高眼壓猴視盤和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞復(fù)合體的縱向變化△

劉克高 彭曉燕 章征 孫華 楊迪亞 王寧利

高眼壓是青光眼發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素。高眼壓導(dǎo)致的青光眼性視神經(jīng)病變是一種慢性、進(jìn)行性、不可逆性病變。為了早期診斷青光眼，臨床上一直關(guān)注視盤的變化。由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物(猴)的視盤在解剖學(xué)上與人類非常相似，所以用激光光凝猴中部小梁網(wǎng)誘導(dǎo)的慢性高眼壓模型是最適合研究青光眼的動(dòng)物模型。從組織學(xué)方面獲得的橫斷面研究證據(jù)已經(jīng)證明高眼壓猴可以出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer，RNFL)變性和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞丟失[1-3]。但是，青光眼性視網(wǎng)膜病變，特別是高眼壓引起的黃斑區(qū)損害卻一直被忽視。應(yīng)用光學(xué)相干斷層成像(optical coherence tomography，OCT)可以在活體縱向觀察視盤、RNFL厚度和黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)層的形態(tài)學(xué)變化。OCT的隨訪模式可以在同一個(gè)體連續(xù)記錄視盤和黃斑區(qū)的縱向變化。在以往的研究中，我們?cè)褂肙CT測(cè)量了正常猴的視盤和RNFL厚度。結(jié)果表明在正常猴用OCT測(cè)量視盤、RNFL厚度和黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)層有很高的重復(fù)性和重現(xiàn)性[4]，因此OCT非常適合隨訪檢查實(shí)驗(yàn)性高眼壓猴。為了防控青光眼，有必要研究從高眼壓到青光眼性視神經(jīng)病變和青光眼性視網(wǎng)膜病變的自然過程。本研究的目的是在同一只猴活體連續(xù)觀察高眼壓前后視盤和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞復(fù)合體(ganglion cell complex，GCC)的縱向變化，探討高眼壓對(duì)視盤和GCC的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取實(shí)驗(yàn)用恒河猴3只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，野生動(dòng)物保護(hù)站合格證號(hào)：京綠動(dòng)植許[2011]160號(hào)、134號(hào)；全部為雄性，年齡4歲，體質(zhì)量6.3～7.2 kg；飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部同一間猴房。保持在12 h暗和12 h光照(100 Lux)環(huán)境中給予水果、蔬菜等混合喂養(yǎng)。

本研究所有檢查程序都經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)以及動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號(hào)：2011-D-0008)。嚴(yán)格遵照眼科學(xué)和視覺研究學(xué)會(huì)關(guān)于動(dòng)物使用的聲明。

1.2 高眼壓模型的制作肌注100 g·L-1氯胺酮(4 mL·kg-1)和Sumianxin-Ⅱ(0.1 mL·kg-1)對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行麻醉。Sumianxin-Ⅱ的主要成分是甲苯噻嗪、氟哌啶醇和鹽酸二氫埃托啡(吉林長(zhǎng)春中國人民解放軍獸醫(yī)大學(xué))。麻醉成功后將實(shí)驗(yàn)猴放在定制的猴臺(tái)上，蓋上毛毯保溫。全部選擇右眼作為激光眼，滴1 g·L-1匹羅卡品縮瞳。安放猴專用房角鏡(美國Ocular Instruments公司)后置于裂隙燈前。使用Novus Spectra多波長(zhǎng)激光儀(中國科醫(yī)人公司)。設(shè)定激光能量為300～500 mW。暴露時(shí)間：0.5 s，光斑直徑：50 μm。首次激光光凝270°范圍房角中部小梁，80～120個(gè)光凝斑。在首次光凝后2周，如果眼壓在30 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)以下，再次激光光凝其余90°的小梁網(wǎng)或補(bǔ)全激光不完全的部位。根據(jù)文獻(xiàn)和我們以前的研究結(jié)果[5-7]，在第一次光凝后的前3個(gè)月眼壓可能發(fā)生波動(dòng)。通常需要反復(fù)光凝中部小梁網(wǎng)，以達(dá)到眼壓持續(xù)升高的效果。

1.3 眼壓的測(cè)量將實(shí)驗(yàn)猴麻醉成功后安靜平臥5～10 min。使用Tonovet回彈式眼壓計(jì)(芬蘭 iCare公司)測(cè)量眼壓。連續(xù)測(cè)量3次，取3次測(cè)量結(jié)果的平均值為最終眼壓值。

1.4 眼底像和OCT圖像的拍攝麻醉成功后實(shí)驗(yàn)猴雙眼滴0.5 g·L-1的托吡卡胺散大瞳孔。安置平光、硬性角膜接觸鏡。滴人工淚液(美國眼力健公司)保持角膜濕潤(rùn)。使用CR-DGi眼底照相機(jī)(日本佳能公司)拍攝眼底像。采用RTVue-100 OCT設(shè)備(美國Optovue公司)拍攝OCT圖像。RTVue-100采用掃描激光二極管發(fā)射(840±10)nm 波長(zhǎng)的激光束?？v向分辨率是4 mm，束斑尺寸：15 mm，Z軸方向掃描范圍2.0～2.3 mm，X、Y軸方向?yàn)?.0～12.0 mm。選擇青光眼檢查方案獲取OCT圖像。選擇RNFL 3.45模式，將3.45 mm環(huán)放置在視盤中心。RNFL 3.45模式測(cè)量以視盤為中心的3.45 mm 處RNFL的厚度和視盤參數(shù)。選擇GCC模式檢查黃斑區(qū)內(nèi)層視網(wǎng)膜厚度。記錄基線和3次隨訪檢查的結(jié)果進(jìn)行分析。信號(hào)強(qiáng)度指數(shù)小于40的圖像會(huì)被剔除，不納入測(cè)量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過配對(duì)t檢驗(yàn)比較同一時(shí)間點(diǎn)激光眼和對(duì)側(cè)眼之間眼壓的差異。采用重復(fù)測(cè)量的方差分析(ANOVA)分析激光眼和對(duì)側(cè)眼不同時(shí)間點(diǎn)間眼壓的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 光凝治療前后眼壓的縱向變化首次光凝后激光眼即刻眼壓為(3.00±0.58)mmHg，明顯低于光凝前的眼壓(17.33±1.20)mmHg和對(duì)側(cè)眼的眼壓(17.00±1.53)mmHg，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.25，P=0.004；t=9.17，P=0.010)。首次光凝后7 d激光眼的眼壓為 (7.67±1.90)mmHg，仍低于光凝前的眼壓，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.65，P=0.020)。首次光凝后1個(gè)月激光眼的眼壓為(18.89±1.74)mmHg，恢復(fù)到光凝前的基線水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.50，P=0.310)。首次光凝后3個(gè)月激光眼的眼壓逐漸升高并達(dá)到穩(wěn)定，高于光凝前的基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.25，P=0.040)，但眼壓有一定程度的波動(dòng)。首次光凝后近2 a激光眼的眼壓為(41.00±5.00)mmHg，仍維持在高于光凝前的基線水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.17，P=0.030)。光凝前和光凝后激光眼不同時(shí)間眼壓的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.22，P=0.030)；光凝前和光凝后對(duì)側(cè)眼不同時(shí)間眼壓的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.89，P=0.130)。見圖1。

圖1 光凝前及光凝后不同時(shí)間雙眼眼壓的縱向變化

2.2 光凝前后視盤眼底像的縱向變化光凝后4個(gè)月激光眼視盤的顏色開始變淡，光凝后8個(gè)月顏色較光凝前明顯變淡，光凝后12個(gè)月顏色仍然變淡。對(duì)側(cè)眼視盤的顏色在光凝后4～12個(gè)月都呈現(xiàn)粉紅色，與光凝前對(duì)比無明顯變化。見圖2。

圖2 光凝前后視盤顏色的縱向變化

2.3 光凝前后視盤周圍RNFL厚度的縱向變化光凝后4個(gè)月、8個(gè)月和12個(gè)月激光眼視盤周圍的RNFL厚度都較對(duì)側(cè)眼以及光凝前變薄。對(duì)側(cè)眼視盤周圍的RNFL厚度在光凝后4個(gè)月、8個(gè)月和12個(gè)月與光凝前相比均無明顯改變。見圖3。

圖3 光凝前后視盤周圍RNFL厚度的縱向變化

2.4 光凝前后黃斑區(qū)GCC厚度的縱向變化光凝后4個(gè)月、8個(gè)月和12個(gè)月激光眼黃斑區(qū)GCC的厚度與光凝前和對(duì)側(cè)眼相比變薄。光凝后4個(gè)月、8個(gè)月和12個(gè)月對(duì)側(cè)眼黃斑區(qū)GCC的厚度與光凝前相比均無明顯改變。見圖4。

圖4 光凝前后黃斑區(qū)GCC厚度的縱向變化

3 討論

高眼壓是青光眼發(fā)生、發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。為了更好地了解高眼壓的損傷過程，有必要探討青光眼性視神經(jīng)病變及視網(wǎng)膜病變的發(fā)病過程。在本研究中，首次光凝后1周或數(shù)周激光眼眼壓低于光凝前基線水平。我們認(rèn)為首次光凝后色素性小梁網(wǎng)組織吸收激光能量，形成激光孔。短暫的激光孔導(dǎo)致房水外流過多，造成眼壓下降。首次光凝后4周，激光處形成了瘢痕粘連，阻止了房水流出，導(dǎo)致眼壓升高。在光凝后前3個(gè)月，眼壓可能逐漸升高并超過光凝前基線水平，但波動(dòng)較大。光凝后3個(gè)月，眼壓會(huì)穩(wěn)定，且高于光凝前基線水平，并可能在幾年內(nèi)維持在較高水平。眼壓升高的原因可能是中部小梁網(wǎng)組織瘢痕形成并阻斷了房水流出通道導(dǎo)致眼壓逐漸升高。臨床上，選擇性激光小梁成形術(shù)能早期有效地降低眼壓。然而，長(zhǎng)期隨訪的數(shù)據(jù)顯示，接受了選擇性激光小梁成形術(shù)和氬激光小梁成形術(shù)的患者多數(shù)需要進(jìn)一步治療[8-10]。

激光誘發(fā)的高眼壓對(duì)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜的損害與高眼壓的持續(xù)時(shí)間有密切關(guān)系。本研究結(jié)果表明：眼壓升高3個(gè)月后，視盤和GCC會(huì)發(fā)生青光眼性損害。在視盤和GCC發(fā)生青光眼性損害之前，眼睛首先經(jīng)歷了一段短暫的低眼壓，然后是一段眼壓的波動(dòng)，最終達(dá)到持續(xù)的高眼壓。我們認(rèn)為眼壓升高會(huì)減少視盤、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的血流。視網(wǎng)膜通過自身調(diào)節(jié)反應(yīng)使升高的眼壓恢復(fù)正常。所以，視盤和GCC一直處于缺血再灌注損傷的交替狀態(tài)[11-12]。因此，眼壓的波動(dòng)性變化是激光誘導(dǎo)的猴高眼壓模型的特征之一。臨床上，24 h眼壓監(jiān)測(cè)是早期診斷青光眼最有效的檢查方法[13]。猴高眼壓模型的這個(gè)特點(diǎn)幾乎模擬了青光眼患者真實(shí)的病理生理過程。然而，雖然可以在活體縱向觀察視盤和GCC的變化，但仍然難以準(zhǔn)確地檢測(cè)到視盤和GCC的結(jié)構(gòu)損傷。其原因可能是：(1)早期視盤和GCC的變化與眼壓升高的程度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)。由于早期眼壓處于波動(dòng)狀態(tài)，所以高眼壓對(duì)視盤和GCC的損害可能是慢性的、進(jìn)展的和可變的。(2)視盤和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)可能隨著眼壓的波動(dòng)而改變[14-16]。(3)缺乏明確的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)界定高眼壓對(duì)視盤和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性損害。

本研究尚存在下面的局限性。首先，本研究觀察了高眼壓前后猴視盤和GCC的縱向改變，未能在同一時(shí)間段觀察高眼壓前后視盤和GCC的功能變化。視盤和GCC的生理功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。然而，視盤和GCC的結(jié)構(gòu)變化和功能改變往往是不一致的，這主要取決于所用檢測(cè)方法的特異性和敏感性。其次，本研究中我們僅觀察了3只高眼壓猴的結(jié)果，樣本量相對(duì)較小。由于購買和飼養(yǎng)猴子的成本昂貴，根據(jù)眼科學(xué)和視覺研究學(xué)會(huì)使用動(dòng)物的聲明，我們已經(jīng)用最少的動(dòng)物數(shù)量取得了有意義的結(jié)果。

總之，在高眼壓造成青光眼性視神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變之前，視盤和GCC一直處于高眼壓和低眼壓的波動(dòng)狀態(tài)；由此導(dǎo)致的缺血再灌注交替性損傷可能是激光誘導(dǎo)的猴高眼壓模型的病理生理特征之一。