外源ATP對羊肚菌采后理化性質和揮發(fā)性呈香物質的影響

劉維　周智威　白婷　劉?！垏ā±钛蟆O群

摘要：探究外源ATP處理對羊肚菌采后理化性質和揮發(fā)性呈香物質的影響，為羊肚菌保鮮方法的探索提供理論基礎。新鮮羊肚菌用0.5mmol/L和0.7mmol/L ATP溶液浸泡處理后4℃貯藏，測定儲藏期間水分活度、細菌總數(shù)、PPO酶活、還原性糖含量、脂質氧化水平、揮發(fā)性呈香物質。與對照相比，0.5mmol/L ATP處理組在儲藏期間的水分活度和菌落總數(shù)降低，還原糖含量減少，脂質氧化程度降低。ATP處理可以提高羊肚菌關鍵揮發(fā)性呈香物質的含量，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮。0.5mmol/L ATP處理可以較好地保持羊肚菌采后儲藏期間的生理特性和香味特征。

關鍵詞：羊肚菌;保鮮;三磷酸腺昔;脂質氧化;揮發(fā)性呈香物質

中圖分類號：TS255.3 文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2019）08-0085-08

0 引言

羊肚菌，隸屬子囊菌亞門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬，因其菌蓋表面呈褶皺網(wǎng)狀、狀如羊肚而得名，主要分布在我國四川、青海、西藏、新疆等地。羊肚菌的營養(yǎng)價值和保健功效，使其商業(yè)化發(fā)展具有廣泛的市場前景。近年來，羊肚菌全國人工種植規(guī)模劇增，從2012年的0.3萬畝發(fā)展至2017年7萬畝（1畝=666.67m²），年總產(chǎn)量接近2萬噸，在未來的兩三年內羊肚菌的鮮貨銷售量預計將達到每日15～20噸。

新鮮羊肚菌采收時表面堅挺，組織脆嫩，含水量高，表面沒有保護結構，一般為白色或灰褐色。采后呼吸作用和新陳代謝仍然持續(xù)，水解酶和氧化酶酶活力升高，呼吸作用劇烈，在采收和運輸過程中易受到機械損傷和微生物侵染，出現(xiàn)褐變、開傘、皺縮、軟化等品質劣變現(xiàn)象。新鮮羊肚菌對溫度極為敏感且具有特殊的中空結構，目前最常用的保鮮方法是4～10℃冷庫儲藏，貨架期也只能延長至3～5d;或者一20℃冷凍儲藏，貨架期可達到3個月以上，但是嚴重破壞羊肚菌的質構和風味。目前關于羊肚菌其他有效的保鮮技術的研究報道甚少。

能量平衡在食用菌采后成熟和衰老過程中非常重要。三磷酸腺昔（adenosine triphosphate，ATP）是一種不穩(wěn)定的高能化合物，是生物體內最直接的能量來源。有研究報道，外源ATP應用于龍眼、荔枝和綠豆芽[1-3]等果蔬保鮮，提高采后果蔬所需能荷，避免果蔬呼吸消耗引起的能量匱缺，有利于保持較佳的感官品質。果蔬采后會產(chǎn)生一系列的應激反應，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，ROS的清除需要ATP供能，ATP的缺乏可能會造成ROS持續(xù)性積累，進而使細胞膜氧化損傷，破壞膜脂結構的完整性，加快果蔬的衰老過程。采后果蔬補給外源ATP可維持能量平衡，降低呼吸速率和有機物的消耗[1]。外源ATP也可作為信號分子，激活NO/Ca²⁺等第二信使，調節(jié)細胞壁多糖、果膠降解等相關基因的表達[3-4]，減緩采后果蔬的品質劣變速度。本文首次嘗試將外源ATP應用到羊肚菌保鮮研究中，探究ATP處理對羊肚菌理化性質和揮發(fā)性呈香物質的影響，為進一步摸索羊肚菌保鮮方法提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人工種植梯棱羊肚菌Morchella importuna（購于四川省甘孜藏族自治州康定市）;PE保鮮袋（購于家樂福超市）;鄰苯二酚、三氯乙酸、沒食子酸、濃硫酸、硫酸亞鐵、二甲酚橙、BHT、F-C試劑、氯化鈉、過氧化氫、硫代巴比妥酸、三苯基膦（TPP），乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲醇、乙醇等試劑均為分析純（購于成都鵬世達實驗用品有限公司）。

1.2 儀器

DK-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械有限公司;LabMaster neo控溫臺式水活度測定儀：瑞士NOVASINA公司;Micro2l R型高速冷凍離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司：AFZ-1002-U型超純水儀：美國Aquapro公司UV-2450紫外分光光度計：日本Shimadzu公司;島津氣質聯(lián)用GC-MS QP2010：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌處理方法

羊肚菌采收后用泥土覆蓋和冰盒低溫保存送至實驗室，放在通風處讓表面水分自然風干，24h內處理樣品。挑選大小一致品相優(yōu)良的羊肚菌隨機分成3組，分別用0.5mmol/L ATP溶液和0.7mmol/LATP溶液浸泡60s為處理組，純水浸泡60s為對照組，每組3個平行，PE保鮮袋包裝封口，4℃儲藏。第1，5，9天檢測指標。

1.3.2 質構測定

測定時將羊肚菌菌柄切成1cm×1cm的正方形樣品。質構儀測定模式：質地多面分析（textureprofile analysis，TPA）;TPA參數(shù)設置：測試速率2.0mm/s，返回速度為4.5mm/s，形變量85%，停隔時間5 s，數(shù)據(jù)收集頻率100Hz;探頭類型：p/10直徑10mm的圓柱形探頭;測定指標：硬度、粘性、彈性、內聚性、咀嚼性和回復性。每個處理重復3次，求平均值。

1.3.3 水分活度測定方法

室溫下將羊肚菌柄和菌蓋連接處切成小圓柱形，稱取2.0g。Lab Master neo控溫臺式水活度儀測定水分活度。

1.3.4 菌落計數(shù)

采用平板菌落計數(shù)法檢測羊肚菌儲藏過程中的菌落總數(shù)，方法參考GB 4789.2-2016（（食品微生物菌落總數(shù)的測定》。

1.3.5 多酚氧化酶活力測定方法

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力采用鄰苯二酚比色法測定[5]。取羊肚菌1.0g加入10mL預冷的pH6.80.05mol/L磷酸緩沖液（含1%PVPP），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取試管A加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，在40℃溫浴10min，加入0.25mL 40℃預熱的樣液，立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液使酶失活，混勻，加入0.25mL 0.3mol/L鄰苯二酚，8000r/min離心5min，取上清，于波長410nm處測定溶液吸光度A₁，此為反應開始時的數(shù)值。同時，以磷酸緩沖溶液替代樣液做相同處理，為空白對照。試管B加入1.25mL pH6.8的磷酸緩沖液，0.25mL0.3mol/L鄰苯二酚，搖勻，在40℃溫浴10min，加入0.25 n止預熱的樣液的同時開始計時，3min后立即加入0.25mL 20%的三氯乙酸溶液，8000r/min離心5min，取上清，于波長410nm處測溶液的吸光度A₂，此為反應終止時的數(shù)值。其中A=A₂-A₁，以△A變化0.01為一個酶活力單位計算酶活。

1.3.6 還原糖含量測定方法

還原性糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法[6]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的pH 6.8 0.05mol/L磷酸緩沖液（含1% PVPP），充分研磨，80℃水浴30min使還原糖浸出，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，加入1.5mL3，5-二硝基水楊酸試劑，棍勻，沸水水浴5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，再以蒸餾水定容至10mL，混勻，于波長540nm處測定吸光度。以緩沖溶液替代樣液做相同處理，作為空白對照。以0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL葡萄糖溶液繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算還原性糖含量。

1.3.7 脂質氧化水平檢測方法

過氧化脂質（lipid peroxide，LPO）測定采用FOX 2法[7]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的80%乙醇水溶液（含0.01%BHT），充分研磨，10000r/min離心10min，上清液備用。取0.5mL樣液，分別加入0.1mL 10mmol/L TPP（+TPP）和甲醇（-TPP），渦旋振蕩1min，室溫孵育30min，最后加入1mLFOX反應液，室溫孵育30min，于波長560nm處吸光度值Abs560[+TPP]和Abs560[-TPP]，Abs560LOOH=Abs560[-TPP]-Abs560[+TPP]。以濃度為0，5，10，15，20，25μmol/L H₂O₂繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品LPO含量。

脂質氧化測定采用TBARS法[8]。取1.0g羊肚菌加入10mL預冷的TCA混合液（含7.5% TCA和0.1%EDTA-2Na），充分研磨，于55℃水浴30min，10000r/min離心10min，上清液備用。取1.0mL樣液，加入1.0mL 0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液，混勻，于90℃水浴內反應20min。以TCA混合液為空白調零，于532nm波長處測定吸光值。

1.3.8 揮發(fā)性呈香物質檢測

頂空固相微萃取[9]條件：取2g樣品（切成2mm厚度的片狀）于20mL樣品瓶中密封，50℃平衡5min，SPME萃取頭頂空萃取40min，色譜條件：進樣口溫度為250℃，不分流進樣，解吸5min。載氣為高純氦氣，恒定流量1.0mL/min。采用程序升溫，初始溫度40℃，保持1min;然后以10℃/min的速度升至70℃，保持2min;以3℃/min的速度升至105℃，維持1min;最后以10℃/min的速度升至180℃，保持1min。質譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，發(fā)射電流70A，掃描范圍50～550m/z，

2 結果與分析

2.1 羊肚菌外觀變化

圖1是羊肚菌在儲藏過程中的外觀變化。由圖可知羊肚菌在儲藏過程中會發(fā)生不同程度的褐變，菌柄從白色逐漸變黃，0.7mmol/L ATP處理組的褐變現(xiàn)象最為明顯。第9天，對照組和0.7mmol/LATP處理組表面可以觀察到少量白色菌絲，失去食用價值;在第11天，對照組和0.7mmol/L ATP處理組表面的白色菌絲生長明顯，0.5mmol/L ATP處理組的表面有少量白色菌絲開始生長。從表觀結果來看，0.5mmol/L ATP可以延緩羊肚菌表面菌絲的生長。

2.2 羊肚菌質構變化

質地是羊肚菌在儲藏過程中品質評價的重要指標。TPA是模擬人口腔咀嚼的過程，可以從硬度、內聚力、咀嚼性和彈性反應羊肚菌的質構特征。羊肚菌采后的新陳代謝仍在進行，蛋白、果膠和纖維素等細胞壁成分不斷降解，水分因呼吸作用而消耗，導致細胞膨壓降低，細胞結構松弛疏散，羊肚菌硬度、咀嚼性和彈性就會隨之降低[10]。

表1列出了不同處理的羊肚菌在不同儲藏時間硬度、咀嚼性和彈性的變化。結果顯示，對照組的硬度和咀嚼性在整個儲藏期間呈先降低后增加的趨勢，而ATP處理組則是先增加后略微降低的趨勢，該結果與杏鮑菇的品質變化趨勢相似[11]。對照組和處理組羊肚菌的彈性在整個儲藏期均沒有發(fā)生顯著性變化（P>0.05），可能是因為羊肚菌本身的彈性較小，相應的變化也不明顯。對照組第5天的硬度與初始相比顯著降低（P<0.05），可能是羊肚菌采后細胞內營養(yǎng)物質消耗，導致細胞結構強度降低，第9天對照組的硬度咀嚼性又增加是因為在儲藏后期羊肚菌失水過多，子實體表面皺縮變硬。ATP處理組在第5天的硬度和咀嚼性顯著高于對照組（P<0.05），第9天僅有輕微降低，可能是外源ATP為采后羊肚菌提供新陳代謝所需的能量，避免子實體蛋白等營養(yǎng)物質的降解，同時還能促進果膠和纖維素的形成，從而維持羊肚菌正常的形態(tài)結構。其中，0.5mmol/L ATP比0.7mmol/L ATP更能提高羊肚菌的硬度和咀嚼性?？傮w來看，0.5mmol/L ATP處理可以很好地維持羊肚菌質地特征。

2.3 外源ATP對羊肚菌水分活度的影響

水分活度A_W值在食品保鮮研究中具有重要意義，可以用來預估和衡量食品中腐敗微生物的繁殖、代謝、抗性及生存等能力，較低的水分活度可以提高食品的穩(wěn)定性和防腐能力[12]。圖2是羊肚菌在儲存過程中的水分活度變化趨勢。由于羊肚菌本身屬于高水分食品（Aw_W=0.9～1.0），在儲藏期水分活度的變化較小。在儲藏末期ATP處理組的水分活度都顯著低于對照組（P<0.05），而0.5mmol/LATP處理組和0.7mmol/L ATP處理組之間沒有顯著差異（P>0.05）。結果表明外源ATP處理可以顯著抑制羊肚菌自由水含量的升高，在儲藏過程中對微生物侵染羊肚菌有一定的抑制作用。

2.4 外源ATP對羊肚菌微生物生長的影響

食用菌采后容易受到微生物侵染而腐敗變質，微生物生長量是評價羊肚菌耐儲性的重要指標。圖3是儲藏過程中對照組和處理組的微生物生長量變化趨勢。儲藏過程中，對照組和處理組在第。一5天菌落總數(shù)顯著增加（P< 0.05），第5天和第9天，0.5mmol/L ATP處理組的菌落總數(shù)都顯著低于對照組（P<0.05），0.7mmol/L ATP處理組的菌落總數(shù)與對照相無顯著差異（P>0.05），表明 0.5mmol/LATP處理可以抑制羊肚菌表面微生物的生長。

ATP處理可以進一步提高了羊肚菌關鍵揮發(fā)性呈香物質的含量且無劑量差異，如2-甲基丁醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3-醇、1，2-二甲基-3-辛酮，目前還未見相關報道，猜想可能是因為ATP處理可以使羊肚菌在一段時間內正常生長并成熟，使羊肚菌的香氣可以更加濃郁，具體的機制還有待研究。不過在其他食用菌保鮮研究中也有類似的報道，Clllere4[20]利用輻照對塊菌進行保鮮處理，發(fā)現(xiàn)1.5K電子束輻照可以提高3-甲基丁醇等塊菌特征香氣物質的含量，還發(fā)現(xiàn)電子束輻照比γ射線對塊菌香氣的影響更大，且表現(xiàn)為積極的影響。此外，研究報道ATP處理都能顯著緩解龍眼和綠豆芽[1，3]的褐變現(xiàn)象，但對羊肚菌的褐變并沒有表現(xiàn)出明顯的抑制效果。

4 結束語

0.5mmol/L ATP可以緩解羊肚菌的脂質氧化程度，很好地保持羊肚菌采后儲藏過程中的理化性質和香味特征，在羊肚菌保鮮研究中具有一定的應用潛力。褐變是影響食用菌品質的主要原因，是食用菌保鮮的重要指標，0.5mmol/L ATP在本文結果中不能有效緩解羊肚菌褐變現(xiàn)象。因此，在后期研究中有必要嘗試用其他方法聯(lián)用，以期摸索出一種安全、有效、方便的羊肚菌保鮮方法，拓寬羊肚菌的銷路，促進其商業(yè)發(fā)展。

參考文獻

[1]CHEN M，LIN H，ZHANG S，et al.Effects of adenosinetriphosphate（ATP）treatment on postharvest physiology，quality and storage behavior of longan fruit[J].Food&Bioprocess Technology，2015，8（5）：971-982.

[2]YI C，JIANG Y，SHI J，et al.Effect of adenosine triphosphateon changes of fatty acids in harvested litchi fruit infected byPeronophythora litchii[J].Postharvest Biology&Technology，2009，54（3）：159-164.

[3]CHEN L，ZHOU Y，HE Z，et al.Effect of exogenous ATP onthe postharvest properties and pectin degradation of mungbean sprouts（Vigna radiata）[J].Food Chem，2018，251：9-17.

[4]HUI L，CHEN F，LAI S，et al.Effects of calcium treatmentand low temperature storage on cell wall polysaccharidenanostructures and quality of postharvest apricot（Prunusarmeniaca）[J].Food Chemistry，2017，225：87-97.

[5]黃赫雁，韓春然，李煌，等.香菇多酚氧化酶活性測定方法的改進[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016（11）：32-37.

[6]姜天甲.主要食用菌采后品質劣變機理及調控技術研究[D].杭州：浙江大學，2010.

[7]DELONG J M，PRANGE R K，HODGES D M，et al.Using amodified ferrous oxidation xylenol orange（FOX）assay fordetection of lipid hydroperoxides in plant tissue[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry，2002，50（2）：248-254.

[8]HODGES D M，DELONG J M，F(xiàn)ORNEY C F，et al.Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay forestimating lipid peroxidation in plant tissues containinganthocyamn and other interfering compounds[J].Planta，1999，207：604-611.

[9]李小林，陳誠，黃羽佳，等.頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用分析4種野生食用菌干品的揮發(fā)性香氣成分[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（9）：174-180.

[10]尹敏.聚乳酸納米復合材料對食用菌保鮮效果的研究[D].昆明：昆明理工大學，2017.

[11]石建春，馮翠萍，常明昌，等.不同包裝材料對貨架期杏鮑菇貯藏品質的影響[J].食品工業(yè)，2017（5）：102-105.

[12]李琳，萬素英.水分活度（Aw）與食品防腐[J].中國食品添加劑，2000（4）：33-37.

[13]張琦，吳素蕊，樊建，等.黑脈羊肚菌多酚氧化酶特性研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（15）：124-126.

[14]王耀松.蟹味菇采后生理及貯藏保鮮技術研究[D].西北農(nóng)林科技大學， 2007.

[15]劉吟，李成華，吳關威，等.雙抱蘑菇子實體采后褐變及相關生化變化研究[J].中國食用菌，2010，29（3）：48-51.

[16]孫月娥，王衛(wèi)東.國內外脂質氧化檢測方法研究進展[J].中國糧油學報，2010，25（9）：123-128.

[17]TASKIN H.Detection of volatile aroma compounds ofMorchella by headspace gas chromatography massspectrometry（HS-GC/MS）[J].Notulae Botanicae HortiAgrobotanici Cluj-Napoca，2013，41（1）：122-125.

[18]王曉艷.龍眼（Dimocarpus longan Lour.）采后果肉自溶發(fā)生相關蛋白的分離鑒定及功能分析[D].福州：福建農(nóng)林大學，2013.

[19]陳夢茵，林河通，洪延康，等.DNP和ATP對Phomopsislonganae Chi侵染的龍眼果實病害發(fā)生、能荷狀態(tài)和呼吸代謝的調控[J].現(xiàn)代食品科技，2015，31（5）：49-58.

[20]CULLERE L，F(xiàn)ERREIRA V，VENTURINI M E，et al.Evaluation of gamma and electron-beam irradiation on thearomatic profile of black truffle（Tuber melanosporum）andsummer truffle（Tuber aestivum）[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies，2012，13（1）：151-157.

（編輯：莫婕）