鈦表面陽極氧化制備仿生化的微納復(fù)合結(jié)構(gòu)

張 孟，王學(xué)玖2，黃曉波

(1.太原理工大學(xué) 表面工程研究所，太原 030024； 2.北京大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，北京 100050)

1 前 言

鈦及鈦合金因具有良好的力學(xué)性能、耐蝕性以及生物相容性而被廣泛應(yīng)用于骨植入體材料領(lǐng)域[1-3]。利用表面仿生改性的方法進(jìn)一步提高其生物活性并用于骨植入材料正逐漸成為研究熱點[4-7]。仿生化方法主要針對植入體在體內(nèi)服役期間因骨整合不佳導(dǎo)致的松動乃至最后的植入失效問題，其基本思路是仿照天然骨組織的微觀形貌(微納復(fù)合結(jié)構(gòu))以及物質(zhì)組成(膠原等有機(jī)物以及羥基磷灰石等無機(jī)物)方面的特點，利用物理、機(jī)械以及化學(xué)方法賦予植入體與骨組織類似的形貌及成分特點，來實現(xiàn)更佳的骨整合效果[5]。微弧氧化(MAO)主要依靠閥金屬(如Zr、Ti、Ta、Mg、Al及其合金)瞬時弧光放電過程產(chǎn)生的高溫高壓條件在其表面原位生長出具有微米級孔的膜層，其主要成分為基體金屬氧化物的陶瓷層[4, 8]。鈦及其合金陽極氧化的研究主要集中于在F-電解液中制備TiO2納米管陣列，利用其與骨組織中膠原纖維結(jié)構(gòu)相似這一特點進(jìn)行仿生學(xué)研究, 同時還可利用其較大的比表面積特點，進(jìn)行功能元素的摻雜以提高其抗菌、骨生成以及血管化等方面的能力[6,9-10]。然而由于制備過程中F-會富集在納米管陣列底部，形成水溶性的富氟層(FRL)，而且各納米管之間并不互相連接，極易產(chǎn)生膜層崩塌破壞，導(dǎo)致結(jié)合力較差，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[11]。因此也有學(xué)者采用其他刻蝕離子對鈦及其合金進(jìn)行陽極氧化制備類似的納米管、孔狀結(jié)構(gòu)研究[12-13]。

2 實 驗

2.1 微納復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備

實驗材料為純鈦(TA2，Φ14×2mm)，采用SiC砂紙打磨并拋光，隨后在丙酮、無水乙醇以及去離子水中分別超聲清洗10min，60℃烘干備用。用銅膠帶將銅導(dǎo)線固定于樣品背面，隨后用硅膠(704#)進(jìn)行封裝，自然晾干后用作陽極。采用直流穩(wěn)壓電源用于陽極氧化，石墨棒(Φ20×100mm)為陰極，Zn(NO3)2水溶液作為電解液，濃度梯度分別為1，5和12g/L，控制氧化電壓分別為15，30，45和60V，室溫下磁力攪拌進(jìn)行陽極氧化5min，處理后的樣品拆除封裝物，再按上述方法超聲清洗、烘干。

2.2 樣品表征

采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FE-SEM，JSM-6700F)對MNT樣品表面微觀形貌進(jìn)行觀察，并用附帶的能譜儀(EDS，QX200)檢測元素組成及含量。采用Nano Measurer軟件對納米孔陣列的孔徑分布進(jìn)行統(tǒng)計。陽極氧化后樣品的表面粗糙度(Ra)采用3D-CLSM(C2 Plus)進(jìn)行定量表征。采用X射線衍射儀(XRD，DX2700)對氧化層的物相組成進(jìn)行檢測。

2.3 細(xì)胞相容性檢測

對60V電壓下硝酸鋅電解液陽極氧化制備的各組樣品進(jìn)行了細(xì)胞相容性評價，拋光純鈦作為對照。采用小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1為體外模型，培養(yǎng)基主要成分包含α-MEM干粉(10.2g/L)、NaHCO3(2.2g/L)、鏈霉素(100μg/ml)和青霉素(100units/mL)，去離子水配置，過濾后加入10vol%胎牛血清(FBS)。細(xì)胞接種密度為2×104cells/cm2。成骨細(xì)胞粘附實驗采用熒光染色的方法進(jìn)行，培養(yǎng)時間分別為0.5，1和4h，到達(dá)時間點后采用DAPI染色，CLSM隨機(jī)拍攝6個視野并統(tǒng)計其細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞活性檢測采用Live/Dead染色法，培養(yǎng)周期為1，3和5d，活細(xì)胞染成綠色，死細(xì)胞則為紅色。成骨分化實驗中細(xì)胞接種至樣品表面，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后，完全培養(yǎng)基添加骨誘導(dǎo)成分培養(yǎng)基骨誘導(dǎo)3和7d，隨后用堿性磷酸酶試劑盒進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡拍照(DM2700 M, 萊卡)。

3 結(jié)果與討論

3.1 微觀形貌

圖1為控制氧化電壓以及電解液濃度制備的氧化層表面形貌照片，選擇低倍下有凹坑的區(qū)域拍攝納米孔陣列。從圖可見，15V電壓下樣品形貌平整、無明顯變化，也未見納米孔陣列的出現(xiàn)。在30，45和60V電壓下，均可制備出在微米級凹坑內(nèi)部規(guī)整排列的納米孔陣列，并且隨電壓及電解液濃度變化，凹坑的起伏有所變化。

圖1 控制氧化電壓以及電解液濃度制備的膜層形貌照片F(xiàn)ig.1 Surface morphology of the samples prepared by controlling the voltage and electrolyte concentration

圖2為納米孔陣列孔徑變化柱狀圖。從圖可見，隨電壓以及電解液濃度增大，納米孔平均孔徑逐漸增大，且保持在20～40nm之間。同時也說明在硝酸根存在的前提下，氧化電壓的大小對于納米孔形成起到了決定性的作用。由圖3的樣品表面粗糙度變化結(jié)果可見，Ra值呈現(xiàn)出隨電解液濃度降低而增大,并且隨氧化電壓升高而增大的趨勢。實驗參數(shù)范圍內(nèi)，粗糙度最大可達(dá)到Ra=2.5μm。并且從圖中還可以看到，電解液濃度的變化對于膜層粗糙度的影響明顯大于氧化電壓。

圖2 微納復(fù)合結(jié)構(gòu)孔徑統(tǒng)計結(jié)果Fig.2 Statistical results of pore diameter on MNT film

圖3 膜層的粗糙度變化Fig.3 Roughness variation of the film

結(jié)合微納復(fù)合結(jié)構(gòu)形貌、孔徑變化以及微觀粗糙度的結(jié)果，得到了以下結(jié)論，在硝酸根電解液下采用陽極氧化也可以制備出微弧氧化電源高電壓加載時類似的微納復(fù)合結(jié)構(gòu)[14]。不同于F-電解液制備出的單一納米管陣列，該微納復(fù)合結(jié)構(gòu)形成過程中存在一定的電壓閾值(30V)。無論采用微弧氧化或陽極氧化電源，都會經(jīng)歷氧化初期大電流放電對于氧化層的擊穿以及刻蝕離子穩(wěn)定刻蝕的階段；另外，單獨(dú)增大氧化電壓或電解液濃度，都會使得納米孔孔徑增大。但是膜層粗糙度隨氧化電壓增大而增大，隨電解液濃度增大而減小，這可能是由于較大的電解液濃度導(dǎo)致溶液電阻增大，進(jìn)而對膜層的擊穿效應(yīng)減弱。

3.2 元素及物相組成

表1為氧化電壓為60V下各組樣品表面元素組成及含量。膜層中含有Ti、O以及少量的C元素。Zn元素含量在0.1at.%左右，因此可以認(rèn)為沒有摻雜到膜層當(dāng)中。根據(jù)Ti、O元素原子比(1∶2左右)可推測膜層主要成分應(yīng)該為TiO2。樣品表面的XRD(圖4)結(jié)果中僅有較強(qiáng)的基體(Ti)峰，并未出現(xiàn)明顯的TiO2峰。這可能是由于采用常規(guī)檢測方法(非小角掠射)，且Ti的氧化物含量較少的原因。實際上，無論采用常規(guī)檢測或小角掠射，XRD結(jié)果中均未檢測到明顯晶態(tài)TiO2物質(zhì)存在，結(jié)合前期工作，可以認(rèn)為硝酸根電解液中陽極氧化制備的樣品表面主要由少量非晶態(tài)的TiO2以及純鈦(Ti#44-1294H)組成[14-15]。

3.3 細(xì)胞相容性

細(xì)胞早期粘附能力如圖5所示。三個培養(yǎng)時間點下，5g/L電解液制備的樣品表面粘附細(xì)胞數(shù)較其他各組顯示了統(tǒng)計學(xué)上的差異，而其他各組之間并無明顯差異。這可能是由于5g/L制備的樣品表面粗糙度較小，而粗糙度的大小會影響成骨細(xì)胞黏著斑蛋白的合成以及細(xì)胞與微納復(fù)合的外基質(zhì)接觸時的界面壓力，進(jìn)而影響細(xì)胞粘附效果[16]。

表1 60V電壓下各組樣品的EDS結(jié)果Table 1 EDS results of each group at 60 V

圖4 60V電壓下各組樣品的XRD圖譜Fig.4 XRD spectra of each group at 60V

圖5 成骨細(xì)胞在微納復(fù)合結(jié)構(gòu)上的粘附能力，*p 表示相對于5g/L下的樣品為一般顯著Fig.5 Osteoblasts adhesion ability on MNT film, *p<0.05 compared to samples anodized in 5g/L electrolyte

圖6 成骨細(xì)胞活性檢測(本刊黑白印刷，預(yù)知具體顏色請聯(lián)絡(luò)作者)Fig.6 Viability assay of osteoblasts

圖6為細(xì)胞活死染色結(jié)果，其中綠色為活細(xì)胞，紅色為死細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時間的延長各組樣品表面綠色熒光強(qiáng)度逐漸增大，而未見明顯的死細(xì)胞(紅色)。除純鈦外，其他各組樣品體現(xiàn)出隨電解液濃度降低，細(xì)胞數(shù)量以及形態(tài)均逐漸變差的趨勢。原因可能是，經(jīng)陽極氧化后，樣品表面由生物惰性的純鈦轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚缘腡iO2膜層，使得其細(xì)胞活性有所提高；另一方面，仿生化的微納米復(fù)合膜層也在一定程度上促使細(xì)胞遷移、增殖等活動受到抑制，使得與細(xì)胞分化相關(guān)的物質(zhì)(諸如骨鈣素、堿性磷酸酶等)提前表達(dá)[17]。從上述的結(jié)果及理論層面來看，具有生物活性的TiO2膜層表面成骨細(xì)胞活性組間差異較大，這主要是由于表面粗糙度對于細(xì)胞的增殖以及分化之間的調(diào)節(jié)作用。

圖7 膜層上成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性Fig.7 ALP activity of osteoblasts on the MNT film

堿性磷酸酶分泌的出現(xiàn)通常被認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)入分化階段的主要標(biāo)志。成骨細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后的ALP活性檢測結(jié)果(圖7)說明，隨著電解液濃度的逐漸降低(Ra增大)，成骨細(xì)胞在樣品表面的ALP活性逐步增強(qiáng)。當(dāng)Zn(NO3)2濃度為5g/L時，成骨細(xì)胞表現(xiàn)出最佳的ALP活性，而濃度為1g/L時反而有所下降。這是因為氧化后的樣品表面粗糙度較大，導(dǎo)致細(xì)胞粘附數(shù)量較少所引起的。另外，平整的表面雖然對細(xì)胞活性或者增殖有一定的促進(jìn)作用，但相比于有微米級形貌的樣品而言，其表面的細(xì)胞較晚結(jié)束細(xì)胞增殖階段，而微米級形貌表面的樣品則較早進(jìn)入細(xì)胞分化階段，因此會顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞分化能力[18]。

4 結(jié) 論

1．采用Zn(NO3)2電解液對純鈦進(jìn)行陽極氧化，在電壓大于30V時可穩(wěn)定形成TiO2微納復(fù)合結(jié)構(gòu)。膜層的表面粗糙度隨電壓增大，隨電解液濃度降低而增大，納米孔孔徑則隨電壓及Zn(NO3)2濃度增大而增大。

2．膜層主要由非晶態(tài)TiO2組成。

3．經(jīng)氧化后的樣品表面粗糙度在Ra=0.8μm左右可以促進(jìn)細(xì)胞的粘附以及ALP活性，較為平整的表面(Ra<0.5μm)則有利于提高細(xì)胞活性。