淺談CRISPR-Cas9技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用

李美琪

摘要：肺癌是人類常見的惡性腫瘤，發(fā)病率全球腫瘤中第一，發(fā)病率和死亡率也逐年增高。而最新研究表明通過CRISPR-Cas9技術(shù)可有效敲除基因中NFE2L1轉(zhuǎn)錄因子，中從而證實(shí)NFE2L1跨膜因子在腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育中起著重要作用，CRISPR-Cas9技術(shù)為相關(guān)研究找到可重大突破口。G6PD缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病，全球約2億人患有此病。有研究表明可通過CRISPR-Cas9對突變位點(diǎn)進(jìn)行切割修復(fù)以達(dá)到治療效果。由此可見，CRISPR-Cas9技術(shù)可通過對基因精確編輯來為諸多疾病治療提供了更加廣闊的思路。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9技術(shù)? ?G6PD缺乏癥? ?肺癌

近50年來，肺癌患者數(shù)量急劇上升，死亡率也明顯增高。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)近日發(fā)布最新報(bào)告顯示：2018年肺癌死亡人數(shù)高達(dá)180萬人，占預(yù)計(jì)癌癥死亡總?cè)藬?shù)的18.4%。我國G6PD缺乏癥也是高發(fā)病，在我國各地患病率為0.2%～44.8%，全世界約2億人患此病。近年來，CRISPR-Cas9技術(shù)與遺傳病之間聯(lián)系研究日益增多。我國于2016年也開展CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)治療肺癌疾病的臨床實(shí)驗(yàn)。本文對CRISPR-Cas9技術(shù)在肺癌及G6PD缺乏癥的臨床研究中的應(yīng)用展開論述。

一、CRISPR-Cas9技術(shù)

（一）CRISPR-Cas9技術(shù)由來

生物公司EditasMedicine開發(fā)出了一種CRISPR-Cas9的基因治療法，其可通過對DNA進(jìn)行精確地序列剪切、作技術(shù)來治療多種疾病?；蚓庉嬍悄壳吧茖W(xué)研究的一個熱點(diǎn)，而CRISPR-Cas9是當(dāng)今最流行的基因編輯工具，其在人類生物學(xué)、業(yè)及多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。2016年，中國科學(xué)家有望開展首個CRISPR-Cas9基因編輯臨床實(shí)驗(yàn) ，將由四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤學(xué)家盧鈾教授及其研究小組帶對利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除基因再回輸入患者體內(nèi)用以治療肺癌。2017年，英國《自然通訊》雜志發(fā)表通過利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)可拯救失明小鼠的重要遺傳學(xué)研究成果，證實(shí)了CRISPR-Cas9在遺傳病中的重要應(yīng)用。

（二）CRISPR-Cas9技術(shù)原理

CRISPR-Cas9系統(tǒng)最早被發(fā)現(xiàn)于古生菌中，并且廣泛存在于細(xì)菌中，是抵御外來遺傳物質(zhì)入侵的重要免疫機(jī)制。可將外源侵染物整合保存，該外源侵染物再次侵染細(xì)菌時，CRISPR及其相關(guān)蛋白會通過剪切破壞外源基因以保護(hù)細(xì)菌。CRISPR-Cas9由一系列成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列組成。CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要由在DNA分子上成線性排列的tracrRAN序列、as基因序列和CRISPR三個功能區(qū)構(gòu)成。CRISPR-Cas9發(fā)生免疫系統(tǒng)原理為：Cas9蛋白可有效地對gRNA導(dǎo)介的特定位點(diǎn)進(jìn)行編輯，將外源基因整合到自身基因中，具有核酸內(nèi)切酶的作用。Cas9首先與一個gRNA結(jié)合并通過gRNA引導(dǎo)結(jié)合到DNA目標(biāo)位點(diǎn)，識別的位點(diǎn)會受到DNA序列限制即Cas9識別靶序列后滿足NGG序列。NGG序列也可稱為PMA原型間隔序列毗鄰基。這是CRISPR至關(guān)重要的一部分，PMA是一段高度保守的序列，Cas9只對位于PMA5端附近的靶序列進(jìn)行切割，在識別靶向DNA中起著重要作用。整合后的CRISPR序列首選轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA再與tracrRNA形成復(fù)合物，并通過Rnase切割形成crRNA從而完成crRNA的轉(zhuǎn)錄加工。該過程中crRNA通過靶基因互補(bǔ)配對的方式來保持基因特異性。通過科學(xué)探究發(fā)現(xiàn)，人們可以利用Cas蛋白發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性切斷外源基因的機(jī)理，若除去Cas蛋白核酸內(nèi)切酶活性，形成dCas蛋白，則可阻礙靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄以實(shí)現(xiàn)基因靜默，從而對多項(xiàng)基因研究工作提供了渠道。

（三）CRISPR-Cas9技術(shù)展望

CISPR-Cas9使用起來簡單，易于設(shè)計(jì)且成本低等優(yōu)點(diǎn)，從而替代了以往生物學(xué)家利用的分子工具編輯基因組技術(shù)。分子具編輯基因組技術(shù)中有一種鋅指核酸酶技術(shù)有望精確高效編輯基因，但其價格昂貴并未廣泛使用。而CRISPR-Cas9卻有著決定性的優(yōu)勢，因?yàn)樵撔蛄醒苌腞NA可引導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)合到特定DNA片段，從而引起目標(biāo)DNA上的雙鏈斷裂，簡單高效。研究人員只需要訂購RNA片段，花費(fèi)明顯降低，并且與鋅指核酸酶技術(shù)相比，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建難度明顯降低，且CRISPR-Cas9可同時進(jìn)行多靶編輯，靶向修飾率也大大提高。因此，CRISPR-Cas9技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。

任何事物都有利弊CRISPR-Cas9技術(shù)也不例外。CRISPR-Cas9技術(shù)雖然被應(yīng)用到世界各國眾多科學(xué)研究中，與此同時它也有所弊端，即使sgRNA可以精確定位，Cas9蛋白可以精確識別RNA序列，但也會有失誤的時候——脫靶。各項(xiàng)基因工程研究都避免不了脫靶現(xiàn)象，這影響了編輯效率，也會造成一定的風(fēng)險。目前，雖然不能完全消除脫靶現(xiàn)象的存在，但可以通過優(yōu)化sgRNA、提高Cas9蛋白自身特異性等方法降低脫靶率。雖然CRISPR-Cas9技術(shù)使用上有些阻礙，但依舊不可否認(rèn)，CRISPR-Cas9技術(shù)為生物體研究和改造帶來的巨大貢獻(xiàn)。

二、CRISPR-Cas9技術(shù)在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用

（一）G6PD缺乏癥

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為新一代基因編輯工具，其強(qiáng)大的基因編輯能力不僅在遺傳性疾病研究中有所突破，并且在臨床試驗(yàn)中也被積極展開應(yīng)用，如杜氏肌營養(yǎng)不良，Crygc基因突變引發(fā)的白內(nèi)障等疾病中的應(yīng)用。目前，CRISPR-Cas9技術(shù)正在嘗試應(yīng)用于G6PD缺乏癥的臨床研究中。G6PD缺乏癥主要分為新生兒黃疸、急性溶血癥貧血、慢性非球形紅細(xì)胞溶血行貧血三類，全世界約有4億G6PD缺乏癥患者，主要分布在東南亞、非洲和地中海沿岸等地，并且男性患者明顯多于女性。我國廣東、海南等地人群的患病率較高。我國人群中已發(fā)現(xiàn)G6PD基因突變位點(diǎn)超過20種。G6PD缺乏癥患者紅細(xì)胞表面G6PD缺乏而引發(fā)的一系列反應(yīng)，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞并溶血。根據(jù)G6PD酶的活性缺乏程度及臨床表現(xiàn)分為五種亞型。

1.CRISPR-Cas9技術(shù)在G6PD缺乏癥中具體應(yīng)用

SPENCER等人利用CRISPR-Cas9技術(shù)培養(yǎng)G6PD基因敲除細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)G6PD基因敲除細(xì)胞系的G6PD表達(dá)下降，這證明了CRISPR-Cas9技術(shù)可用于編輯G6PD基因組。TANG等向單細(xì)胞人胚胎中注射恰當(dāng)?shù)膕gRNA和同源供體復(fù)合的Cas9蛋白，證明G6PD基因中點(diǎn)突變可由有效的同源重組來介導(dǎo)校正。根據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯原理，PAM區(qū)上游的3～8堿基處的目的基因可由sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白切割，即大部分G6PD缺乏癥突變位點(diǎn)可通過CRISPR-Cas9技術(shù)修復(fù)，如我國常見的幾種突變95A>G、1376G>T、1024C>T等。人工設(shè)計(jì)特異性sgRNA來引導(dǎo)的Cas9蛋白針對導(dǎo)致G6PD缺乏癥突變點(diǎn)進(jìn)行切割，提供DNA修復(fù)模板進(jìn)行同源修復(fù)以便修復(fù)突變位點(diǎn)，也可將G6PD缺乏癥患者體細(xì)胞重編輯為iPSCS，將G6PD缺乏癥患者來源的iPSCS中的致病突變基因通過CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行修復(fù)，最終將修復(fù)后的iPSCS誘導(dǎo)分化為紅系祖胞移植到G6PD缺乏癥患者體內(nèi)，以治療G6PD缺乏癥。CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為遺傳性疾病的新型治療技術(shù)具有無限大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

（二）腫瘤研究

腫瘤吸煙、大氣污染和煙塵中含有致癌物質(zhì)等因素有關(guān)，威脅人類生命健康的原因有惡性程度高、高耐藥性等。而近期研究發(fā)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)錄因子NFE2L1在癌癥中扮演著抑癌基因的重要角色。NFE2L1又稱NRF1，屬于堿性亮氨酸拉鏈之一。其在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等研究中發(fā)揮著重要作用。有實(shí)驗(yàn)表明，利用CRISPR-Cas9技術(shù)將成年小鼠肝細(xì)胞內(nèi)NFE2L1基因敲除后會引發(fā)自發(fā)性脂肪肝并持續(xù)惡化為肝癌死亡，可見，NFE2L1在抑癌中的關(guān)鍵作用。

1.CRISPR-Cas9技術(shù)在腫瘤疾病中應(yīng)用

肺癌是一種細(xì)胞惡性增殖疾病，而NFE2L1對癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)行調(diào)節(jié)，且由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在敲除NFE2L1后進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖培養(yǎng)48小時后，腫瘤細(xì)胞增值明顯。NFE2L1信號通路可誘導(dǎo)其下游調(diào)控的多種抗氧化酶表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化防御調(diào)節(jié)機(jī)制之一。NFE2L1與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。CRISPR-Cas9是細(xì)菌適應(yīng)性防御系統(tǒng)，可特異性切割外源基因、準(zhǔn)確地進(jìn)行基因編輯。利用CRISPR-Cas9技術(shù)研究基因缺失與腫瘤表現(xiàn)型之間的關(guān)系，為腫瘤研究治療樹立了新的方向。根據(jù)Ren等研究結(jié)果顯示NFE2L1在肝正常細(xì)胞表達(dá)明顯高于在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，即可證明NFE2L1發(fā)揮著抑癌因子作用。EMT重新編輯被認(rèn)為是胚胎形成所必需的基礎(chǔ)，若使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除胚胎發(fā)育期小鼠的NFE2L1基因，則小鼠會死亡，可見EMT轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育、細(xì)胞癌變轉(zhuǎn)移中發(fā)生。在過腫瘤細(xì)胞發(fā)展初期通過EMT轉(zhuǎn)化，并獲得其離開原發(fā)腫瘤的能力，進(jìn)入周圍組織并擴(kuò)散到機(jī)體內(nèi)，最終導(dǎo)致對集體損傷。CRISPR-Cas9技術(shù)可對DNA序列進(jìn)行編輯，促進(jìn)NFE2L1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及血管生成有關(guān)生化反應(yīng)。

三、結(jié)語

隨著基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展CRISPR-Cas9技術(shù)在肺癌研究領(lǐng)域及多種遺傳疾病研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，也對疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了巨大便利。CRISPR-Cas9技術(shù)作為一個重要基因編輯工具也被應(yīng)用到眾多實(shí)驗(yàn)研究中。近期，CRISPR-Cas9技術(shù)在肺癌相關(guān)研究中成功檢查出NFE2L1有抑癌因子的作用，規(guī)范了以后研究工作。目前，也有研究學(xué)者構(gòu)想出了通過CRISPR-Cas9技術(shù)編輯基因突變位點(diǎn)從而治療G6PD缺乏癥等遺傳疾病，為遺傳疾病治療開拓了空間，并且奠定了理論基礎(chǔ)。CRISPR-Cas9技術(shù)雖相對其他基因編輯技術(shù)有構(gòu)建成本低、靶向修飾效率高、可進(jìn)行多靶點(diǎn)同時編輯等優(yōu)勢，但CRISPR-Cas9仍存在安全性、脫靶效應(yīng)和特異性等問題需要解決，這對胚胎或配子的可遺傳基因組編輯所帶來的風(fēng)險仍無法估測。但是不可否認(rèn)CRISPR-Cas9技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用前景，生物醫(yī)學(xué)科研機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室可對CRISPR-Cas9技術(shù)進(jìn)行完善和拓展，使CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用到更多領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

[1]一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)[J].中國生物工程雜志，2013，（10）：117-123.

[2]王夢瑤，楊亦農(nóng)，邊紅武.基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)修飾新技術(shù)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2014，（05）：426-433.

[3]陳萬青，張思維，鄒小農(nóng).中國肺癌發(fā)病死亡的估計(jì)和流行趨勢研究[J].中國肺癌雜志，2010，（05）：488-493.

[4]徐蕓，羅建明.我國G6PD缺乏癥基因突變的研究現(xiàn)狀[J].中國小兒血液與腫瘤雜志，2009，（03）：143-144.

（作者單位：沈陽市第一中學(xué)）