角膜基質(zhì)透鏡淚道栓治療兔干眼的實驗研究△

李娟 周穎 李康寯 白海燕 馬愛潔 譚鋼 李勇

目前，干眼是除屈光不正以外最常見的眼科疾病，我國的流行病學(xué)調(diào)查顯示，40歲以上的人群發(fā)病率為21%～30%，在眼科門診中，干眼患者約占所有病例的30%以上，輕者常表現(xiàn)為眼睛干澀、異物感、癢、燒灼感、畏光、眼部充血、視物模糊、易疲勞等不適癥狀，而嚴(yán)重者甚至可以致盲[1]。淚道栓是一種人為堵塞淚液排出系統(tǒng)而增加自然淚液在眼表的停留時間，以減少干眼體征和癥狀的一種相對安全、有效和可逆的物理治療方法。目前，關(guān)于淚道栓材料的研究相對較多[2-3]，主要分為可降解和不可降解兩種類型，但是無論是可降解還是不可降解材料，大都是各種化學(xué)材料聚合而成。因此，角膜基質(zhì)透鏡淚道栓，即將全飛秒激光手術(shù)微小切口基質(zhì)透鏡切除術(shù)(small incision lenticule extraction，SMILE)中獲得的人源性角膜基質(zhì)透鏡進(jìn)行一定程度的物理加工改造制成淚道栓，相比之下具有抗原性低、組織相容性好的優(yōu)勢。本研究通過建立苯扎氯銨誘導(dǎo)的兔干眼模型，探討角膜基質(zhì)透鏡淚道栓對兔干眼的治療效果，以便為臨床上開發(fā)新的治療干眼的方法提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料角膜基質(zhì)透鏡淚道栓(中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01811457265.9)，采用由全飛秒激光 SMILE 手術(shù)所得的角膜基質(zhì)透鏡作為材料，術(shù)中取得后保存于裝有PBS液的EP管中，經(jīng)PBS液洗滌后卷曲、冷凍干燥、紫外照射殺菌等步驟處理后制成短棒狀(直徑1.0～1.4 mm、長度5～6 mm)的淚道栓，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實驗動物24只(48眼)健康成年新西蘭大白兔，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節(jié)、眼底無異常。在整個研究過程中將24只新西蘭大白兔置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：室溫(25±1)℃，濕度(60±10)%，交替12 h明暗周期(800～2000)。所有大白兔都給予相同的水量和食物。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動物實驗符合視覺與眼科協(xié)會規(guī)定的對于動物眼科和視覺研究的使用，同時獲得了西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組24只健康成年新西蘭大白兔隨機(jī)分為 A、B、C 3組，每組各8只(16眼)。除C組作為正常對照的8只不予處理外，其余16只均采用 1 g·L-1苯扎氯銨滴雙眼，每天2次，連續(xù)2周，建立中重度干眼模型。A組為實驗組，于造模結(jié)束后予以置入角膜基質(zhì)透鏡淚道栓治療；B組為模型組，造模后不予治療；C組為正常對照組。分別在干預(yù)后0周、2周、4周、6周觀察實驗兔淚膜功能，相關(guān)檢查包括Schirmer淚液分泌試驗(SchirmerⅠtest，SⅠT)、淚膜破裂時間(break-up time，BUT)、角膜熒光素染色(fluorescein staining，F(xiàn)L)評分。B組于造模結(jié)束(干預(yù)2周后)收集實驗動物角膜及淚道組織，干預(yù)6周后收集其余各組角膜及淚道組織，行蘇木精-伊紅染色觀察角膜上皮情況及透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2 SⅠT檢測取有刻度的淚液分泌試紙條(5 mm×35 mm)，將一端反折輕輕置于被測兔眼下結(jié)膜囊的中外1/3處，其余部分懸空垂直于皮膚表面，記錄5 min后取出濾紙上淚痕的長度。每組動物均由同一人檢查，每次檢查時間、地點、溫度、濕度及照明亮度相同。

1.2.3 BUT檢測使用1滴(1 μL)10 g·L-1熒光素鈉滴眼，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個破裂點的時間。進(jìn)行每次檢查時應(yīng)注意控制變量，應(yīng)由同一人在相同的時間、地點、照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.4 角膜FL評分使用1滴10 g·L-1(1 μL)熒光素鈉滴眼，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察各組兔角膜上皮缺損的部分及范圍。評分參考文獻(xiàn)[4]將角膜劃分為4個象限，每一象限0～3分，每個象限評分標(biāo)準(zhǔn)為：(1)0分：無染色；(2)1分：輕度染色<5個點；(3)2分：中度染色≥5個；(4)3分：重度染色≥5個點并有絲狀染色或潰瘍，總分上限為12分。

1.2.5 HE染色于相應(yīng)時間點收集各組角膜及淚道組織，40 g·L-1多聚甲醛固定24 h后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后浸蠟、包埋，之后平行于眼軸方向切片，厚度為4 μm，行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.6 透射電子顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察角膜標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛內(nèi)固定2 h，經(jīng)10 g·L-1鋨酸固定1 h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋、修塊，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于透射電子顯微鏡及掃描電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組干預(yù)前后干眼檢測指標(biāo)結(jié)果比較

2.1.1 淚液分泌量及BUT比較干預(yù)前淚液分泌量各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后2周(即造模后)，A組、B組淚液分泌量及BUT顯著減少，干預(yù)前后差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)，與C組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。實驗第4周，A組淚液分泌量及BUT顯著增加，B組較前稍增加 (均為P<0.05)，實驗第6周，A組、B組淚液分泌量及BUT較第4周無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，A、B組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1和表2。

表1 各組兔干預(yù)前和干預(yù)后不同時間淚液分泌量比較

表2 各組兔干預(yù)前和干預(yù)后不同時間BUT比較

2.1.2 角膜FL染色及評分角膜FL染色顯示：A組角膜經(jīng)基質(zhì)透鏡淚道栓干預(yù)后2周基本透明，未見明顯熒光素著染(圖1A)；而B組角膜中央?yún)^(qū)及下方均可見點片狀著染(圖1B)；C組角膜透明，未見著染(圖1C)。FL染色評分見表3，干預(yù)后4周、6周A組角膜FL染色評分均明顯減少(均為P<0.05)。見表3。

圖1 各組兔角膜FL染色情況。A：A組；B：B組；C：C組

表3 各組兔干預(yù)前和干預(yù)后不同時間FL染色評分情況比較

2.2 各組角膜HE染色比較HE染色結(jié)果顯示，經(jīng)角膜基質(zhì)透鏡淚道栓治療后，A組角膜上皮細(xì)胞排列整齊，基本趨于正常(圖2A)。苯扎氯銨滴眼2周后，B組角膜上皮細(xì)胞層數(shù)開始增多，上皮厚度增加，翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂，同時伴有表層上皮細(xì)胞損傷、脫落，角膜表面欠光滑(圖2B)。C組正常角膜上皮由整齊排列的4～6層上皮細(xì)胞組成，基底細(xì)胞為一單層柱狀上皮細(xì)胞層，排列緊密、整齊(圖2C)。

2.3 各組角膜超微結(jié)構(gòu)的變化正常角膜上皮細(xì)胞會向外伸出許多微絨毛和微皺襞，排列整齊。透射電子顯微鏡下可見，A組干預(yù)后6周表層上皮細(xì)胞向外可見豐富的微絨毛，呈指狀突起，排列較規(guī)則(圖3A)；B組角膜上皮微絨毛可見明顯減少，微絨毛形態(tài)也與A組和C組有很大差別，偶見指狀突起，大部分微絨毛變短，可見脫落，排列紊亂(圖3B)；C組微絨毛形態(tài)正常，排列規(guī)則、整齊(圖3C)。

圖2 各組兔干預(yù)后6周角膜HE染色情況。A：A組；B：B組；C：C組

圖3 各組兔干預(yù)后6周角膜上皮細(xì)胞微絨毛形態(tài)比較(×30 000)。A：A組；B：B組；C：C組

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)今全球有14%～33%的人被干眼所困擾，由此可見，干眼已經(jīng)成為一個重要的公眾健康問題[5]。干眼的癥狀通常包括干澀、畏光、燒灼感、刺痛、瘙癢、眼疲勞、疼痛和充血等不適。目前干眼尚無治愈方法，但是有很多可供選擇以減輕癥狀的治療策略。淚液替代品，又稱為人工淚液，可以改善眼部表面的潤滑和增強(qiáng)眼表濕度而減輕干眼的癥狀，是目前治療干眼的主要方法[6]，因其為局部給藥，給藥的便捷性和依從性高而廣為人們所接受和偏愛。然而，使用人工淚液僅能提供短期的癥狀緩解，并不能解決長期潛在的問題。而淚道栓作為一種小型的醫(yī)用植入物[7]，通過暫時或永久阻塞淚液引流的通道而使淚液的積聚增加，從而保持眼表的濕潤，對長期潛在的問題提供了解決辦法。自1975年推出以來，許多由不同材料和設(shè)計的淚道栓逐漸進(jìn)入醫(yī)療領(lǐng)域。根據(jù)其在淚道中是否降解，分為可吸收淚道栓和不可吸收淚道栓。用于制成可吸收淚道栓的材料主要有明膠、腸線和羥丙基纖維素，最常用的臨時淚道栓是用于短期阻塞淚道的膠原栓[8-10]。然而，如果使用人體來源的角膜基質(zhì)透鏡作為生物材料，那相對于這些商業(yè)化的植入物在組織相容性上可能會有一定的優(yōu)勢。

近年來，全飛秒激光SMILE已成為矯正近視和散光的主要方式之一，手術(shù)中利用飛秒激光儀精準(zhǔn)定位后，在角膜基質(zhì)層內(nèi)立體切割出一定大小和厚度的透鏡，然后經(jīng)過周邊角膜微小切口取出，從而達(dá)到屈光矯正的目的[11]。對于術(shù)中取出的基質(zhì)透鏡往往是直接廢棄，如何更好地利用SMILE手術(shù)的副產(chǎn)品？目前，國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報道將取下的角膜基質(zhì)透鏡用于角膜移植的植片，對一些難治性角膜潰瘍、角膜穿孔或者角膜局部厚度缺陷進(jìn)行治療或修補(bǔ)[12-16]，以及將取下的角膜基質(zhì)透鏡移植到角膜基質(zhì)層中用以治療圓錐角膜或遠(yuǎn)視，而且未見諸如同種異體排斥或角膜混濁等明顯的術(shù)后并發(fā)癥報道，說明角膜基質(zhì)透鏡組織相容性好。治療干眼所用的淚道栓作為一種植入材料，對組織相容性也有較高的要求，因此，我們設(shè)計將SMILE術(shù)取出的角膜基質(zhì)透鏡制成短棒狀的淚道栓用于干眼的治療，以期對干眼的治療提供安全有效的新方法。

本研究選取SMILE術(shù)后直徑為 6.5 mm、中央厚度為 100～150 μm的角膜基質(zhì)透鏡為原材料，用 3～4片堆疊卷曲，經(jīng)真空冷凍干燥及紫外照射殺菌處理后制成長度為5～6 mm、直徑1.0～1.4 mm且有一定硬度的短棒狀栓子，用鑷子夾取植入兔淚道中，直至淚道栓的端點在淚小點口不可見，以避免淚道栓外露對角結(jié)膜造成損傷。體外觀察發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)透鏡淚道栓經(jīng)淚液浸泡，會再次變軟并且有一定程度的膨脹，但并不會由卷曲狀散開，考慮角膜基質(zhì)透鏡實質(zhì)為角膜組織，吸水會引起一定程度的水腫，又因人角膜基質(zhì)為中層結(jié)締組織，其間可能具有一定的組織黏附性而使其不易分散?；|(zhì)透鏡淚道栓植入兔淚道后行淚道沖洗，可見少量液體從兔鼻腔漏出，說明基質(zhì)透鏡淚道栓并未將兔淚道完全栓塞，從而避免了干眼兔經(jīng)栓塞治療后出現(xiàn)流淚、溢淚的可能，干預(yù)后6周，透鏡組織未出現(xiàn)外排現(xiàn)象，并且實驗動物未出現(xiàn)分泌物增多、眼部充血、溢淚等不適癥狀，而且檢測結(jié)果提示，干眼兔經(jīng)基質(zhì)透鏡淚道栓治療后，SⅠT延長，角膜FL評分下降，組織學(xué)觀察也證實A組的角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)相對于B組有很明顯的改善，因此我們得出結(jié)論：基質(zhì)透鏡淚道栓對干眼癥狀能夠起到一定的治療效果，因此短期植入基質(zhì)透鏡淚道栓治療干眼是相對安全有效的，但是長期療效仍需進(jìn)一步隨訪觀察。

綜上所述，角膜基質(zhì)透鏡作為一種新型材料，在不添加任何化學(xué)成分、完全以物理方法制備成淚道栓植入淚道，保證了良好的組織相容性，同時達(dá)到部分栓塞淚小點的目的，減少了淚液的排出，以增加淚液在眼表的停留時間，從而為干眼的治療提供了安全有效的新方法。