UGT1A1基因突變對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者轉(zhuǎn)歸的影響

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[摘要] 目的 探討UGT1A1基因突變對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者（ACLF）轉(zhuǎn)歸的影響。方法 該研究以福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院2015年5月—2017年10月期間入院后確診的246例乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（ACLF）患者為研究對象。采取前瞻性研究方法，對246例ACLF患者進行UGT1A1基因測序。根據(jù)測序結(jié)果分為突變組（n=195）和無突變組（n=51），比較兩組之間臨床特征的差異。正態(tài)分布的計量資料組間比較采用t檢驗;偏態(tài)分布的計量資料組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗。組間的不同時間的膽紅素、MELD評分的采用廣義線性混合效應模型分析（GLMMs）。采用χ2檢驗分析組間的生存率差異。 結(jié)果 ①UGT1A1基因突變組與無突變患者基線臨床特征基本相似，但突變組IBIL高于無突變組，差異有統(tǒng)計學意義（t=-1.976， P=0.05）;②突變組與無突變組的TBIL、IBIL水平及MELD評分隨時間變化差異有統(tǒng)計學意義（FTBIL=24.915，P=0.000;FIBIL=17.903，P=0.000;FMELD評分=8.179，P=0.000）。③突變組與無突變組患者生存率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）：慢性乙型肝炎基礎上ACLF1期（100.00%vs 92.31%）（χ2=0.407，P=0.722）。慢性乙型肝炎基礎上ACLF2期（76.92%vs76.47%）（χ2=0.973，P=0.643）。慢性乙型肝炎基礎上ACLF3期（28.57% vs 31.58%）（χ2=0.022，P=0.639）。乙型肝炎肝硬化基礎上ACLF1期（100.00% vs 66.67%）（χ2=0.444，P=0.750）。乙型肝炎肝硬化基礎上ACLF2期（57.89% vs 70.13%）（χ2=1.043，P=0.307）。乙型肝炎肝硬化基礎上ACLF3期（80.00% vs 62.50%）（χ2=1.976，P=0.469）。 結(jié)論 ①UGT1A1基因突變對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者的轉(zhuǎn)歸有一定影響，主要表現(xiàn)在膽紅素代謝方面：突變組的膽紅素上升的速度比無突變組快，消退較無突變組緩慢。②UGT1A1基因突變影響MELD評分，但對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者的生存率無明顯影響。

[關(guān)鍵詞] 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶;UGT1A1基因突變;乙型肝炎;乙型肝炎肝硬化;慢加亞急性肝衰竭

[中圖分類號] R4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）09（a）-0017-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of UGT1A1 gene mutation on the outcome of patients with chronic hepatitis B and acute acute liver failure （ACLF）. Methods A total of 246 patients with hepatitis B chronic acute hepatic failure （ACLF） who were diagnosed after admission from May 2015 to October 2017 at Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University were included in the study. A prospective study was conducted to sequence UGT1A1 genes in 246 patients with ACLF. According to the sequencing results， the mutation group （n=195） and the non-mutation group （n=51） were divided， and the differences in clinical characteristics between the two groups were compared. The t-test was used to compare the measurement data of the normal distribution; the Mann-Whitney U test was used to compare the measurement data of the skewed distribution. The chi-square test was used to compare the count data sets. The bilirubin and MELD scores at different times between groups were analyzed using generalized linear mixed-effects models （GLMMs）. Chi-square test was used to analyze the difference in survival rates between groups. Results 1.The clinical features of the UGT1A1 gene mutation group were similar to those of the non-mutation group， but the IBIL of the mutation group was higher than that of the non-mutation group （t=-1.976， P=0.05）. 2.The TBIL， IBIL levels and MELD scores over time of the mutation group and the non-mutation group were significantly different（FTBIL=24.915， P=0.000; FIBIL=17.903， P=0.000; FMELD score=8.179， P=0.000）. 3.There was no significant difference in survival rate between the mutation group and the non-mutation group（P>0.05）： chronic hepatitis B was based on ACLF1 stage （100.00% vs 92.31%）（χ2=0.407， P=0.722）. Chronic hepatitis B was based on ACLF2（76.92% vs 76.47%）（χ2=0.973， P=0.643）. Chronic hepatitis B was based on ACLF stage 3 （28.57% vs 31.58%）（χ2=0.022， P=0.639）. Hepatitis B cirrhosis was based on ACLF1 （100.00% v 66.67%）（χ2=0.444， P=0.750）. Hepatitis B cirrhosis was based on ACLF2 （57.89% vs 70.13%），（χ2=1.043， P=0.307）. Hepatitis B cirrhosis was based on ACLF phase 3 （80.00% vs 62.50%）（χ2=1.976， P=0.469）. Conclusion 1.UGT1A1 gene mutation has a certain effect on the outcome of patients with chronic hepatitis B and acute hepatic failure， mainly in the metabolism of bilirubin： the bilirubin in the mutant group rises faster than the non-mutant group， and the regression was slower than non-mutation group. 2.UGT1A1 gene mutation affects MELD score， but has no significant effect on the survival rate of patients with chronic hepatitis B and acute liver failure.

[Key words] Uridine diphosphate glucuronyltransferase; UGT1A1 gene mutation; Hepatitis B; Hepatitis B cirrhosis; Slow plus subacute liver failure

乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指由乙型肝炎病毒感染引起的嚴重肝臟損害，導致肝臟合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙，以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的臨床癥候群。肝臟是膽紅素代謝的主要場所，肝衰竭患者由于肝功能嚴重障礙，UGT酶合成減少及功能受損，必然會影響非間接型膽紅素轉(zhuǎn)化為直接膽紅素，導致肝內(nèi)膽汁淤積和高膽紅素血癥，而膽汁酸和膽紅素在肝細胞內(nèi)蓄積，其毒性作用又會加重肝細胞的損傷，甚至壞死，形成惡性循環(huán)，加重肝衰竭。該研究以福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院2015年5月—2017年10月期間入院后確診的246例乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（ACLF）患者為研究對象，通過基因測序方法探討UGT1A1基因突變對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭的影響，報道如下。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

該研究整群選取福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院入院后確診的246例乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（ACLF）患者為研究對象。采取前瞻性隊列研究方法，通過基因測序，探討UGT1A1對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（ACLF）的轉(zhuǎn)歸的影響。診斷標準：參照2012年中華醫(yī)學會感染病學分會和中華醫(yī)學會肝病學分會制定的《肝衰竭診療指南》[1] 。排除：藥物、毒物、酒精等所致肝損傷、其他急性嗜肝病毒、非嗜肝病毒感染、其他遺傳代謝性疾病、膽道梗阻性疾病、重大創(chuàng)傷及手術(shù)、燒傷、急性冠脈綜合征、心源性休克的患者。 該次所有研究經(jīng)過患者或家屬知情同意。

1.2? 研究方法

（1）收集患者的一般資料：性別、年齡、籍貫、種族。實驗室指標：血液生化指標（ALB、TBIL、DBIL、IBIL、ALT、 AST、GGT、ALP、CHE、Cr）、凝血相關(guān)指標（PTA、INR）、HBV血清標志物（HBsAg 、HBe-Ab、HBe-Ag、HBc-Ab）及HBV DNA載量。計算終末期肝病模型（Moldel for End-stage Liver Disease，MELD）評分，計算公式：9.6×LN（CR/88.4）+3.8×LN（TBIL/17.1）+11.2×LN（INR）+6.4。

（2）UGT1A1基因檢測：①基因組DNA提取及PCR擴增：參照Tiangen試劑盒說明，取乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭（ACLF）患者外周靜脈血200 μL提取基因組DNA，基因組DNA模板行PCR擴增。反應體系包括：基因組DNA 30 ng，上下游引物（表1）各0.5 μL（10 pmo1），dNTP 2 μL（2.5 mmo1），rTaq酶1 μL（日本TaKaRa公司），補充雙蒸水至20 μL，混勻后于PCR熱循環(huán)儀（ABI 9700）進行擴增反應，反應條件如下：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72℃再延伸10 min。②PCR產(chǎn)物純化、測序及序列分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，純化后送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司分別對擴增引物測序。結(jié)果采用DNAStar軟件子程序SeqMan分析。

（3）隨訪：隨訪患者的12周生存情況。

1.3? 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗;偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25 ～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料組間比較，采用χ2檢驗。組間的不同時間的TBIL、IBIL、MELD評分隨時間變化差異的采用廣義線性混合效應模型（GLMMs）分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1? 一般資料

共納入246例ACLF的患者，男 212例，女34 例，平均年齡（45.65±12.35）歲。無突變組男44例，女7例，突變組男168例，女27例，組間的男女比例差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001），根據(jù)UGT1A1基因測序結(jié)果將其分為突變組（n=195）和無突變組（n=51），比較兩組之間臨床特征的差異，突變組的IBIL水平均較無突變組高，差異有統(tǒng)計學意義（t=-1.976，P=0.05）。ALB、TBIL、DBIL、ALT、AST、GGT、ALP、CHE、CR、PTA、INR、MELD評分突變組和無突變組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2? UGT1A1基因突變對乙型肝炎ACLF患者膽紅素及MELD評分動態(tài)變化的影響

UGT1A1基因突變組與無突變組的TBIL、IBIL、MELD評分經(jīng)GLMMs分析，組別和時間的無交互作用（FTBIL=0.349，P=0.974;FIBIL=0.137，P=1.000;FMELD評分=0.489， P= 0.911）。關(guān)于主效應，突變組的TBIL、IBIL水平及MELD評分較無突變組的高（FTBIL=39.334，P=0.000;FIBIL=59.781，P=0.000;FMELD評分=11.555，P=0.001），組間的TBIL、 IBIL水平及MELD評分隨時間變化差異有統(tǒng)計學意義（FTBIL=24.915，P=0.000;FIBIL=17.903，P=0.000;FMELD評分=8.179，P=0.000），病程12次TBIL、IBIL水平的比較，突變組的前7次TBIL、IBIL水平的隨時間下降較無突變組慢有統(tǒng)計學意義（tTBIL=-6.272，P<0.001;tIBIL=-7.732，P<0.001）。病程12次MELD評分的比較，前6次MELD評分的變化組間均差異有統(tǒng)計學意義（tMELD評分=-3.399，P=0.01<0.05）。見表2、表3、表4。

2.3 UGT1A1基因突變對乙型肝炎ACLF患者生存率的影響

根據(jù)慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化基礎的肝衰竭及肝衰竭1、2、3期分為12組，基于同為慢性乙型肝炎（CHB）基礎上的肝衰竭同一分期的是否發(fā)生UGT1A1基因突變比較生存率：慢性乙型肝炎基礎上ACLF1期（100.00% vs 92.31%）（χ2=0.407，P=0.722）。慢性乙型肝炎基礎上ACLF2期（76.92%vs76.47%）（χ2=0.973，P=0.643）。慢性乙型肝炎基礎上ACLF3期（28.57%vs31.58%）（χ2=0.022，P=0.639）。乙型肝炎肝硬化（hepatitis? B Cirrhosis，Cirrhosis）基礎上ACLF1期（100.00% vs 66.67%）（χ2=0.444，P=0.750）。乙型肝炎肝硬化基礎上ACLF2期（57.89%vs70.13%）（χ2=1.043，P=0.307）。乙型肝炎肝硬化基礎上ACLF3期（80.00% vs 62.50%）（χ2=1.976，P=0.469）。這6組的組間進行χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表5。

3? 討論

UGT1A1基因位于2q37，由一個增強子、啟動子和5個外顯子組成，UGT1A1基因是編碼肝臟中參與膽紅素葡萄糖醛酸化反應唯一相關(guān)酶類。截止2018年9月The Human Gene Mutation Database的UGT1A1突變有146多種，突變位點在不同地區(qū)、不同種族及個體間有較大差異[2] 。UGT1A1基因突變不僅可影響膽紅素代謝，而且對藥物代謝（如：苯甲酸雌二醇、乙炔基雌二醇、甲苯磺丁脲、利福平[3]、對乙酰氨基酚、奧沙利鉑[4]、非甾體類消炎藥、他汀類藥物、HIV蛋白酶抑制劑等）、新生兒黃疸、膽石癥、肝移植術(shù)后高黃疸、腫瘤發(fā)生等均有影響。

該研究探討UGT1A1基因突變對乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者的膽紅素影響，UGT1A1基因突變組[127（82～196.8）μmol/L]基線的IBIL高于無突變組[91.50（67.00～164.20）μmol/L]，差異有統(tǒng)計學意義（t=-1.976， P=0.05）;與相關(guān)研究團隊[5]的研究的無突變組（野生型）的IBIL（8.1±3.3）μmol/L與UGT1A1*6組的IBIL（11.6±6.2）μmol/L、UGT1A1*28組的IBIL（10.3±4.2）μmol/L、UGT1A1*6-*28的IBIL（14.3±10.4）μmol/L，組間的差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）一致。但該研究的基線TBIL突變組（343.02±166.92）μmol/L與無突變組（304.53±148.43）μmol/L、DBIL突變組（200.25±89.33）μmol/L與無突變組（183.83±85.15）μmol/L差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與相關(guān)學者的無突變組（野生型）的TBIL（13.0±4.9）μmol/L、DBIL（4.9±1.7）μmol/L與UGT1A1*6組的TBIL（17.8±8.6）μmol/L、DBIL（6.2±2.7）umol/L、UGT1A1*28組的TBIL（16.4±7.4）μmol/L、DBIL（6.1±3）μmol/L、UGT1A1*6-*28的TBIL（22.1±12.6）μmol/L、DBIL（7.7±2.8）μmol/L，組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.005）不一致，考慮不一致的原因為肝衰竭患者的膽紅素明顯升高掩蓋了直接膽紅素升高程度。該研究的肝衰竭患者病程中突變組與無突變組的TBIL、IBIL水平及MELD評分隨時間變化差異有統(tǒng)計學意義（FTBIL=24.915，P=0.000;FIBIL=17.903，P=0.000;FMELD評分=8.179，P=0.000）。因相關(guān)學者未進行病程中膽紅素變化分析研究，目前國內(nèi)外無檢索到類似的UGT1A1基因突變對膽紅素變化關(guān)系的研究，故無法進行比較。MELD評分是目前常用的肝衰竭預后評估模型，MELD評分可用于急性肝衰竭、亞急性肝衰竭、慢加亞急性肝衰竭患者的預后評估分析[6-7]，該研究中UGT1A1突變組較無突變組MELD評分高，但突變組的生存率與無突變組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.001），此與李曉永等[8]的研究中MELD評分在HBV感染的慢加亞急性肝衰竭1年病死率的獨立危險因素（OR=1.386，95% CI 1.072～2.043，P=0.018）不一致，考慮該研究對象是合并UGT1A1基因突變的HBV感染的慢加亞急性肝衰竭，此基因突變可影響膽紅素代謝，升高血清膽紅素，提高了MELD評分的數(shù)值，但UGT1A1突變對HBV感染的慢加亞急性肝衰竭的患者不是致死性突變，其與戚宇琪等[9]的報道相符，故合并UGT1A1基因是HBV感染的慢加亞急性肝衰竭的患者使用MELD評分預測預后可能存在偏差。

該研究不足之處未設正常人群對照組，無法探討UGT1A1基因突變在乙型肝炎慢加亞急性肝衰竭患者發(fā)病中的作用及其機制，樣本量相對偏少，影響統(tǒng)計效率。未進行UGT1A1酶活性檢測，UGT1A1基因突變后還涉及該基因后續(xù)的轉(zhuǎn)錄、翻譯及產(chǎn)物加工修飾等系列過程，如若能從UGT1A1基因不同突變位點導致酶活性不同程度下降進而導致乙型肝炎肝衰竭患者的黃疸不同程度升高、影響黃疸消退以及對肝衰竭預后影響，會更有說服力。

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（收稿日期：2019-06-05）