放射性污染條件下土壤微生物活性及群落功能多樣性特征

王麗超，江世杰，黎先發(fā)

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010）

【研究意義】 目前我國對水冶過程中產(chǎn)生的廢棄物通常采用集中堆放在具備防滲漏措施的尾礦庫中的方式[1-2]。尾礦庫采取了一系列的保障措施來保障其安全[3]，即便如此，尾礦中的放射性核素仍會通過各種化學(xué)途徑具備溶解性，緩慢的向周邊的自然環(huán)境中釋放，給周邊生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來潛在的危害[4]，因此監(jiān)測及評估鈾尾礦周邊土壤的質(zhì)量具有非常重要的意義[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】 土壤微生物作為土壤分解系統(tǒng)的主要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)中有著不可替代的重要地位[6]。土壤微生物生物量是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍、最敏感的部分，同時微生物生物量在維持土壤中大量酶過程和保護(hù)能量、營養(yǎng)方面起到關(guān)鍵作用[7]?；谕寥牢⑸锛捌鋮⑴c的生化過程對污染物表現(xiàn)出的敏感性，可以采用微生物學(xué)指標(biāo)來預(yù)測土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化特征[8]。將微生物的變化特征作為監(jiān)測土壤質(zhì)量變化、表征土壤生態(tài)系統(tǒng)群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，被人們在生態(tài)學(xué)、土壤生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域廣泛接受和應(yīng)用[9-11]。另外，研究重金屬污染對土壤微生物多樣性的影響，一直以來都受到研究人員的青睞。通過研究重金屬脅迫對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化，以及微生物對重金屬的解毒機(jī)制，建立重金屬劑量與生物反應(yīng)的關(guān)系，為制定土壤重金屬污染閾值和修復(fù)指標(biāo)提供依據(jù)[12]。

【本研究切入點】 目前，國內(nèi)雖然已有關(guān)于鈾尾礦安全監(jiān)測方面的研究，但是大多數(shù)集中在鈾尾礦中核素遷移規(guī)律及遷移機(jī)理等方面的研究[13-15]，有關(guān)放射性污染對土壤微生物活性及多樣性的研究報道甚少。為此，本研究以我國某典型鈾尾礦庫中所取土壤為研究對象，使用微生物活性測定方法和Biolog-Eco技術(shù)對土壤微生物活性及群落功能多樣性進(jìn)行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 探討放射性污染劑量與微生物活性及群落功能多樣性的內(nèi)在聯(lián)系，從而為放射性污染土壤生物修復(fù)及構(gòu)建微生物土壤環(huán)境質(zhì)量評價體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗土樣于2013年初采集于我國某典型尾礦庫地區(qū)。前期查閱大量環(huán)評資料及前期的研究基礎(chǔ)材料，按照放射性核素U的含量高低設(shè)置6個取樣區(qū)域。使用土樣采集器沿“S”型路線按0～15 cm土層深度取樣，土樣置于聚乙烯保鮮袋，24 h內(nèi)置于4℃冰箱保存。在實驗室內(nèi)，將土樣分為兩部分，分別測定微生物活性、土壤基本理化性質(zhì)、放射性核素含量等相關(guān)指標(biāo)（表1、表2）。選取遠(yuǎn)離鈾尾礦初期壩的上游土壤作為對照，設(shè)為1號。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤微生物活性指標(biāo)測定 微生物基礎(chǔ)呼吸、土壤微生物量碳、氮含量測試方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.2.2 土壤微生物群落功能多樣性測定 采用有96個孔、31種碳源、其中一組為對照的生態(tài)板（Biolog-ECO）分析微生物群落功能多樣性特征。ECO板接種液的制備參照李芳蘭等[17]的方法。先將待測土樣于25 ℃下預(yù)培養(yǎng)24 h，取等同于干重10 g土樣與90 mL 0.85 mol/L NaC1溶液混勻，250 r/min震蕩培養(yǎng)30 min，將上清液用NaC1溶液稀釋1 000倍。ECO板中各孔加樣量為150 uL，設(shè)置3個平行，25 ℃下恒溫培養(yǎng)8 d，分別在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168、192 h， 波 長為590 nm下讀數(shù)，ECO板使用前需預(yù)熱0.5 h。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table1 Physical and chemical properties of soil samples

表2 土壤中放射性核素的含量Table2 Content of radioactive nuclides in soils

豐富度指數(shù)（S）指每孔中(Ci-R)的值大于0.25的孔數(shù)[8]，其中Ci為每個有培養(yǎng)基孔的光密度值；R為對照孔的光密度值；n為培養(yǎng)基碳源種類，本研究中為31；Pi為(Ci -R) 的值大于0.25的孔數(shù)與整板總差的比值。

試驗數(shù)據(jù)采用Origin7.5、SPSS20.0軟件進(jìn)行處理及作圖和統(tǒng)計分析[18-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放射性污染土壤微生物活性變化 大量研究通過土壤微生物量、基礎(chǔ)呼吸、代謝熵以及微生物熵來解釋土壤污染程度，本試驗的土壤微生物活性分析結(jié)果（表3）顯示，各指標(biāo)隨污染程度的變化存在一定程度上的差異。其中，微生物量碳（MBC）并不是簡單隨著污染程度的增加而逐漸降低，相反3、5、6號土樣的微生物量碳（MBC）竟高于對照；各土樣的微生物量氮（MBN）相比對照下降了16.09%～32.90%，除3號土樣外，其他各取樣點的基礎(chǔ)呼吸和代謝熵相比對照分別下降16.49%～32.90%、2.01%～69.12%；各取樣點的微生物熵分別是對照的2.50～3.75倍。相關(guān)性分析結(jié)果（表4）表明，U、Ra與各指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，但未達(dá)到顯著水平。土壤微生物活性指標(biāo)差異研究結(jié)果表明，2號取樣點MBC與其余各點差異顯著，1號取樣點MBN和微生物熵均表現(xiàn)出與其余各點差異顯著；對于微生物基礎(chǔ)呼吸來說，除4號與6號取樣點間差異不顯著外，其余各點均表現(xiàn)為差異顯著；5號和3號取樣點微生物代謝熵與其余各點間差異顯著。

表3 土壤微生物活性指標(biāo)Table 3 Soil microbial activity indicators

表4 放射性核素與微生物參數(shù)的相關(guān)性Table 4 Correlation between radioactive nuclides and microbial parameters

2.2 不同放射性污染土壤中微生物群落功能多樣性的變化

2.2.1 微生物群落代謝剖面AWCD的變化 AWCD反映土壤微生物代謝活性，是測定土壤微生物碳源利用能力的重要指標(biāo)[18]。從圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，AWCD值也呈現(xiàn)不同程度的增加。第一個轉(zhuǎn)折點發(fā)生在培養(yǎng)48 h，1、6號土樣的AWCD呈明顯升高的趨勢；第二個轉(zhuǎn)折點發(fā)生在培養(yǎng)72 h，2、3、4號土樣AWCD持續(xù)升高直到培養(yǎng)144 h，這種變化趨于平穩(wěn)直到試驗結(jié)束，除6號樣品外，其他各點的AWCD值變化速度(斜率)和最終AWCD值比對照均有不同程度的下降?？傮w來看，當(dāng)AWCD值開始增加時，各樣品的AWCD值增加趨勢不同，對照和6號土樣的變化速率相對較快，其余各點在整個培養(yǎng)階段活性都處于一個較低的水平。表明6號土樣AWCD最大值及變化速度在整個培養(yǎng)過程中都顯著高于對照1號土樣，其原因可能是低濃度的Ra造成的逆境，刺激微生物代謝增加的原因。

圖1 土壤微生物平均吸光值變化Fig.1 Changes in average well color development(AWCD) values of soil microbes

2.2.2 微生物對不同碳源的利用特征 根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)把生態(tài)板上的31種碳源分為6類，即酚酸類、碳水化合物類、羧酸類、氨基酸類、碳水化合物類胺類[21]?？梢圆捎猛寥牢⑸镌谏鷳B(tài)板上培養(yǎng)168 h的數(shù)值進(jìn)行主成分分析，進(jìn)而比較土壤微生物對不同碳源的利用特征。31種因子中提取的5個主成分因子，累計貢獻(xiàn)率達(dá)99.290%，分別可以解釋所有變量方差的27.472%和25.901%、23.673%、12.860%、9.385%。不同程度污染土壤主成分分析結(jié)果（圖2）表明，各取樣點與對照點微生物群落有明顯的差別，說明放射性污染使土壤微生物生理代謝產(chǎn)生了明顯的變化。從表5可以看出，PC1載荷表現(xiàn)較高的碳源共有9種，其中3種氨基酸，3種碳水化合物，2種羧酸類，1種胺類；PC2載荷表現(xiàn)較高的碳源共有9種，其中3種氨基酸，碳水化合物和羧酸類各2種，多聚物和酚酸類各1種；PC3載荷表現(xiàn)較高的碳源共有6種，其中3種碳水化合物，酚酸類、胺類、多聚物各1種，表明碳水化合物和氨基酸在PC1和PC2上的權(quán)重較大，在PC3上碳水化合物的權(quán)重較大。由此可見，各取樣點微生物群落代謝利用碳源差異主要表現(xiàn)在為碳水化合物類，其次是氨基酸類以及其他碳源類型。

圖 2 土壤微生物碳源利用類型的主成分分析Fig.2 Principal components analysis of carbon utilization by soil microbes

2.2.3 微生物多樣性指數(shù)分析 采用培養(yǎng)168 h的測定數(shù)據(jù)計算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)，其中，Shannon多樣性指數(shù)表示在顏色變化率一致的情況下，整個生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物群落利用碳源類型的多與少[22]。從表6可以看出，除6號土樣的各指標(biāo)較對照稍大，其他各點的Shannon指數(shù)（H）、Simpson 指數(shù)（D）、豐富度指數(shù)（S）與對照相比分別下降5.26%～30.53%、28.73%～90.55%、57.14%～100%，值得注意的是5號土樣，因其（C-R）＜0.25，故將其豐富度記作0。從相關(guān)性分析（表4）可以看出，放射性核素U與各功能指數(shù)的相關(guān)性不明顯，而Ra與Shannon指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）呈顯著負(fù)相關(guān)，以上結(jié)論可以從一定程度上說明放射性核素對微生物多樣性產(chǎn)生了一定的影響。

表5 土壤微生物碳源利用主成分1、2、3載荷較高的碳源Table 5 Variable loading characteristics of high principal components for carbon source utilization by soil microbes

表6 土壤微生物功能多樣性指數(shù)Table 6 Functional diversity indicators of soil microbes

3 討論

土壤微生物生物量、基礎(chǔ)呼吸、代謝熵、微生物熵等微生物生理生態(tài)參數(shù)是近年來用的較多的評估土壤環(huán)境質(zhì)量的指標(biāo)。一般來說，土壤微生物量與土壤污染元素呈顯著負(fù)相關(guān)，張涪平等[23]研究了藏中礦區(qū)重金屬對土壤微生物量的影響，結(jié)果表明土壤的微生物生物量受到重金屬污染的嚴(yán)重影響，隨著土壤重金屬含量的增加，土壤微生物量碳氮逐漸下降；也有研究稱礦區(qū)周邊的中低濃度的區(qū)域微生物量也明顯減少[24]。本試驗結(jié)果顯示土壤微生物量與放射性核素的相關(guān)性不明顯，而且5號取樣點的土壤微生物量碳比對照高，可是Biolog結(jié)果顯示其活性較低，這一結(jié)果也明反映土壤放射性核素污染對土壤微生物活性的影響是復(fù)雜的，研究結(jié)果差異較大，有時甚至相互矛盾[25]，其具體原因有待進(jìn)一步探討。土壤基礎(chǔ)呼吸代表土壤碳素的周轉(zhuǎn)的速率及微生物的總體活性，與土壤環(huán)境質(zhì)量有著密切的關(guān)系；代謝熵把微生物生物量和微生物活性結(jié)合起來。本研究中供試土壤的基礎(chǔ)呼吸、代謝熵以及微生物熵都高于對照，可能是由于微生物可以保持極低的基質(zhì)利用率。相關(guān)性分析表明放射性核素與微生物熵呈正相關(guān)關(guān)系，在一定程度上說明放射性核素對環(huán)境造成了脅迫效應(yīng)，使微生物活性發(fā)生了變化，從而改變了土壤的肥力和質(zhì)量，這與JúLIA等[26]的研究結(jié)果相似。

土壤微生物群落功能多樣性是反應(yīng)礦區(qū)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定性的重要指示因子之一，污染程度不同的土壤微生物群落碳源利用的能力是不同，土壤微生物群落利用碳源類型的多與少可以用各種的多樣性指數(shù)表示[27]。有研究指出，尾礦區(qū)土壤微生物群落代謝剖面( AWCD) 及群落豐富度、多樣性指數(shù)均顯著低于非礦區(qū)土壤[28]，本試驗的研究結(jié)果與其基本相似，6號土樣在整個培養(yǎng)過程中的AWCD值以及多樣性各指數(shù)都高于對照，可能是由于含水量以及微生物組成區(qū)系不同，也有可能是放射性核素長期污染下，該環(huán)境更有利于微生物的更替，產(chǎn)生了抗脅迫能力較強(qiáng)的微生物種類，具體原因還有待研究。值得指出的是本試驗的各活性指標(biāo)以及多樣性指數(shù)均與U的相關(guān)性不強(qiáng)，可以說明U在一定程度上未對土壤微生物造成影響或很少，而Ra與Shannon指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S）呈顯著負(fù)相關(guān)，表明這2個多樣性指數(shù)能較真實地反映鈾尾礦周邊地區(qū)Ra污染狀況，但仍需對各多樣性指數(shù)的適用范圍和條件進(jìn)行研究，并對各指數(shù)的數(shù)學(xué)方法和生物學(xué)意義進(jìn)行深入研究，才能更好地了解尾礦庫微生物群落的多樣性。

4 結(jié)論

通過對我國某典型鈾尾礦庫中放射性污染土壤微生物活性及功能多樣性特征進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)放射性污染會對土壤微生物活性產(chǎn)生影響，低濃度污染放射性污染造成的逆境會使微生物活性升高，但高濃度的放射性污染則會抑制微生物生長。在放射性污染對微生物群落功能多樣性影響方面，放射性污染使土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，微生物對碳源的利用能力降低，物種豐富度下降，且這種變化主要是由Ra引起的。主成分分析（PCA）表明微生物對碳源的利用差異主要體現(xiàn)在碳水化合物上，其次是氨基酸及其他碳源。