云南榧樹(shù)內(nèi)生真菌的分離

胡璟如

（玉溪市不動(dòng)產(chǎn)登記中心（玉溪市基礎(chǔ)地理信息中心），云南 玉溪 653100）

1 前言

1.1 植物內(nèi)生真菌的定義

植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指在健康植物寄生的，在各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中度過(guò)全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌[1]，這是內(nèi)生真菌的廣義定義，包括了菌根真菌和所有植物病原菌在內(nèi)的一個(gè)大類群。目前的內(nèi)生真菌研究中，多數(shù)研究者傾向于一種狹義的概念——植物內(nèi)生真菌是生活在地上部分活的植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的一類真菌[2]。

1.2 植物內(nèi)生真菌的應(yīng)用

目前，內(nèi)生真菌的研究主要集中在2個(gè)方面：（1）植物中的內(nèi)生真菌對(duì)植物本身的影響，（2）對(duì)植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究。重點(diǎn)是發(fā)現(xiàn)具有各種生物活性的新的化合物[3]。

內(nèi)生真菌分布于植物組織內(nèi)，可獲得足夠的碳源、氮源，而且受到植物組織的良好保護(hù)，因而比暴露于惡劣環(huán)境的附生菌和腐生菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于發(fā)揮作用[4]。

2 試驗(yàn)?zāi)康呐c方法

2.1 試驗(yàn)?zāi)康呐c意義

云南榧樹(shù)（Torreya yunnanensis）屬于紅豆杉科的榧樹(shù)屬，主要分布于云南西北部的麗江、維西、貢山、中甸等地，是珍稀瀕危物種。云南榧樹(shù)不僅經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，其醫(yī)用、藥用價(jià)值也很高。本試驗(yàn)基于云南榧樹(shù)的藥用功能，分離其內(nèi)生真菌，旨在能分離純化出對(duì)醫(yī)用、藥用研究有益的真菌。

2.2 試驗(yàn)材料和設(shè)備

2.2.1 材料與試劑。云南榧樹(shù)：研究樣品采集自云南省迪慶州維西縣，選用無(wú)可見(jiàn)病斑的、健康的云南榧樹(shù)莖和葉；無(wú)菌水、馬鈴薯、瓊脂、蔗糖、硫酸鏈霉素、75%的酒精、0.13%的升汞、水。

2.2.2 培養(yǎng)基。真菌的培養(yǎng)采用PDA瓊脂培養(yǎng)基，PDA的配方為：去皮馬鈴薯200g，瓊脂12～15g，蔗糖20g。

2.2.3 儀器與設(shè)備。無(wú)菌材料袋、封口膜、報(bào)紙、棉線、燒杯、錐形瓶、培養(yǎng)皿、試管、量筒、試紙、酒精燈、打火機(jī)、鑷子、解剖刀、解剖剪、解剖針、電子天平、普通天平、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、微波爐以及冰箱等。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 培養(yǎng)基的配置及準(zhǔn)備。去皮馬鈴薯200g，加水熬出馬鈴薯汁；取15g瓊脂，將瓊脂加水后加熱使之溶解；將馬鈴薯汁和瓊脂混合后加入20g蔗糖，待蔗糖溶解后，加蒸餾水定容至1L。溶液配好后測(cè)試其pH值，要求其pH值約為5.6～5.8，若其pH值不在此范圍內(nèi)，用1moL/L的HCL或1moL/L的NaOH調(diào)節(jié)。

為了確定植物內(nèi)部環(huán)境對(duì)內(nèi)生真菌的培養(yǎng)有無(wú)更好的效果，用同樣的步驟配置1份PDA培養(yǎng)基，但在定容時(shí)用云南榧樹(shù)莖、葉熬的汁定容。用蒸餾水定容的培養(yǎng)基記為“PDA（水）”，用云南榧樹(shù)汁定容的培養(yǎng)基記為“PDA（汁）”。

將制作好PDA培養(yǎng)基分裝在500mL的錐形瓶里，用封口膜和報(bào)紙將瓶口封好；用報(bào)紙包好試驗(yàn)過(guò)程中所用的相關(guān)器械用品；取5瓶蒸餾水用封口膜和報(bào)紙封好；把培養(yǎng)基、蒸餾水和相關(guān)器械用品放入高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行121℃高溫高壓滅菌30min，以備使用。

2.3.2 內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)。（1）操作過(guò)程。①在超凈工作臺(tái)上，將云南榧樹(shù)莖和葉用75%的酒精漂洗5min，再用0.13%的升汞浸泡15min進(jìn)行材料表面消毒，接著用滅菌后的蒸餾水漂洗4次，清除材料表面的消毒液；②在滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿中將葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，且葉片兩端都要用解剖刀切出切口以便內(nèi)生真菌的長(zhǎng)出；將嫩莖切成0.5cm的小段，把老莖的莖皮用解剖刀取下切成0.5cm×0.5cm的小塊，分別置于PDA（水）和PDA（汁）培養(yǎng)基上，每皿3～5塊，再用封口膜把培養(yǎng)皿封好；再取1皿PDA（水）和1皿PDA（汁）培養(yǎng)基，對(duì)所消毒材料沖洗后的第4次無(wú)菌水進(jìn)行涂板培養(yǎng)，以作空白對(duì)照；③避光培養(yǎng)3～7d，每天觀察。

2.3.3 內(nèi)生真菌的純化。取切口處新長(zhǎng)出的菌絲，及時(shí)轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上，每種菌絲轉(zhuǎn)接2皿。新鮮PDA原料為PDA（水），但在PDA（水）里加入硫酸鏈霉素抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，便于得到純真菌。待新的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌絲后，再轉(zhuǎn)接至新鮮PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)多次得到形態(tài)完全一致的單菌落即純化的內(nèi)生真菌。

2.3.4 內(nèi)生真菌的保存。①試管斜面保存。把純化的真菌轉(zhuǎn)接至試管內(nèi)，每株轉(zhuǎn)接3支，用報(bào)紙包好放入冰箱內(nèi)保存。培養(yǎng)皿用封口膜緊封住。②甘油冷凍保藏。試管斜面只能作菌株臨時(shí)保存，為了使分離的菌種能長(zhǎng)期保存，也對(duì)10株內(nèi)生真菌進(jìn)行甘油冷凍保藏。

20%（V/V）甘油的制備：取20mL甘油加入80mL蒸餾水，混勻。用注射器分別取1.8 mL加入凍存管中，放入凍存盒，高溫高壓滅菌30min，冷卻后備用。每支甘油管中放3～4塊帶菌培養(yǎng)基，放入4℃冰箱冷藏24h后，轉(zhuǎn)入-20℃冷凍24h，結(jié)冰后轉(zhuǎn)入-40℃冰柜長(zhǎng)期保存。

3 結(jié)果與討論

根據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明：用云南榧樹(shù)莖、葉熬的汁定容的PDA和用蒸餾水定容的PDA對(duì)云南榧樹(shù)內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)影響不大；在所選3種材料中，最先長(zhǎng)出內(nèi)生真菌的是莖皮，接著是嫩莖，最后是葉片。不同的內(nèi)生真菌在生長(zhǎng)后期表現(xiàn)出較大的差異，生長(zhǎng)前期菌絲多為白色，后期菌絲多能夠產(chǎn)生色素，而且形態(tài)不一。

（1）內(nèi)生真菌系統(tǒng)地分布于植物體根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等器官、組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙。近年來(lái)，已從宿主植物的根、莖、葉及儲(chǔ)藏器官內(nèi)分離到大量?jī)?nèi)生真菌。該試驗(yàn)從云南榧樹(shù)植株莖皮、嫩莖中分離出真菌數(shù)量較多，從葉中分離出少量?jī)?nèi)生真菌；葉中分離的內(nèi)生真菌數(shù)量少是因?yàn)楸旧砣~片真菌數(shù)量就少，還是因?yàn)槿~片切口與培養(yǎng)基的接觸面積過(guò)小還有待探究。

（2）在內(nèi)生真菌分離過(guò)程中，檢測(cè)超凈臺(tái)內(nèi)環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)十分必要，否則空氣中的雜菌落到材料表面，且長(zhǎng)出菌落，就無(wú)法察覺(jué)，而且單設(shè)漂洗液檢驗(yàn)法、組織印跡法或組織壓入法為對(duì)照處理都不嚴(yán)密，因此應(yīng)同時(shí)設(shè)置超凈工作臺(tái)無(wú)菌狀態(tài)檢測(cè)對(duì)照、漂洗液無(wú)菌檢驗(yàn)對(duì)照和組織印跡無(wú)菌檢測(cè)對(duì)照3種對(duì)照處理，以確保準(zhǔn)確分離植物內(nèi)生真菌。

（3）菌種保藏主要是根據(jù)微生物生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使微生物代謝處于不活潑、生長(zhǎng)繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。好的保藏方法首先應(yīng)能長(zhǎng)期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮到方法本身的簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。斜面保藏也稱傳代培養(yǎng)保藏法，此法操作簡(jiǎn)單，但保存時(shí)間短，需要經(jīng)常移種，易于變異，只能作為菌種的短期保藏。而甘油冷凍保藏法簡(jiǎn)單有效，保藏時(shí)間可達(dá)2～10年。為菌種的長(zhǎng)期保存和后續(xù)研究提供了便利。

（4）本次研究以云南榧樹(shù)為研究對(duì)象，對(duì)其內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離和保藏，為藥用相關(guān)活性物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]楊潤(rùn)亞，馮培勇，李清.植物內(nèi)生真菌農(nóng)藥活性的研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥，2006（7）

[2]唐雪輝，毛凱，于友民，等.植物內(nèi)生真菌的應(yīng)用研究概況[J].草原與草坪，2005（5）

[3]任愛(ài)梅，張麗珂，孟憲剛.植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展與存在問(wèn)題[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）

[4]陳法軍，黃永青，葉萬(wàn)輝.內(nèi)生真菌及其意義[J].微生物學(xué)報(bào)，2003（5）