理生化功能的預測

為探索棉花GhRab7可能的功能，首先對該基因編碼蛋白進行序列保守性分析。通過與已知功能的擬南芥AtRab7和水稻OsRab7序列比對發(fā)現(xiàn)，棉花GhRab7含有5個典型的保守基序(G1-G5)(圖3)，其中G1、G3、G4和G5是鳥苷酸結(jié)合區(qū)，涉及核苷酸的結(jié)合和水解過程；G1是磷酸及Mg2+結(jié)合位點，G2則是效應器結(jié)合區(qū)，G4和G5是GTP/GDP結(jié)合和水解的關鍵序列，該序列保守氨基酸突變會導致Rab蛋白組成型激活或失活[17]。而且，棉花GhRab7蛋白C-末端含有保守的Cys殘基(圖3)，該Cys殘基與Rab蛋白的囊泡附著及蛋白功能密切相關[18]。這些結(jié)果暗示棉花GhRab7在生化上可能具有結(jié)合并水解GTP，參與囊泡轉(zhuǎn)運及融合的功能。

“*”代表Rab7蛋白C-未端保守的Sys殘基 “*” indicates a conserved Cys residue at the C-terminus of Rab 7 protein

圖3 陸地棉與其他物種Rab7氨基酸序列保守性分析
Fig.3 Conserved motifs and their sequences in Rab7 proteins

鑒于多種Rab7基因參與了植物對鹽脅迫的響應，選取GhRab7基因ATG上游2 000 bp序列，利用PLACE網(wǎng)站進行鹽脅迫響應元件的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GhRab7基因上游含有3種典型的鹽脅迫響應元件：4個GT1GMSCAM4、4個DRECRTCOREAT和3個DRE2COREZMRA-B17順式作用元件(表2)。此外，Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在線預測GhRab7蛋白亞細胞定位結(jié)果顯示，該蛋白定位于液泡內(nèi)。說明在植物遭受鹽脅迫時該蛋白可能通過介導囊泡轉(zhuǎn)運將過多的Na+貯存于液泡來躲避鹽毒害。

表2 陸地棉 GhRab7啟動子序列鹽脅迫響應元件分析Table 2 The cis-acting elements in responsive to salt stresses in GhRab7 promoter

2.4 酵母異源表達 GhRab7的鹽響應分析

為證實棉花GhRab7基因響應鹽脅迫的生理功能，構建了GhRab7-pYES2重組載體，并將其轉(zhuǎn)入酵母細胞，在不同濃度NaCl處理下進行異源表達。如圖4所示，在添加150 mmol/L NaCl的YPD培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)pYES2空載的酵母細胞在稀釋至10-4時依然能夠生長，但轉(zhuǎn)GhRab7基因的酵母細胞在稀釋至10-1時生長已經(jīng)明顯受到抑制；同樣，在300 mmol/L NaCl的YPD培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)GhRab7基因的酵母細胞表現(xiàn)出相似的特征。這些結(jié)果表明GhRab7參與了鹽脅迫響應過程。

圖4 異源表達 GhRab7基因酵母細胞鹽響應分析Fig.4 Effect of GhRab7 expression in yeast under salt stresses

3 討 論

土壤鹽害擾亂植物細胞內(nèi)離子平衡、降低代謝活性，進而嚴重影響作物產(chǎn)量。植物通過調(diào)節(jié)生長和脅迫耐受性來適應或者避免不利的環(huán)境條件。棉花是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物。作為甜土植物，棉花比其他主要作物更耐受鹽脅迫[19]。然而，種植區(qū)土壤鹽堿化依然限制了棉花產(chǎn)量。已經(jīng)知道鹽脅迫誘導棉花GhSOS1基因的表達，擬南芥超表達GhSOS1轉(zhuǎn)基因植株通過維持低水平Na+/K+和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鹽脅迫響應基因的表達而長勢更好[20]；擬南芥超表達棉花GhTOM(G蛋白偶聯(lián)受體)、GhWRKY34(轉(zhuǎn)錄因子)和GhPLATZ1(鋅指類轉(zhuǎn)錄因子)也表現(xiàn)出更耐鹽表型[21-23]。棉花鹽脅迫響應基因的研究有助于優(yōu)化栽培種質(zhì)，提高棉纖維產(chǎn)量。

植物Rab蛋白參與花粉管生長[24]，葉片形態(tài)[25]，自噬[26]及抗病反應[25]等過程的調(diào)節(jié)。到目前為止，在酵母、哺乳動物和擬南芥中Rab相關成員調(diào)節(jié)質(zhì)膜運輸研究的比較清楚，然而棉花中Rab蛋白功能還沒有很好的研究。此外，雖然Rab基因的保守性較高，但不同物種Rab基因個數(shù)和基因結(jié)構差異比較大[8]，不同植物Rab基因的研究將為Rab功能挖掘和應用到生產(chǎn)奠定 基礎。

本研究從陸地棉中鑒定了一個Rab相關基因GhRab7；該基因編碼蛋白含有5個保守的G區(qū)基序，這些基序在蛋白質(zhì)三級結(jié)構上聚集形成一個鳥苷酸結(jié)合及水解功能域，該功能域與Rab活性密切相關；同時，該蛋白C末端保守Cys殘基是Rab翻譯后異戊烯化修飾位點，該位點修飾情況決定Rab與膜系統(tǒng)的結(jié)合，進而影響胞內(nèi)囊泡融合過程[26]。

真核細胞主要通過膜上蛋白識別和感知外部環(huán)境信號，這些膜上蛋白包括能夠引起細胞對外界環(huán)境信號響應的受體和感受子。已知擬南芥和水稻Rab7作為小G蛋白信號分子感知及響應外界環(huán)境鹽脅迫[6,27]；轉(zhuǎn)錄因子通過識別順式作用元件來響應各種環(huán)境信號；GhRab7基因上游含有多個鹽脅迫響應順式作用元件，暗示該基因可能通過轉(zhuǎn)錄因子與這些順式作用元件結(jié)合來響應鹽脅迫，這還需要更多的試驗來證實。此外，酵母異源表達GhRab7也顯示出不耐鹽的特征。這些結(jié)果說明，棉花GhRab7可能具有響應非生物脅迫的能力。

本研究從棉花中克隆了GhRab7基因，該基因編碼一個Rab類小G蛋白，推測其可能通過調(diào)節(jié)囊泡運輸而介導脅迫響應過程。本研究結(jié)果為進一步明晰Rab類蛋白的生物學功能及脅迫響應調(diào)控機制奠定了基礎。