苦豆子賴氨酸脫羧酶基因啟動子在擬南芥中的表達分析

陸姍姍，洪園淑，劉萍*

(1.寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021； 3.青島求實職業(yè)技術學院，山東 青島 266109)

啟動子位于結構基因5′端上游，是調控基因準確表達和有效轉錄所必需的結構，通過對下游基因表達時期與表達量的調節(jié)，決定植物完成特殊生長發(fā)育階段的轉變或應答特殊環(huán)境脅迫，因而具有轉錄起始的特異性[1]。為獲得精確穩(wěn)定的結果，在研究啟動子功能時往往采用轉基因遺傳表達的方法，分析不同條件下轉基因植株中報告基因的表達水平以確定啟動子的表達活性與特性[2]。Gu等[3]克隆獲得玉米(Zeamays)的ZmGLU1啟動子，遺傳轉化至煙草(Nicotianatabacum)中發(fā)現(xiàn)該啟動子可在煙草根部高效表達；裴柳玲等[4]研究發(fā)現(xiàn)水稻(Oryzasativa)脅迫相關的OsPM1啟動子遺傳轉化擬南芥(Arabidopsisthaliana)后，在受高鹽、低溫和干旱誘導下均可影響外源基因的表達；李英華等[5]將大豆(Glycinemax)GmGBP1啟動子片段(含光響應元件TCT-motif位點變異SNP-796G)與雙螢光素酶(luciferase，LUC)報告基因融合構建植物表達載體并轉化煙草，瞬時表達結果顯示，在短日照條件下，SNP-796G會導致TCT-motif光效應元件變異，引起LUC顯著上調表達，推測對縮短大豆生育期有作用。

賴氨酸脫羧酶(lysine decarboxylase, LDC)的主要生物學功能是催化賴氨酸脫羧生成尸胺(cadecine, Cad)，在植物生長發(fā)育和抗逆性等方面發(fā)揮重要作用[6-8]，也是屬于喹諾里西啶類生物堿(quinolizidine alkaloids, QAs)的氧化苦參堿(oxymatrine, OMA)(又稱苦參素)和苦參堿(matrine，MA)生物合成途徑的第一個關鍵酶[9-10]，楊毅等[11-12]克隆了苦豆子(Sophraalopecuroides)賴氨酸脫羧酶基因的蛋白質編碼區(qū)序列SaLDC，發(fā)現(xiàn)該基因的表達和OMA的積累呈正相關關系，并且SaLDC的表達和OMA的積累均受干旱脅迫的影響。本實驗室在已有苦豆子SaLDC編碼區(qū)的基礎上，步移克隆得到該基因上游的啟動子序列，并將長度不同的啟動子5′端缺失片段分別與GUS報告基因融合，農桿菌介導遺傳轉化苦豆子愈傷組織，結果顯示不同長度的SaLDC啟動子片段均可驅動GUS在苦豆子愈傷組織中瞬時表達，但啟動活性隨5′缺失片段長度的增加而逐漸減弱[13]。為進一步驗證SaLDC啟動子的功能，本研究開展生物信息學分析，并將含有該啟動子的重組表達載體遺傳轉化擬南芥，開展時空和組織特異性表達以及光照和干旱誘導研究，不僅為該啟動子順式作用元件的研究提供依據(jù)，還有助于從分子水平探討該基因調控表達的機制，為研究SaLDC在OMA生物合成途徑中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥生態(tài)型為哥倫比亞野生型(Columbia)，由北京市農林科學院農業(yè)生物技術研究中心謝華教授惠贈。

1.2 試劑

根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA 105和pBI 121質粒載體由本實驗室保存；Taq DNA聚合酶(TaKaRa)；T4DNA連接酶和限制性核酸內切酶HindIII、BamHI(NewEngland Biolabs, NEB)；pEASY-T1 simple Cloning Kit和大腸桿菌TOP 10感受態(tài)(TransGen Biotech)；質粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)；Silwet L-77(GE Healthcare Bio-Sciences AB)；4-甲基傘形酮(4-Methylumbelliferone，4-MU)(世紀奧科生物技術有限公司)；DNA膠回收試劑盒、β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GUS)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide，X-Gluc)、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，4-MUG)、TritonX-100以及所有引物合成和測序工作均購自生工生物工程(上海)股份有限公司或由其完成，其他試劑為進口或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1SaLDC啟動子的克隆、序列分析和表達載體構建 在本實驗室已有SaLDC編碼區(qū)基礎上，設計巢式PCR特異引物和簡并引物，以苦豆子基因組DNA為模板，通過兩次步移，去掉重疊片段拼接后，獲得SaLDC啟動子片段。目標片段經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后連接至pEASY-T1 simple載體，經轉化、藍白斑和氨芐青霉素(ampicillin，Amp)抗性平板篩選出陽性克隆并測序，測序后的片段用PLACE數(shù)據(jù)庫(http://www.dna.affrc.go.Jp/htdocs/PLACE/)和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.μgent.be/webtools/plantcare/html/)進行SaLDC啟動子序列順式作用元件預測。

提取含SaLDC啟動子片段的T載體質粒DNA，通過Primer Premier 5.0軟件對SaLDC啟動子序列進行酶切位點分析，在序列的上下游引物5′端分別設計插入HindIII(AAGCTT)和BamHI(GGATCC)酶切位點，雙酶切質粒DNA，回收并驗證目的片段，同時雙酶切pBI 121質粒，用目的片段代替其中35S啟動子，T4DNA連接酶連接后得到SaLDC啟動子片段的重組表達載體，導入大腸桿菌TOP 10，經卡那霉素(kanamycin，Kan)篩選獲得的陽性克隆經雙酶切驗證后，重組質粒遺傳轉化至農桿菌EHA 105。

1.3.2擬南芥種植和農桿菌介導的蘸花法遺傳轉化擬南芥 擬南芥種子經5% NaClO和75%乙醇除菌處理，接種于MS培養(yǎng)基中，并于4 ℃冰箱內春化3～4 d后轉到(22±1) ℃的人工氣候箱內，16 h光照/8 h黑暗條件下生長，待4～6片葉時移栽到營養(yǎng)土中。

將1.3.1構建好含SaLDC啟動子片段表達載體的農桿菌單克隆于含Kan(50 mg·L-1)的LB液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)至A600=0.8～1.5，收集菌體，用侵染緩沖液(1/2 MS+5%蔗糖+0.02% Silwet L-77)懸浮菌體至A600=0.6～0.8，侵染未開花的擬南芥花蕾1～2 min，10 min后重復侵染一次。侵染過的植株側放在紙盒中22 ℃避光24 h后于人工氣候箱內正常管理，直至收取T0代種子。將收集到的T0代擬南芥種子無菌處理后于含Kan(25 mg·L-1)的MS篩選培養(yǎng)基內進行抗性苗篩選，直到獲得陽性克隆擬南芥T2代株系。

1.3.3SaLDC啟動子在轉基因擬南芥中的表達 將轉SaLDC啟動子的擬南芥T2代種子按1.3.2方式播種，對春化后4 d(2片葉)、11 d(4片葉)、16 d(6片葉)的擬南芥幼苗進行GUS染色，觀察并拍照記錄不同生長階段轉基因植株的GUS表達情況；對春化后生長30 d的轉基因擬南芥根、莖、葉、花序和角果分別作GUS染色，觀察、記錄GUS在擬南芥不同器官的表達情況。

1.3.4轉基因擬南芥對不同光照條件的響應 將春化后生長16 d的轉基因擬南芥幼苗置于培養(yǎng)箱內作以下處理：1) 3 d全光照培養(yǎng)；2) 2 d光照+1 d黑暗培養(yǎng)；3) 1 d光照+2 d黑暗培養(yǎng)；4) 3 d全黑暗培養(yǎng)，對上述處理的擬南芥幼苗分別進行GUS染色，仔細觀察染色情況并拍照記錄。

1.3.5轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應 對春化后生長16 d的轉基因擬南芥幼苗用6% PEG模擬干旱脅迫，分別于0、1、2、4、8和24 h時采集擬南芥整株，平均分成2份，一份用于GUS染色，另一份按單株提取總蛋白，采用考馬斯亮藍法[14]測定總蛋白含量，定量法測定GUS酶活性，均3次重復。

GUS酶活性測定方法：以脅迫0 h為空白對照，轉基因擬南芥總蛋白提取液與含GUS反應底物的緩沖液酶促反應30 min后，反應液在熒光分光光度計(日立，F(xiàn)-4600)激發(fā)光365 nm，發(fā)射光455 nm，狹縫10 nm條件下，讀取各脅迫樣品蛋白提取液中GUS與底物4-MUG反應生成4-MU的熒光值，并根據(jù)4-MU標準曲線計算出轉基因擬南芥中GUS酶的活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Office 2007分析數(shù)據(jù)，并用DPS 6.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 SaLDC啟動子序列克隆

圖1 SaLDC啟動子片段瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SaLDC promoter M：DL2000 DNA 條帶 DL2000 DNA Marker；1，2：SaLDC啟動子條帶 SaLDC promoter.

以苦豆子基因組DNA為模板擴增SaLDC啟動子序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得約1300 bp大小的條帶(圖1)?？寺～@得的啟動子片段經連接、轉化、挑取Amp平板上的單菌落搖菌后菌液PCR驗證，陽性克隆送公司測序，測序結果表明SaLDC啟動子片段為1260 bp(圖2)，序列提交NCBI獲登錄號：KY038928。

2.2 SaLDC啟動子序列信息學分析

經PLACE和PlantCARE數(shù)據(jù)庫對所獲得的1260 bpSaLDC啟動子序列預測分析，該啟動子轉錄起始位點為起始密碼子上游45 bp處的堿基A，將其標記為+1(圖2)。SaLDC啟動子序列中不僅包含核心元件TATA-box(-27)和CAAT-box(-82)，還含有大量生物和非生物相關的順式作用元件， 包括干旱脅迫響應元件MYBCORE；病原體響應元件WBOXATNPR1；茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif；組織表達特異性元件Skn1-motif、GCN4- motif以及光響應元件IBOXCORE、ACE、G-box、chs-CMA1a和chs-CMA2a等。此外，在該序列中還存在大量增強子元件GATA-box，11個GATA-box中有7個集中分布于-765 bp以內，1個定位于-811，另3個分布于-1212～-1026；在-1177～-442的正負鏈上共分布有6個抑制子元件WRKY710S(表1)。

圖2 苦豆子SaLDC啟動子序列Fig.2 SaLDC promoter sequence of S. alopecuroides

表1 SaLDC啟動子區(qū)域順式作用元件位置和功能Table 1 Physical location and function of Cis-elements in the SaLDC promoter

注：*表示該順式作用元件在互補鏈上；表中所列位置為3′端的第一個堿基。

Note： *The Cis-acting elements on the complementary strand; this location is the first base at the 3′ end.

2.3 SaLDC啟動子在轉基因擬南芥中的時空和組織特異性表達

2.3.1SaLDC啟動子在轉基因擬南芥中的時空表達特性 不同生長階段的轉基因擬南芥幼苗均可通過GUS染色檢測到其活性，但表達水平存在差異。春化后生長4 d(2片葉)的擬南芥植株地上部染色較深，尤以葉片、葉柄和莖中顏色深，說明葉和莖中GUS表達強度較根高；生長11 d(4片葉)的植株中葉柄和莖的染色相對于葉片要深些，但淺于生長4 d的，顯示生長11 d的葉片中GUS表達強度降低，而葉柄和莖的表達強度卻比生長4 d的高；生長16 d(6片葉)的植株無論是葉片、葉柄還是莖，其GUS表達強度均較生長4和11 d的有所下降(圖3)。可見，SaLDC啟動子驅動GUS在擬南芥中的表達強度具有時空特異性，在擬南芥生長早期有較強的驅動下游功能基因表達的作用，但隨植株的生長這種作用有下降趨勢。

2.3.2SaLDC啟動子在轉基因擬南芥中的組織特異性表達 對春化后生長30 d的轉基因成株擬南芥的根、莖、葉、花序和角果分別作GUS染色發(fā)現(xiàn)，葉片和花萼染色較深，根、莖、花瓣和角果染色淺，說明SaLDC啟動子在轉基因擬南芥不同器官中驅動GUS表達的能力有差異，在葉片和花萼中優(yōu)勢表達，但在莖、花瓣、角果和根中表達較弱(圖4)，有一定的組織表達特異性。

2.4 SaLDC啟動子對不同光照條件的響應

生物信息學分析發(fā)現(xiàn)在SaLDC啟動子上共有7類16個光響應順式作用元件(表1)，為驗證該啟動子對光信號的響應情況，對轉SaLDC啟動子的擬南芥植株(春化后16 d)進行不同光照時間處理。研究表明，在黑暗與光照條件下生長的轉基因擬南芥幼苗中的SaLDC啟動子均能驅動GUS表達，與持續(xù)黑暗生長3 d的轉基因擬南芥葉片中的染色程度相比，持續(xù)光照生長3 d明顯深于2 d光照+1 d黑暗培養(yǎng)以及1 d光照+2 d黑暗培養(yǎng)，而且染色深度是光照3 d>2 d>1 d>0 d(圖5)，表明雖然SaLDC在黑暗條件下能夠驅動GUS，但光誘導可以更有效地促使GUS表達上調。

圖3 含SaLDC啟動子的轉基因擬南芥不同生長階段GUS表達Fig.3 Expression of GUS driven by SaLDC promoter at different growth stages in transgenic A. thaliana A:生長4 d Growing 4 d；B:生長11 d Growing 11 d；C:生長16 d Growing 16 d.

圖4 含SaLDC啟動子的轉基因擬南芥組織特異性表達Fig.4 Tissue specific expression of SaLDC promoter in transgenic A. thaliana A:豆莢Pod；B:葉片Leaf；C:根Root；D:莖Stem；E:花序Floral.

圖5 含SaLDC啟動子的轉基因擬南芥在不同光照條件下的GUS表達Fig.5 Expression of GUS driven by SaLDC promoter under different light conditions in transgenic A. thaliana A：3 d 黑暗培養(yǎng)3 days darkness；B：1 d光照+2 d黑暗培養(yǎng)1 day light+2 days darkness；C：2 d光照+1 d黑暗培養(yǎng)2 days light+1 day darkness；D：3 d光照培養(yǎng)3 days light.

2.5 SaLDC啟動子對干旱脅迫的響應

由于SaLDC啟動子序列中含有2個與干旱相關的響應元件MYBCORE(表1)，選取春化后16 d的轉基因擬南芥幼苗模擬干旱脅迫0～24 h，用GUS染色觀察報告基因表達情況。經干旱脅迫和未經干旱脅迫處理的轉基因擬南芥植株均能被GUS染色，脅迫1～2 h后擬南芥植株的GUS染色明顯較未脅迫前加深，但隨脅迫時間的延長，染色又逐漸變淺(圖6)?？梢?，轉基因擬南芥中SaLDC啟動子對干旱脅迫響應迅速，在脅迫初期能迅速驅動下游GUS表達水平上調，然而，隨脅迫時間的延長SaLDC啟動子對干旱脅迫的響應有所減弱，致使GUS的表達強度逐漸降低，由此說明，SaLDC啟動子是一個干旱誘導型啟動子。

為進一步精確分析轉基因擬南芥在模擬干旱脅迫下SaLDC啟動子驅動GUS的表達差異，對GUS酶活性進行定量測定，結果顯示不同PEG脅迫時間對轉基因擬南芥中GUS酶活性均有影響(圖7)，脅迫1～2 h時，顯著升高(P<0.05)，分別是脅迫前的1.39和1.21倍；隨后GUS酶活性逐漸下降，脅迫4 h時較脅迫前有所下降，但無顯著性差異；脅迫8 h時GUS酶活性降至最低(P<0.01)，較脅迫前下降了28.2%；當脅迫至24 h時基本恢復至未脅迫水平，與GUS染色的表觀結果完全一致。

圖6 PEG脅迫對SaLDC啟動子驅動GUS表達強度的影響Fig.6 GUS expression driven by SaLDC promoter in transgenic A. thaliana under PEG stressPEG脅迫時間PEG stress time：A, 0 h；B, 1 h；C, 2 h；D, 4 h；E, 8 h；F, 24 h.

3 討論

圖7 PEG脅迫后轉基因擬南芥中GUS酶活性差異比較Fig.7 GUS enzyme activity expression difference in transgenic A. thaliana under PEG stress 不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示0.01水平差異顯著。Different lowercase letters indicates significant differences at 0.05 level, and uppercase letters indicate significant differences at 0.01 level.

基因表達受其上游啟動子調控，有研究報道啟動子主要分為組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異型啟動子3類[15]，組織特異性啟動子所調控的下游基因往往只在特定條件和組織器官中特異表達，從而避免持續(xù)穩(wěn)定、高效表達所造成的浪費，降低了植物的代謝負擔[16]。劉華等[17]分析了2個花生(Arachishypogaea)品種開花后20、40 和60 d種子以及根、莖、葉和花7個不同組織中油酸脫氫酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的表達，發(fā)現(xiàn)這2個基因在各組織中都有表達，但在花后40 d的種子中表達量最高，表現(xiàn)出明顯的時空特異性；張吉順等[18]利用實時熒光定量PCR對煙草賴氨酸脫羧酶基因NtLDC1進行組織特異性表達分析，發(fā)現(xiàn)該基因在煙草葉片組織中的表達水平最高，在莖中表達水平最低；Naoumkina等[19]將克隆到的瓜爾豆(Cyamopsistetragonoloba)甘露聚糖合酶基因的啟動子與報告基因融合并轉入紫花苜蓿(Medicagosativa)，研究顯示該啟動子只在紫花苜蓿的胚乳組織中特異表達。本研究發(fā)現(xiàn)SaLDC啟動子雖然在轉基因擬南芥幼苗和成株的各組織中均能驅動GUS報告基因表達，但表達強度有區(qū)別，在幼苗中隨生長時間的延長，葉片中表達活性下降；在成株的葉片和花萼中表達活性高于根、莖、花瓣和角果，由此可見，SaLDC啟動子既有時空表達特異性，又有組織表達特異性。

植物通過感知多種環(huán)境因子(光、溫度、水分等)的轉導信號，誘導基因表達以調節(jié)自身正常的生長發(fā)育[20]。由誘導型啟動子驅動的抗逆基因的表達研究已在多種植物中開展[21-24]，程寅勝等[25]用NaCl、干旱、赤霉素(gibberellin A3，GA3)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)以及光照處理含碭山酥梨(Pyrusbretschneideri‘Dangshan Suli’)糖轉運相關基因PbTMT4啟動子的轉基因擬南芥，結果顯示這些非生物脅迫因子一定程度上均可提高擬南芥中GUS的轉錄水平；李小冬等[26]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿MsMBF1C啟動子上具有與植物耐熱調節(jié)相關的結合位點，42 ℃高溫熱誘導后轉基因擬南芥中GUS與At-MBF1C的表達都得到顯著提高。研究表明LDC的表達也受多種環(huán)境因子的影響，NaCl可促使冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)的LDC表達上調[27]；低溫能夠使耐冷性強的黃瓜(Cucumissativus)品種在發(fā)芽期誘導賴氨酸脫羧酶基因表達，但該基因在耐冷性弱的品種中不能被誘導[28]，苗永美等[29]對攜帶有CsLDC的耐冷黃瓜品種進行低溫和鹽脅迫，證明CsLDC是低溫和鹽快速響應基因；楊毅等[12]通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)苦豆子植株SaLDC的表達對干旱脅迫有響應。本研究將SaLDC啟動子融合GUS遺傳轉化擬南芥，經干旱脅迫后，轉基因擬南芥幼苗的GUS酶活性從脅迫1～8 h發(fā)生顯著變化，由此預示SaLDC啟動子能利用擬南芥植物體內自身存在的調節(jié)機制調控基因表達，在經受干旱脅迫時，啟動了相應的應答機制，在轉錄水平上參與SaLDC調控表達，從而抵御外界環(huán)境脅迫，使基因表達與植物生長狀態(tài)協(xié)調統(tǒng)一。

在植物生長發(fā)育過程中，光不僅直接參與光合作用，還是調控相關基因表達的一個重要的信號[30]，光誘導型啟動子通過其光調控元件的特殊組合方式調控基因的表達[31]，Wang等[32]克隆并分析了白楊(Populus)Pt-RbcS啟動子，發(fā)現(xiàn)其包含有TCT-motif、ATCT-motif和GAG-motif等光響應元件，該啟動子驅動GUS優(yōu)先在具有光合組織的葉和莖中表達，本研究在苦豆子SaLDC啟動子中發(fā)現(xiàn)7類共16個光響應元件，包括IBOXCORE、ACE、G-box、GAG-motif、TCT-motif等，研究發(fā)現(xiàn)，雖然黑暗與光照條件下SaLDC啟動子均能驅動轉基因擬南芥中GUS表達，但表達的程度是光照3 d>2 d>1 d>0 d，說明光誘導可以促使該啟動子中的光響應元件發(fā)揮作用，提高GUS在mRNA上的轉錄水平，這與實踐中光照促進植物生長發(fā)育相一致。

4 結論

SaLDC啟動子序列中除了基本順式作用元件外，還有多個響應外界刺激的生物和非生物作用元件。雖然SaLDC啟動子在擬南芥幼苗的不同生長階段和成株的各組織器官中均能驅動GUS表達，但有時空特異性和組織特異性。生物信息分析、組織化學染色和定量分析等多個角度說明SaLDC啟動子受光照和PEG脅迫誘導，可作為光照和干旱脅迫誘導型啟動子用于后續(xù)研究。