富血小板血漿(PRP)裂解液在苯扎溴胺誘導(dǎo)的小鼠干眼治療中的作用△

胡曉琴 張夢瑤 朱佩文 袁晴 黎彪 葛倩敏 梁榮斌 李秋玉 邵毅

干眼是一種由多種原因引起的眼表組織病變，伴有淚膜滲透壓增加，眼表炎癥加劇，可引起眼部不適、視覺障礙等，損害角膜和結(jié)膜。苯扎溴胺是一種陽離子表面活性劑，能改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，影響細(xì)菌的生長代謝，起著較好的殺菌作用。眼用制劑中的苯扎溴胺等抑菌劑能保持滴眼液的穩(wěn)定性和藥物穿透力，提高藥效，但過度使用不僅可能降低角膜、結(jié)膜上皮細(xì)胞屏障功能，而且其去垢作用還會使淚膜被破壞，加速角膜表面的水分蒸發(fā)，影響淚液分泌，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降，引起干眼。

人富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)裂解液含有多種促進(jìn)細(xì)胞再生的生長因子，可修復(fù)受損眼表，大幅度提升嚴(yán)重干眼的治療效果。本實驗?zāi)康脑谟谘芯咳薖RP滴眼液對苯扎溴胺導(dǎo)致的干眼小鼠眼表組織結(jié)構(gòu)的影響與治療效果，為臨床上PRP治療干眼患者提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物在室溫25 ℃、濕度60%、12 h明暗周期(早上800至晚上800)的條件下，飼養(yǎng)由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供的成年健康BALB/c小鼠36只[1]，均為雄性，體質(zhì)量18～21 g。本實驗中所有小鼠喂養(yǎng)和研究過程均遵循《實驗動物管理條例》，符合動物倫理學(xué)要求。

1.2 苯扎溴銨和PRP眼液的制備制備苯扎溴銨滴眼液(用其制作干眼模型)：將苯扎溴銨稀釋于無菌PBS中，制得濃度為1 g·L-1苯扎溴銨滴眼液，在4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

PRP滴眼液的制備：在4 ℃、無菌條件下采集20 mL人靜脈血于抗凝管(枸櫞酸鈉管)中，先將全血離心10 min(轉(zhuǎn)速1500 r·min-1)，離心后把血漿和上層三分之一的血細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的無菌管中，初步分離出血漿與血小板。分離后，2500 r·min-1離心10 min，取5～6 mL無沉淀的上清液冷藏保存[2]。制備過程不同，所得PRP內(nèi)生長因子的濃度也會有所不同，其中血小板數(shù)量可達(dá)到1012個·L-1。

1.3 方法

1.3.1 實驗?zāi)Ｐ图胺纸M36只小鼠同時用苯扎溴胺滴眼液滴眼，制作動物干眼模型[2]。將36只干眼模型小鼠隨機(jī)分為3組(每組12只)：PRP滴眼的A組、PBS滴眼的B組和不作任何處理的模型組。A、B組每天滴眼3次，連續(xù)給藥2周。在干預(yù)前和干預(yù)后1周、2周分別對3組小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)淚液分泌試驗(SchirmerⅠtest，SⅠT)及角膜熒光素染色(fluorescein staining，F(xiàn)L)。

1.3.2 SⅠT檢測將酚紅棉線的一端放置在小鼠右眼外眥中外1/3交界處，計時1 min后測量紅色部分長度以換算淚液分泌量。該實驗應(yīng)在同一條件(時間、地點、照明亮度、濕度及溫度)下由同一人進(jìn)行相同操作[3]。

1.3.3 FL染色及評分角膜FL染色：該實驗?zāi)康氖怯^察小鼠角膜上皮的受損程度。同樣，實驗應(yīng)在同一條件(時間、地點、照明亮度、濕度及溫度)下由同一人進(jìn)行相同操作。評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[3]。

1.3.4 共聚焦顯微鏡觀察采用Confoscan4裂隙掃描共聚焦顯微鏡(NidekCi LTD，日本)檢查。首先調(diào)整小鼠放置支架至合適高度，連接共聚焦顯微鏡總電源，打開儀器和軟件以選擇有價值的圖像與錄像存盤并設(shè)置文件夾名稱。觀察前應(yīng)先清潔顯微鏡前表面，在鏡頭前滴適量的卡波姆凝膠，安裝角膜接觸帽，轉(zhuǎn)動角膜顯微鏡，將平面移至角膜接觸帽外表面，對好顯微鏡頭，調(diào)整焦平面。待小鼠眼表麻醉后，將其頭部固定在顯微鏡前，使其雙眼直視正前方，當(dāng)鏡頭移動至角膜上皮細(xì)胞時，緩慢向前推進(jìn)，于中央角膜處進(jìn)行全層掃描并獲取圖像。觀察3組小鼠干預(yù)前和干預(yù)后角膜上皮基底細(xì)胞的炎癥反應(yīng)情況和角膜上皮基底膜下神經(jīng)的分布，并計算炎癥細(xì)胞密度。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)前后三組各時段SⅠT和角膜FL染色情況比較干預(yù)前，三組小鼠的SⅠT差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后1周和2周，模型組和B組SⅠT較干預(yù)前有輕微改善，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；而A組SⅠT較干預(yù)前有明顯改善，且干預(yù)1周后，比B組和模型組均有較大改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

干預(yù)前，3組FL評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后1周、2周，模型組和B組FL評分較干預(yù)前相比有輕微的下降，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，而A組FL評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后1周、2周，A組與模型組、B組相比，F(xiàn)L評分顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。見表1。

表1 干預(yù)前后3組各時段SⅠT和角膜FL評分情況比較

注：與模型組相比，*P<0.05；與B組相比，#P<0.05；與干預(yù)前相比，△P<0.05

2.2 3組干預(yù)前后角膜上皮基底膜下神經(jīng)比較干預(yù)前3組角膜上皮基底膜下神經(jīng)纖維密度、纖維分支數(shù)和曲率評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。模型組和B組在干預(yù)后角膜上皮基底膜下神經(jīng)纖維密度、神經(jīng)纖維分支數(shù)及曲率評分較干預(yù)前變化不大(均為P>0.05)；干預(yù)2周后，A組角膜上皮下神經(jīng)纖維密度較干預(yù)前升高(P<0.05)，其他指標(biāo)無明顯變化，且與B組和模型組相比，角膜上皮下神經(jīng)纖維密度和纖維分支數(shù)明顯增加，曲率評分顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。結(jié)果表明，使用A組滴眼液預(yù)防性滴眼可以顯著保護(hù)角膜上皮下神經(jīng)，有效減緩干眼炎癥對神經(jīng)的損害。見表2。

表2 三組干預(yù)前后角膜上皮基底膜下神經(jīng)比較

注：與模型組相比，*P<0.05；與B組相比，#P<0.05；與干預(yù)前相比，△P<0.05

2.3 3組干預(yù)前后角膜上皮基底細(xì)胞中炎癥細(xì)胞分布情況正常角膜上皮基底細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下胞體較暗，邊界較窄。干預(yù)前3組角膜可見較多光亮的炎癥細(xì)胞，3組無明顯差異(圖1)；干預(yù)2周后，模型組(圖2A)可見較多光亮的炎癥細(xì)胞，基底細(xì)胞密度稍有減少，而A組(圖2B)角膜上皮基底細(xì)胞密度明顯增加，炎癥細(xì)胞密度與干預(yù)前及B組(圖2C)相比明顯降低，存在光亮的炎癥細(xì)胞但數(shù)量較少，B組(圖2C)可見較多光亮的炎癥細(xì)胞，角膜基底細(xì)胞密度略有減少。細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)2周后，A組上皮基底細(xì)胞和炎癥細(xì)胞密度與其他兩組相比有顯著改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。結(jié)果說明PRP滴眼液的預(yù)防處理可以有效控制炎癥，控制干眼的進(jìn)展。見表3。

表3 3組干預(yù)后角膜上皮基底細(xì)胞和炎癥細(xì)胞比較

注：與模型組相比，*P<0.05；與B組相比，#P<0.05

圖2 3組干預(yù)后角膜上皮基底細(xì)胞中炎癥細(xì)胞分布情況。A：模型組；B：A組；C：B組

3 討論

PRP是由全血先離心分離出血漿和紅血球后，再離心取上清液等方式獲取得到的，血小板計數(shù)為全血的3倍以上，且含有大量促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)與再生的生長因子，如血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等，并由于PRP的制取不添加任何防腐劑所以安全性較高。隨著臨床上應(yīng)用PRP來治療皮膚潰瘍[1]、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎[2]等軟組織損傷，促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖[3]、骨折愈合[4]及修復(fù)等骨科和其他方面應(yīng)用有一定的發(fā)展。

目前，PRP在眼科的研究也逐漸增多，已經(jīng)被證實可以促進(jìn)移植后持續(xù)性角膜缺損再上皮化[5]，治療神經(jīng)營養(yǎng)性角化病[6]等。前者在角膜潰瘍?nèi)睋p的治療過程中，血小板水平起關(guān)鍵性作用；后者由于三叉神經(jīng)的損傷導(dǎo)致神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)和生長因子缺乏，難以維持眼表的穩(wěn)態(tài)。而干眼則是由于各種因素引起眼表穩(wěn)態(tài)喪失所致的疾病，所以富含生長因子和細(xì)胞因子的PRP有著明顯的療效。從我們的研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，PRP對苯扎溴銨所致的干眼有明顯的治療效果，其角膜FL評分明顯下降意味著對苯扎溴銨所致的角膜損傷有明顯的修復(fù)作用，且在很大程度上改善了干眼的相關(guān)癥狀。本結(jié)果和其他研究可以得出相同的結(jié)論，PRP對于角膜有著極佳的修復(fù)作用。Dai等[7]通過低濃度PRP的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度PRP對角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖及活化有顯著促進(jìn)作用，這在一定程度上可以解釋PRP修復(fù)的相關(guān)機(jī)制。

臨床研究表明，長期使用含苯扎溴銨滴眼液的患者對眼表相關(guān)組織和細(xì)胞有不同程度損傷[8]，患干眼的可能性也有不同程度的上升，且隨著滴眼液用量的增加，患病率也增加[9]。PRP在以往取得的研究中被證實有助于干眼時角膜上皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，時間越長，含量越高，其促增殖作用越明顯，并呈現(xiàn)依賴性[10]。本實驗中，PRP滴眼液較快而明顯地改善了苯扎溴胺誘導(dǎo)的小鼠干眼癥狀，對干眼的治療達(dá)到了較為理想的效果，較好維持了淚液蛋白成分，也改善了干眼導(dǎo)致的淚液分泌量減少。此外，滴用PRP的小鼠角膜上皮下神經(jīng)纖維密度、纖維分支數(shù)和曲率評分的統(tǒng)計結(jié)果均明顯優(yōu)于其他兩組，且干預(yù)2周后，A組炎癥細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)少于B組和模型組，而上皮基底細(xì)胞密度較B組和模型組明顯升高，這意味著，PRP相較于臨床上傳統(tǒng)的角膜修復(fù)類藥物有著更廣泛的效果，在修復(fù)角膜的同時，可以對角膜神經(jīng)的損傷進(jìn)行不同程度的修復(fù)，且具有一定的抗炎作用。有研究證實，自體PRP治療干眼的療效，由于不添加任何防腐劑，該產(chǎn)品耐受性好，患者幾乎無不良反應(yīng)，同時，PRP對細(xì)胞培養(yǎng)的炎癥模型有更強(qiáng)的增殖和抗炎作用[11]，這和我們所得的實驗結(jié)果可以得出相似的結(jié)論。由此可見，PRP治療干眼的高效性、副作用少、用藥方式簡單已足夠表明其具有廣泛應(yīng)用于眼表疾病的價值，尤其在治療干眼方面具有一定的優(yōu)勢。

但是，PRP的使用仍存在一定的局限性。由于PRP制備方式并不完全一致，所以PRP在臨床治療時應(yīng)針對不同疾病選擇不同的方式，所得的療效有所不同，但由于目前缺乏大量臨床研究，不同疾病所對應(yīng)的制備方式尚無統(tǒng)一定論。同時，選擇恰當(dāng)?shù)牡嗡帟r間對眼表的恢復(fù)也有很大的影響[12]，有研究表明，損傷炎癥期立即使用PRP對組織愈合可發(fā)揮最大作用，這意味著PRP的臨床應(yīng)用要求臨床醫(yī)生需要對應(yīng)用時機(jī)有較高的把握能力，且需要大樣本的研究確定具體的使用時機(jī)及持續(xù)治療時間。

綜上所述，PRP滴眼液滴眼可以防止淚液蛋白隨著干眼的進(jìn)展而惡化，維持淚膜穩(wěn)定，防止炎癥加劇，減緩苯扎溴胺誘導(dǎo)的干眼對神經(jīng)的損害，控制干眼的進(jìn)一步發(fā)展。