蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒病研究進(jìn)展

梁利 金湯東 張麗 刁青云 侯春生

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院， 北京 100081；3浙江慈溪市億園蜜蜂授粉專業(yè)合作社，慈溪 315334）

1 引言

蜜蜂是與人類以及大自然密切相關(guān)的社會(huì)性昆蟲，它不僅可以為人類提供營養(yǎng)價(jià)值高的蜂產(chǎn)品，而且通過為開花植物授粉維持生態(tài)平衡，對(duì)保護(hù)和維持生物多樣性起著十分重要的作用[1]。但是蜜蜂是社會(huì)性昆蟲，易受到病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲的威脅，嚴(yán)重影響蜂群的健康發(fā)展。除此之外，病害的發(fā)生易導(dǎo)致亂用藥，影響蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，進(jìn)而給蜂農(nóng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在蜜蜂的多種病原中，病毒由于分子小、易突變的特點(diǎn)而備受關(guān)注。目前已分離得到的蜜蜂病毒至少有20種，大多數(shù)為小RNA病毒，至少有9種病毒已完成了全基因組測(cè)序[3]。其中黑蜂王臺(tái)病毒（BQCV）是引起蜂王幼蟲及蛹感染的主要病原，該病原通過黑化蜂王幼蟲并可導(dǎo)致巢房變黑，進(jìn)而引發(fā)蜂王壞死于巢房內(nèi)。大量研究發(fā)現(xiàn)，BQCV的流行與蜜蜂卷翅病毒（Deformed Wing Virus，DWV）及Nosema ceranae等其他病原的發(fā)生具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

2 病原學(xué)

BQCV首次分離于蜂王的幼蟲和蛹，在死亡的蜂蛹中依然可以檢測(cè)到[4]。BQCV屬于微小核糖核酸病毒，是單鏈正義RNA病毒[5]，2002年Mayo[6]首次將其歸于雙順反子病毒科（Dicistroviridae），蟋蟀麻痹病毒屬（Cripavirus）。其病毒粒子直徑約30nm，結(jié)構(gòu)為正二十面體圓形，無囊膜。Leat等人在2000年首次完成全基因組序列測(cè)序，證實(shí)該序列包括ORF1和ORF2兩個(gè)閱讀框，ORF1與ORF2之間存在一個(gè)非編碼區(qū)，為內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES），可啟動(dòng)ORF2的翻譯，同樣在5′端UTR也含有一個(gè)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)[7-11]?；蚪M結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 BQCV的基因組結(jié)構(gòu)圖

通過比較不同來源的BQCV基因組序列，發(fā)現(xiàn)ORF1序列更多樣，相似度低，而ORF2的同源性強(qiáng)，是高度保守序列。ORF2所編碼的VP1、VP2、VP3、VP4四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，保護(hù)病毒核酸，四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的分子量分別為34、42、29和6KDa。而ORF1主要由非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，包含解旋酶、3C樣半胱氨酸蛋白酶和依賴RNA的RNA聚合酶3種非結(jié)構(gòu)蛋白?；蚪M中5′端的連接蛋白和3′末端Ploy（A）具有保護(hù)和維持基因組穩(wěn)定的功能。

3 流行病學(xué)

3.1 流行范圍與種類

1977年Baily等[12]首先報(bào)道了BQCV。BQCV首次分離自死亡的蜂王幼蟲和蜂蛹，隨后在工蜂、雄蜂中都能檢測(cè)到該病毒，Tentchev等[13]首次用PCR技術(shù)檢測(cè)法國地區(qū)疑似健康的蜂群，證實(shí)了蜂群中有6種蜜蜂病毒的存在，包括BQCV，表明BQCV在蜂群中大多建立的為隱性感染。研究結(jié)果表明，BQCV對(duì)成年工蜂的感染率是86%，對(duì)蛹的感染率為23%，但工蜂等成年蜂并不會(huì)發(fā)病，沒有表現(xiàn)明顯的疾病癥狀，在染病的工蜂腸道中可以檢測(cè)到該病毒，但含量很低[9]。這些都證實(shí)工蜂攜帶了BQCV，但是通過接觸或喂飼可能感染蛹和蜂王幼蟲。國際上對(duì)蜜蜂病毒流行調(diào)查起步較早。匈牙利學(xué)者采集了自1999年至2004年的蜂樣，檢測(cè)了DWV、BQCV、急性麻痹病毒（ABPV）、囊狀幼蟲病毒（SBV）、慢性麻痹病毒（CBPV）、卡什米爾病毒（KBV）6種常見的蜜蜂病毒，發(fā)現(xiàn)DWV和BQCV流行率分別為72%和54%[14]。同樣，在以色列的意蜂中BQCV流行率是最高的，達(dá)到75%[15]。而蜂群中最重要的個(gè)體-蜂王，也是感染蜜蜂病毒最嚴(yán)重的個(gè)體之一，并且在蜂王不同組織及糞便物中檢查DWV、BQCV、ABPV、SBV、CBPV、KBV的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)DWV和BQCV在中腸的感染水平最高，而SBV與CBPV在血淋巴的水平明顯高于其他組織[16]。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)BQCV在中國中蜂的感染率較高，在19個(gè)省中的6個(gè)省發(fā)現(xiàn)了BQCV，甘肅省感染率（98%）高于在河南?。?2%）的感染率。最近，刁青云等對(duì)我國部分省區(qū)的蜂樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BQCV是意蜂感染率最高的病毒[18]。另外，研究發(fā)現(xiàn)BQCV可以感染熊蜂等野生授粉昆蟲，發(fā)現(xiàn)DWV、BQCV、SBV和IAPV均存在于熊蜂中[19]。而對(duì)另一重要當(dāng)?shù)胤浞N薩凡納蜜蜂調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BQCV流行于南非23%的薩凡納蜜蜂（Apis mellifera scutellata）蜂群中，但不能檢測(cè)到ABPV、CBPV、DWV和SBV[20]。

3.2 傳播途徑

BQCV在蜜蜂的各種產(chǎn)物（蜂蜜、花粉、蜂王漿）中均可檢出，并能感染不同發(fā)育階段的蜜蜂，卵、幼蟲、蛹和成蟲都是感染對(duì)象[21]。研究表明，BQCV可通過水平和垂直途徑傳播，既可以在同一世代的不同個(gè)體間擴(kuò)散，又可以通過交配感染受精卵進(jìn)行垂直傳播[2]。同時(shí)，也存在潛在的載體傳播。

3.2.1 水平傳播

蜜蜂可以通過接觸、喂食、排泄物和唾液分泌物等傳播該病毒。陳彥平等[22]先后在蜂蜜樣品及蜂王的腸道內(nèi)檢測(cè)到BQCV。工蜂感染BQCV后無明顯病癥，但它們將病毒通過分泌的食物傳染給蜜蜂幼蟲。蜜蜂的很多行為，如護(hù)理蜂王、哺育幼蟲、貯蜜等過程都會(huì)增加病毒傳播的機(jī)會(huì)及蜜蜂在清理蜂房時(shí)，接觸帶病毒的糞便同樣也會(huì)被感染[2]。

3.2.2 潛在的載體傳播

蜜蜂微孢子蟲病也是引起蜜蜂健康問題的重要蜜蜂疾病之一[23]。BQCV主要引起蜂王幼蟲死亡，影響蜂王的預(yù)蛹期和封蓋期，Bailey等[24]還研究發(fā)現(xiàn)，蜂群BQCV的爆發(fā)可能與微孢子蟲病有關(guān)，觀察發(fā)現(xiàn)，感染該病毒的蜜蜂常伴有微孢子蟲感染。并且BQCV病毒可在患有微孢子蟲病的成年蜜蜂上快速繁殖，春夏兩季微孢子蟲病爆發(fā)率最高的時(shí)期，BQCV的感染率也較高。體內(nèi)存在BQCV的蜜蜂幼蟲或成年蜜蜂并不會(huì)表現(xiàn)相關(guān)癥狀，處于隱性感染階段，但當(dāng)微孢子蟲侵染蜂群時(shí)，BQCV開始活躍，并表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，春季和夏初是BQCV爆發(fā)的流行季節(jié)[4]。

外寄生性螨-狄斯瓦螨（Varroa destructor）是引起蜜蜂蜂群大量損失的重要因素之一。感染大量蜂螨的蜂群中均可以檢測(cè)到BQCV，表明可能是瓦螨通過吮吸蜜蜂血淋巴來削弱成蜂和蛹的免疫力，進(jìn)而加快BQCV的快速增殖[25]。

目前狄斯瓦螨與BQCV的互作關(guān)系還不是很明確。一方面，有些研究發(fā)現(xiàn)瓦螨和BQCV存在同時(shí)感染，可以作為病毒的傳播媒介，具有相關(guān)性。另一方面，Tentcheva[13]對(duì)于36個(gè)法國養(yǎng)蜂場(chǎng)的瓦螨樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：86%的螨樣未檢測(cè)到BQCV。因此，蜂螨與BQCV的互作關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

3.2.3 垂直傳播

蜂王是蜂群唯一的產(chǎn)卵蜂，蜂王的健康直接影響著蜂群的狀況，一旦蜂王染病將影響整個(gè)蜂群的健康發(fā)展。在蜜蜂的各個(gè)發(fā)育階段都可以檢測(cè)到BQCV，由于卵和幼蟲階段不會(huì)被瓦螨等寄生蟲寄生，當(dāng)病毒感染蜂王后，后代可以檢測(cè)到BQCV，推測(cè)病毒可以由蜂王垂直傳遞到卵。并且Chen等[26]將感染病毒的蜂王產(chǎn)的卵表面進(jìn)行消毒，然后檢測(cè)卵同樣發(fā)現(xiàn)了BQCV，也證實(shí)了BQCV可以通過蜂王垂直傳播給后代。另外，在雄蜂和其精液中也檢測(cè)到BQCV的存在，也為BQCV的垂直傳播提供了有力證據(jù)，但是目前沒有關(guān)于精子感染的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.3 感染癥狀與致病機(jī)制

BQCV感染蜜蜂后，蜂王預(yù)蛹期和封蓋期受到較大影響，患病的蜂王身體變白，再慢慢變?yōu)楹?，最后整個(gè)王臺(tái)也全部變黑。被BQCV感染的蜜蜂，行為失常，神經(jīng)系統(tǒng)受損，學(xué)習(xí)能力和記憶功能衰退，無法辨別方向，采蜜能力喪失，發(fā)病后期全身抽搐無法飛行而只能在地面爬行，感染的蜂王王臺(tái)壁和蜂蛹均會(huì)變?yōu)楹谏?。并且BQCV在被蜜蜂微孢子蟲感染的蜂王幼蟲中快速增殖，加快王臺(tái)變黑[27]。BQCV同樣可以感染野生成年蜜蜂，感染后的癥狀也表現(xiàn)為王臺(tái)壁變黑，在死亡的蜂蛹和幼蟲中可以檢測(cè)到不同濃度的BQCV病毒粒子，感染初期同感染囊狀幼蟲病死亡的幼蟲頗為相似，蜂蛹呈白黃色，包裹一層堅(jiān)韌的泡狀外皮。另外，對(duì)感染的蜜蜂組織進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)中腸的病毒水平最高，頭、淋巴、卵巢、精囊病毒濃度相對(duì)較低。

蜜蜂對(duì)于病毒病的防御是很有限的，或者我們對(duì)蜜蜂抵抗病毒的免疫機(jī)制了解的不夠。一方面，在進(jìn)化中，嗅覺基因相對(duì)豐富，其他功能基因退化，導(dǎo)致蜜蜂自身的防御機(jī)制很弱，細(xì)胞吞噬作用對(duì)于病毒作用有限，可能是因?yàn)椴《究梢栽谕淌杉?xì)胞中存活。另一方面，蜜蜂會(huì)同時(shí)感染其他疾病，弱化了相關(guān)的防御機(jī)制。BQCV和微孢子蟲病發(fā)病季節(jié)相同，微孢子蟲感染蜜蜂后會(huì)破壞中腸防御機(jī)制，從而使BQCV更加容易在中腸快速增殖。另外，微孢子蟲傳播的一個(gè)重要途徑是依靠糞便，從而很易使微孢子蟲與蜜蜂一起越冬，使得蜂群患病，也為BQCV的傳播提供了機(jī)會(huì)。BQCV的爆發(fā)往往會(huì)伴隨其他的蜜蜂病毒聯(lián)合致病，例如蜜蜂殘翅病毒、蜜蜂囊狀幼蟲病毒等蜜蜂病毒[28]。因此，其BQCV致病的機(jī)制仍未清晰，需要獲得單一病原，分別實(shí)驗(yàn)及互作研究才能明確其致病機(jī)理。

4 檢測(cè)方法

4.1 癥狀診斷

通過癥狀診斷是最廉價(jià)和方便的方法，但病毒感染的癥狀大多相似，當(dāng)出現(xiàn)明顯的癥狀時(shí)，病毒已經(jīng)大規(guī)模爆發(fā)。蜜蜂蜂群會(huì)受到多種疾病的侵染，癥狀復(fù)雜難以判斷，且癥狀相類似的病原很多，癥狀診斷并不可靠。因此，要獲得確切結(jié)果還需要RT-PCR檢測(cè)等分子手段。

4.2 基于免疫學(xué)的檢測(cè)技術(shù)

將病毒蛋白或純化病毒注入動(dòng)物體內(nèi)，待動(dòng)物產(chǎn)生該病毒的抗體后，回收含有抗體的血漿并加入特定反應(yīng)試劑后進(jìn)行顯色，這種方法價(jià)格低、檢測(cè)速度快，但各蜜蜂病毒基因組之間存在一定的同源性，所以該方法的特異性較差，不適用于蜜蜂病毒的精準(zhǔn)檢測(cè)[29]。

4.3 PCR檢測(cè)

RT-PCR定性檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，首先收集患病樣本，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過PCR儀擴(kuò)增后經(jīng)電泳、純化回收、提取質(zhì)粒、測(cè)序等一系列步驟可準(zhǔn)確鑒定出病毒種類[21]；而通過設(shè)計(jì)特異性探針的qRT-PCR定量檢測(cè)同樣適用于病毒檢測(cè)[30]。實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病毒，快速、準(zhǔn)確、方便，是目前主流的檢測(cè)方法。但是該方法對(duì)于樣本有一定要求，RNA容易降解，需要將樣本快速冷凍保存或在低溫下運(yùn)輸。

隨著PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，其快速、高效、簡便的優(yōu)點(diǎn)較為突出，多病毒同時(shí)檢測(cè)是目前的發(fā)展趨勢(shì)，Multiple RT-PCR[31]即多重RT-PCR在混合感染的鑒別診斷上具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值。但是多重PCR技術(shù)要求也較高，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較單一PCR復(fù)雜，技術(shù)難度大，因而在建立多重PCR反應(yīng)體系時(shí)，必須對(duì)其中的主要成分和反應(yīng)條件進(jìn)行系統(tǒng)性的優(yōu)化[32]。

5 總結(jié)

BQCV在世界各個(gè)國家地區(qū)的蜂群廣泛存在，BQCV在我國各省也均有分布，在國內(nèi)西方蜜蜂蜂群中的感染率高于東方蜜蜂蜂群，野生蜂群中的感染率高于商業(yè)蜂群，成年蜜蜂中的感染率高于蜜蜂幼蟲[14]。BQCV更易感染西方蜜蜂蜂群，更易感染成年工蜂，大多情況下建立隱性感染，而且BQCV常常與微孢子蟲和蜂螨共感染。大量研究已經(jīng)證實(shí)微孢子蟲和BQCV的共感染，導(dǎo)致蜜蜂大量死亡，嚴(yán)重削弱蜂群群勢(shì)，造成經(jīng)濟(jì)損失。目前無有效的手段治療BQCV，但可以通過控制微孢子蟲等寄生蟲間接干預(yù)BQCV在蜂群中的流行與傳播是一個(gè)可行的辦法[33]。BQCV可水平傳播（喂食、清理、接觸、哺育），也可以垂直傳播（交配），所以定期更換蜂王可以降低發(fā)病率和死亡率，提升蜂群抵抗力，減少蜂群的損失。另外，蜂群大多情況下只是攜帶病毒，當(dāng)遇到外界壓力因素，才會(huì)激活病毒快速增殖。因此，健康的管理方式，如保證食物充足、調(diào)節(jié)溫濕度、做好消毒工作等日常管理工作，是避免病毒爆發(fā)的關(guān)鍵。另外，BQCV的基因組已經(jīng)被解析，對(duì)于其結(jié)構(gòu)也有了更深入的了解，未來可以從基因角度治療或防御BQCV。同時(shí)，加強(qiáng)BQCV與其他重要病原的互作研究也將為深入探討B(tài)QCV的致病機(jī)制提供重要的理論指導(dǎo)。

致謝本項(xiàng)目得到浙江省寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助（2017C10011）。