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    金釵石斛莖段誘導(dǎo)叢生芽的探究

    2019-11-19 09:39鄧坦甘婕
    綠色科技 2019年15期

    鄧坦 甘婕

    摘要:以金釵石斛一年生莖段組織為外植體,采用不同種類的培養(yǎng)基與不同配比的添加物進(jìn)行了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:以MS培養(yǎng)基-+-6-BA0.5mg/L+NAA 0.3rag/L+1g/L活性炭,加入10%的馬鈴薯作為天然添加物,pH值為5.8時(shí),是金釵石斛叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

    關(guān)鍵詞:金釵石斛;莖段;叢生芽誘導(dǎo)

    中圖分類號(hào):$641.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1674-9944(2019)15-0102-04

    1引言

    金釵石斛(Dendrobium nobile LindI),屬于蘭科植物,多年生草本,其莖含有生物堿,主要為石斛堿(den-drobine)、6-羥基石斛堿(6-hydroxydendrobine)、石斛次堿(nobilonine)、多糖和多種游離氨基酸等。金釵石斛總生物堿的含量多達(dá)0.755%,多糖含量高達(dá)22.5%,屬于上品藥用石斛。研究顯示:金釵石斛含藥用成分有15種之多,性不熱、不溫、不涼,養(yǎng)胃、清熱解毒、止咳清肺、軟化血管等多重功效,需求量大,前景好。金釵石斛的花奇特并且鮮艷,因此具有觀賞價(jià)值。金釵石斛能進(jìn)行光合作用的有效面積小,光合效率較低,生長(zhǎng)發(fā)育速率低,對(duì)氣候條件要求非??量?,在自然的條件下金釵石斛需要與某些真菌互利共生才能生長(zhǎng),因此對(duì)于苗的栽培往往很難實(shí)現(xiàn),而過去采用的分株、扦插等方式的繁殖率較低,金釵石斛的供需不平衡,當(dāng)下我國(guó)將其列為中藥植物重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象。目前國(guó)內(nèi)主要采用快繁的方式來(lái)克服并解決各類石斛的供需問題,因此,金釵石斛的組織培養(yǎng)至關(guān)重要,這是實(shí)現(xiàn)金釵石斛大規(guī)模繁殖的途徑之一。本研究有助于探索如何快速培養(yǎng)金釵石斛,因此采用金釵石斛的莖段組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo),確保金釵石斛的供應(yīng)。

    2材料與方法

    2.1實(shí)驗(yàn)材料

    本次實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源于赤水金釵石斛栽培基地,通過移栽培育苗到實(shí)驗(yàn)室種植,以供實(shí)驗(yàn)使用。

    2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    2.2.1第一組設(shè)計(jì)

    不同植物提取液的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

    選取金釵石斛莖幼嫩的莖段部分,將外植體放人不同植物提取液的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)狀況,從中選出莖段組織芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

    2.2.2第二組設(shè)計(jì)

    不同植物提取液的培養(yǎng)基在加入活性炭后對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

    選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分,將外植體放入不同的植物提取液在加入活性炭的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察其生長(zhǎng)狀況,并對(duì)比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的萌芽率情況,從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

    2.2.3第三組設(shè)計(jì)

    相同的植物提取液對(duì)比活性炭的有無(wú)對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的影響。

    選取金釵石斛莖的幼嫩的莖段部分,將外植體放入相同的植物提取液的培養(yǎng)基中培養(yǎng),但是其中一組加入活性炭,對(duì)比在只加入植物提取液和加入植物提取液和活性炭的生長(zhǎng)情況,從而選出最適合金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

    2.2.4分組實(shí)驗(yàn)

    將此次實(shí)驗(yàn)分為三大組(表1)。

    3實(shí)驗(yàn)過程

    3.1接種前接種室的準(zhǔn)備

    首先接種室要時(shí)刻保持干凈,接種前要對(duì)接種室進(jìn)行清潔,清掃干凈每個(gè)角落,并用酒精擦拭地板,將酒精燈、濾紙、酒精棉球、75%酒精、無(wú)菌水、鑷子、手術(shù)刀等實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)工具器械放入超凈工作臺(tái)。打開超凈工作臺(tái)里的紫外燈和接種室內(nèi)的紫外燈進(jìn)行消毒滅菌,照射2h。照射時(shí)間到后將紫外燈關(guān)閉,并打開超凈工作臺(tái),風(fēng)機(jī)適度風(fēng)力吹5~6min后,即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    3.2外植體處理和接種

    選出沒有病害且長(zhǎng)勢(shì)好的當(dāng)年生長(zhǎng)的幼莖,將節(jié)上的葉片去掉,再置于燒杯中,用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗10min,沖洗后再放入洗潔精溶液中清洗2min,再用自來(lái)水沖洗一次,再用無(wú)菌水將其漂洗3次(使外植體的大量菌流走),最后置于干凈的燒杯接種備用。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作前,將雙手用酒精仔細(xì)消毒,以防止一開始就將細(xì)菌帶入超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)上,首先將工作臺(tái)擦拭干凈,將酒精燈點(diǎn)燃,將濾紙擺放好,將準(zhǔn)備好的金釵石斛的莖段組織放在濾紙上,用實(shí)驗(yàn)工具將其切成大小適中的小節(jié),長(zhǎng)約為5cm,方便進(jìn)行消毒滅菌,將切好的莖段組織放進(jìn)錐形瓶中,倒入75%的酒精搖蕩處理30s,處理時(shí)間到后立即倒出酒精并及時(shí)倒入無(wú)菌水,然后反復(fù)清理潤(rùn)洗2~3次,再加入準(zhǔn)備好的0.1%升汞處理材料8min。實(shí)驗(yàn)操作過程中,要來(lái)回、反復(fù)的搖動(dòng)錐形瓶,保證材料能夠充分滅菌,處理時(shí)間到后將升汞倒人回收瓶,并用無(wú)菌水清洗2~3次。最后將材料取出放在濾紙上并切成帶節(jié)的小段,每段約長(zhǎng)為1.5cm,之后接入培養(yǎng)基中,一瓶培養(yǎng)基接種一小段或兩段。為避免相互污染,接種完后對(duì)其進(jìn)行編號(hào),然后放入培養(yǎng)室對(duì)其進(jìn)行觀察、記錄生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。接種過程中所用實(shí)驗(yàn)工具都要進(jìn)行高溫滅菌,盡量避免交叉接觸,在實(shí)驗(yàn)中,操作要輕、慢,以減少污染率。

    3.3培養(yǎng)條件

    適宜的培養(yǎng)條件對(duì)金釵石斛的組織培養(yǎng)非常重要,因此我們選擇將接種好的外植體置于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25~28℃,每天用日光燈照射12h,光照強(qiáng)度為2000Lx,并定期觀察莖段組織的生長(zhǎng)情況。

    4結(jié)果與分析

    4.1不同植物提取液對(duì)金釵石斛莖段組織芽誘導(dǎo)的結(jié)果

    5討論

    本次實(shí)驗(yàn)采用不同添加物的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛莖段組織進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo),以不同的培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛叢生芽的情況來(lái)選出最適合繁殖金釵石斛的方法。通過3種不同添加物對(duì)金釵石斛莖段組織的叢生芽誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過60d的培養(yǎng),可以明顯觀察到區(qū)別。通過表2我們可以得知,馬鈴薯有利于誘導(dǎo)芽的增殖,其中以MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L-t-10%馬鈴薯培養(yǎng)基最佳;在第一組實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,加入了活性炭進(jìn)行對(duì)比,由此,通過表3可以得知MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯在加人1g/L活性炭時(shí)為最佳;最后,單獨(dú)將5種不同的培養(yǎng)基進(jìn)一步的進(jìn)行對(duì)比,可以發(fā)現(xiàn)MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+10%馬鈴薯+1g/-活性炭培養(yǎng)基的誘導(dǎo)芽數(shù)最高。

    適宜的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基對(duì)金釵石斛的莖段組織叢生芽的培養(yǎng)和快速繁殖十分重要,通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)我們可以清楚地發(fā)現(xiàn)在添加活性炭后莖段組織從生芽的數(shù)量顯著增加,這是由于活性炭吸附了莖段組織叢生芽增殖中代謝過程中的廢棄物,促進(jìn)金釵石斛的形態(tài)發(fā)生和器官形成。馬鈴薯能促進(jìn)莖段組織叢生芽的分化,在添加馬鈴薯的培養(yǎng)基中再加入活性炭,此時(shí)對(duì)于金釵石斛莖段組織叢生芽的生長(zhǎng)效果更為顯著。金釵石斛的莖段組織在添加香蕉汁后對(duì)于叢生芽的增殖有明顯的壓制影響作用,造成這種現(xiàn)象很可能是因?yàn)橄憬吨泻袑?duì)莖段組織叢生芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)的抑制性物質(zhì),但香蕉汁能使根系生長(zhǎng)的粗壯,對(duì)于莖段組織的叢生芽增值、分化沒有明顯的作用。

    在叢生芽誘導(dǎo)的過程中,消毒、滅菌是一項(xiàng)十分重要的工作,關(guān)系到整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。本次實(shí)驗(yàn)的污染率比較高,其中一些污染菌類是分散在培養(yǎng)基中,也有一些是從材料周圍長(zhǎng)起。污染的原因很可能是由于接種使用的實(shí)驗(yàn)工具器械的滅菌不徹底、接種時(shí)瓶的開口時(shí)間太長(zhǎng)、接種室內(nèi)物品擺放雜亂、接種室紫外燈的滅菌時(shí)間太短、接種材料沒有進(jìn)行徹底的滅菌、材料自帶的共生菌等原因。

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