表面介孔柞蠶絲素蛋白微球的制備及藥物釋放性能

(1.中原工學(xué)院 紡織學(xué)院，河南 鄭州 451191； 2.河南省功能性紡織材料重點實驗室，河南 鄭州 451191)

1 引 言

藥物釋放系統(tǒng)是以高分子作為載體或介質(zhì)，使藥物或其他生物活性物質(zhì)等制劑，按照設(shè)計劑量和可控方式釋放的裝置，以達到緩釋給藥、靶向給藥和智能給藥等目的。在藥物緩釋體系中，藥物載體起著關(guān)鍵性作用，常為微球、微囊和丸劑等形狀[1]。微球比表面積大、吸附性和表面活性高，現(xiàn)已在生物和醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2]。

目前，微球載體主要有海藻酸鈉(SA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、殼聚糖(CS)等及其衍生物以及蠶絲蛋白(SF)等生物降解材料[3]。例如，利用靜電噴霧法制備的CS/康普瑞丁載藥微球，其平均粒徑僅為270nm，但使用戊二醛蒸汽交聯(lián)使其在生物應(yīng)用方面受限[4]。同時，相比CS、PLGA、SA等材料，SF因優(yōu)異的生物相容性及較高的緩釋性等優(yōu)點[5]，目前已廣泛用作藥物、酶和疫苗的載體[6]。近年來，納米和亞微米尺度的絲素微球成為藥物緩釋載體的研究熱點。已報道的制備SF微球方法有乳化法、噴霧干燥法、層流射流技術(shù)和自組裝法等[7]。自組裝法因其簡便性和安全性目前已得到廣泛應(yīng)用。Andreas S. Lammel等[8]利用鹽析法制備粒徑(0.5～2μm)、二級結(jié)構(gòu)和zeta電位可控的絲素微球，并研究了藥物釋放性能。研究表明，微球的形成基于絲素分子間及鏈間相互作用，可以通過調(diào)控pH值和鹽的濃度；微球的藥物釋放性能主要受二級結(jié)構(gòu)和電荷之間相互作用的影響。Cao等[9]利用自組裝的方法制備粒徑在0.2～1.5μm的純絲素微球，通過控制乙醇添加量、凍干溫度和絲素蛋白溶液濃度可以調(diào)控絲素微球的粒徑和分布。Wang等[10]利用SF/聚乙烯醇(PVA)共混—再溶去PVA—低壓凍干制備包埋藥物的SF微球，粒徑在0.3～20μm，控制藥物的分子量及水溶性可以有效調(diào)節(jié)釋放速率和釋放量。Pujiang Shi等[11-12]通過絲素蛋白與乙醇和PVA自組裝制備絲素微球，微球的形貌、粒徑和分布可通過乙醇和PVA的用量調(diào)控。Chen等[13]通過抗癌藥特素和絲素蛋白溶液自組裝，冷凍—解凍3h(快速)制得載藥絲素微球，其載藥率最大可達6.9%，持續(xù)釋放時間超過9d。

以上關(guān)于絲素微球的研究都基于桑蠶絲。與桑蠶絲相比，具有同源性的柞蠶絲(Tussah Silk Fiber，TSF)除具有和桑蠶絲一樣的優(yōu)異性能外，還含有特殊的精氨酸(Arg)―甘氨酸(Gly)―天門冬氨酸(Asp)三肽序列(RGD)。Minoura等[14]的研究顯示，柞蠶絲中特有的RGD三肽序列更有助于細胞的粘附與鋪展。本研究采用自組裝方法制備TSF微球，意在增加其比表面積，獲得表面介孔TSF微球，減少微球初期爆釋和延長微球釋放時間，以期得到能夠應(yīng)用于藥物緩釋的柞蠶絲素微球。

2 實 驗

2.1 材料與試劑

柞蠶繭(去蛹)；磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、一水合氫氧化鋰、硫氰酸銨、磷酸氫二鈉，均為分析純；透析袋(MWCO～14000)；5-氟尿嘧啶(5-Fu)；實驗用水均為去離子水。

2.2 TSF溶液的制備

將柞蠶繭(去蛹)置于0.5%(w/w)Na2CO3溶液于100℃下脫膠3次。將所得的絲素纖維在75 ± 2℃條件下，用硫氰酸鋰(硫氰酸銨和氫氧化鋰合成)溶解2h，浴比為1∶30。溶液過濾后置于透析袋中(MWCO8000～14000Da)透析3d，過濾得到濃度約為0.5%的絲素蛋白溶液，冷藏備用(4℃)。

2.3 TSF微球的制備

將100mL 0.5%的柞蠶絲素蛋白溶液置于透析袋中，緩慢升高水浴溫度至20℃，靜置3d，將所得溶液反復(fù)洗滌并冷凍離心得到微球。稱取所需重量的微球，超聲分散于超純水中配置所需濃度的柞蠶絲素蛋白溶液。同時，進行2組對比實驗，分別將等量的TSF溶液置于-20℃凍干和4℃自然晾干，對比其形貌和結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 載藥TSF微球的制備

使用5-Fu 作為標(biāo)志性藥物，取濃度為1mg/mL 的藥物500mL添加到一定濃度的TSF微球懸浮液內(nèi)，將混合溶液在室溫下分散處理10min，然后高速離心15min。使用紫外可見光分光光度計(UV-Vis)測定溶液中剩余5-Fu最大吸收波長為264nm處的吸光度，計算載藥率(式(1))和負載率(式(2))。所有實驗均重復(fù)3次求平均值。

(1)

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2.5 表征與測試

2.5.1形貌觀察 樣品噴金90s后，用場發(fā)射掃描電鏡(FESEM，Zeiss Supra 55VP)觀察其形貌。同時，隨機抽取100個微球，用圖形處理軟件統(tǒng)計確定微球的粒徑和分布。

2.5.2紅外光譜分析 樣品研磨經(jīng)溴化鉀壓片后，利用紅外光譜儀(IR，NEXUS670)在4000～600cm-1范圍內(nèi)掃描紅外吸收光譜，分辨率為2cm-1。

2.5.3X射線衍射測試 將樣品置于X射線衍射儀(XRD,D/max-2550PC)特有的樣品槽內(nèi)并保持表面平整，采用XRD測試樣品的結(jié)晶程度，掃描速率為2°/min。

2.5.4熱學(xué)性質(zhì) 在50～350℃范圍內(nèi)，用差示熱量分析儀(DSC,DSC822e)測試樣品的熱性能。測試條件：N2流量120mL·min-1，升溫速度為10℃·min-1。

2.5.55-Fu的體外釋放實驗 將100ml負載5-Fu的TSF微球溶液置于透析袋內(nèi)，滴加5mL磷酸緩沖溶液(pH=7.4)，充分震蕩使其分散均勻。然后將透析袋置于1000mL磷酸緩沖溶液(pH=7.4)中37℃震蕩。利用UV-Vis來定期檢測浸漬液在264nm處的吸光度(取10mL浸漬液，補充10mL磷酸緩沖液)，依據(jù)朗伯比爾定律計算TSF微球中5-Fu的釋放曲線。所有實驗均重復(fù)3次，求平均值。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 TSF微球的微觀形貌及載藥性分析

不同溫度成形條件下TSF制品的SEM照片如圖1所示。從圖可見，不同條件所制得的TSF制品形貌有明顯差異。經(jīng)過-40℃凍干形成TSF凍干膜，含有大量纖維狀物質(zhì)，多孔結(jié)構(gòu)明顯，但未見微球存在(圖1(a))。TSF膜(室溫晾干)體系均一，表面平整光滑，成膜性良好(圖1(c))。20℃自組裝晾干后所得產(chǎn)物為TSF凝膠微球(圖1(b))，微球大小均勻，粒徑在1.06±0.85μm，但微球之間粘連緊密，無法在溶液中直接分散，限制了其在藥物釋放中的應(yīng)用。TSF溶液在20℃水浴中自組裝后離心可制得單分散的TSF微球(圖1(d))，其形貌近似球形，基本無粘連。經(jīng)統(tǒng)計計算，其粒徑大小為500nm～6μm(圖2)。較寬的粒徑分布可能有助于藥物釋放速率的控制。與一般微球相比(表面光滑)，所制的TSF微球表面分布有許多小孔，具有多孔結(jié)構(gòu)，且孔的形狀均勻規(guī)則，孔與孔之間相互貫通(如圖1(e)～(f))，這些小孔有利于物質(zhì)之間的交換或傳遞。微球的形成主要是由于組成TSF中的疏水鏈段疏水鍵的作用形成晶核，親水鏈段和疏水鏈段依次交替沉積，形成微球結(jié)構(gòu)[15]。其表面介孔結(jié)構(gòu)的形成可能是自組裝微球表面沒有形成氫鍵的—COOH和—NH2締合微量的水分子，離心干燥后，水分蒸發(fā)所致。

實驗所制備出的不同結(jié)構(gòu)的TSF蛋白材料的載藥性具有較大的差異。TSF膜、凍干膜(海綿體)和凝膠微球的載藥率和負載率均較低，TSF膜的載藥性較差(載藥率為0.3%，負載率為3.2%)。凝膠微球的載藥率和負載率略有提高，達到0.7%和8.6%。TSF凍干膜的載藥率和負載率僅為1.2%和11.7%。所制備的單分散表面介孔微球的載藥性顯著提高，載藥率達到2.6%，負載率達到30.4%，TSF生物相容性良好，是理想的藥物載體。由于所制備材料均為TSF，說明材料的物理結(jié)構(gòu)，尤其是比表面積和表面微細結(jié)構(gòu)對材料的載藥性有明顯影響。

3.2 FTIR分析

圖3 不同TSF制品的紅外光譜 (a) 凍干膜(-40℃)； (b) 膜(4℃晾干)； (c) 單分散微球(20℃水浴，離心)Fig.3 FTIR spectra of TSF products (a) freeze-dried membrane(-40℃), (b) membrane(airing at 4℃), and (c) monodisperse microspheres (water bath at 20℃,centrifugal purification)

TSF的二級結(jié)構(gòu)具有不同的紅外吸收峰。其中，α-螺旋結(jié)構(gòu)紅外吸收峰在1660～1650cm-1(酰胺Ⅰ)和1550～1540cm-1(酰胺Ⅱ)處；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)在1650～1640cm-1(酰胺Ⅰ)、1545～1535cm-1(酰胺Ⅱ)和1235cm-1(酰胺Ⅲ)處，而β-折疊結(jié)構(gòu)的紅外吸收峰位于1640～1610cm-1(酰胺Ⅰ)、1525～1515cm-1(酰胺Ⅱ)和1265cm-1(酰胺Ⅲ)處[15]。圖3給出了不同條件下TSF制品的紅外光譜。3275cm-1處的強吸收峰歸屬于蛋白質(zhì)N-H伸縮振動峰。864cm-1處的吸收峰歸屬于TSF酪氨酸的吸收峰。TSF凍干膜和晾干膜的主要紅外吸收峰均出現(xiàn)在1650cm-1和1540cm-1附近(圖3a、b)，表明其主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在。

但表面介孔TST單分散微球具有特殊的二級結(jié)構(gòu)(圖3c)。酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的吸收峰分別出現(xiàn)在1635cm-1和1515cm-1附近，表明TSF微球主要以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。同時酰胺Ⅲ(1235cm-1處)的吸收峰明顯增強，表明無規(guī)卷曲構(gòu)象增多。微球結(jié)構(gòu)的變化是由于在TSF組裝成微球的過程中，α-螺旋結(jié)構(gòu)TSF分子的疏水鏈段依靠疏水作用規(guī)整排列形成晶核，未形成晶核的親水鏈段相互纏結(jié)，結(jié)晶沉降自組裝卷曲成為微球，而外層分子排列不均勻，形成無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。864cm-1處酪氨酸的吸收峰明顯增強，也說明表面富含極性氨基酸，進一步證實TSF微球表面形成介孔結(jié)構(gòu)的推測。

3.3 XRD分析

以往研究中，研究者一般通過醇處理誘導(dǎo)TSF產(chǎn)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變形成β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)來提高TSF材料的穩(wěn)定性，但可能存在醇的殘留。樣品的XRD圖譜如圖4所示，表面介孔TSF微球的結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。TSF膜在11.9°和22.97°附近出現(xiàn)歸屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[15]，表明TSF主要是以α-螺旋結(jié)構(gòu)存在(圖4(a))。表面介孔TSF單分散微球在19.84°附近顯示很強的尖峰，在16.84°和23.89°附近分別出現(xiàn)兩個肩峰，在29.1°、39.31°和43°附近均出現(xiàn)弱的衍射峰(圖4(b))，說明TSF微球主要以β折疊結(jié)構(gòu)為主[16]。這與FTIR分析結(jié)果相一致。

圖4 TSF制品的XRD圖譜 (a) 膜(4℃晾干)； (b) 單分散微球(20℃水浴，離心)Fig.4 XRD patterns of TSF membranes (a) and monodisperse TSF microspheres (b)

圖5 TSF制品的差示掃描熱分析曲線 (a) 膜(4℃晾干)； (b) 單分散微球(20℃水浴，離心)Fig.5 DSC curves of TSF membranes (a) and monodisperse TSF microspheres (b)

3.4 熱性能分析

圖5為TSF膜和表面介孔TSF微球的DSC曲線。再生TSF膜在348℃處出現(xiàn)熱分解峰，在200～250℃區(qū)域顯示吸熱-放熱轉(zhuǎn)變，這應(yīng)該是由β折疊構(gòu)象增加引起的[16]。

表面介孔TSF微球DSC曲線與再生TSF膜的有明顯差異。在200～250℃區(qū)域的吸熱-放熱轉(zhuǎn)變基本消失，表明微球中TSF分子主要為β結(jié)構(gòu)。這與前面IR和XRD的分析結(jié)果一致。這是由于TSF自組裝過程中，溫度誘導(dǎo)TSF分子產(chǎn)生晶核并形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

3.5 5-FU的體外釋放性能

表面介孔TSF微球?qū)?-FU具有明顯的緩釋作用(如圖6所示)，且隨著時間的增加，緩釋量增加。在前2h內(nèi)，藥物有一個小突釋，釋放量約20%(小于40%，不構(gòu)成突釋現(xiàn)象)[17]。這可能是TSF微球表面及空隙間吸附少量的5-FU解吸附或負載在TSF微球無定型區(qū)的5-FU隨該區(qū)的溶脹快速釋放所致。隨后5-FU穩(wěn)定緩慢釋放，在120 h 能有效釋放90%?？赡苁?-FU負載的TSF微球具有多分散的粒徑及表面和內(nèi)部連通的孔洞，使得5-FU具有不同的解吸附速率，延長其緩釋時間。說明包載5-FU的表面介孔TSF微球釋放較為平緩，穩(wěn)定性好，緩釋效果顯著。此法能夠在非高溫、不攪拌、水溶液中的溫和條件下制備表面介孔TSF微球，不損傷其生物活性。這說明表面介孔TSF微球是一種有潛力的基因類藥物控釋材料。

圖6 5-FU負載TSF微球的體外釋放圖譜Fig.6 In vitro 5-FU release profiles of TSF monodisperse microspheres

本研究所制備的表面介孔TSF微球粒徑范圍為500nm～6μm，表面分布有許多形狀規(guī)則均勻的多孔結(jié)構(gòu)。構(gòu)象以β-折疊結(jié)構(gòu)為主，同時存在無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在前2h內(nèi)，藥物有一個20%小突釋，隨后5-FU穩(wěn)定緩慢釋放，在120h能有效釋放90%，這表明表面介孔TSF微球?qū)?-FU緩釋能力顯著。較寬的粒徑分布、多孔結(jié)構(gòu)及特殊的二級結(jié)構(gòu)可能有助于藥物釋放速率的控制。表面介孔TSF微球是一種有潛力的基因類藥物控釋材料。