牛至精油對綿羊瘤胃體外養(yǎng)分降解率、發(fā)酵特性及CH4產(chǎn)量的影響

周瑞，劉立山，吳建平,4，韋勝，郎俠*，王彩蓮*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省牛羊種質(zhì)與秸稈飼料化重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；4.西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅 蘭州 730070)

反芻動物每年CH4排放量占全球人類活動CH4排放總量的26%[1]。CH4的排放不僅嚴(yán)重污染了大氣環(huán)境，同時降低了家畜對飼料中能量的利用效率[2]。近年來，人們研究了多種通過調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵來減少反芻動物甲烷排放的方法，其中天然綠色飼料添加劑是研究的熱點之一。大量研究表明，植物精油(essential oil, EO)及其生物活性化合物能夠通過調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵來提高飼料能量利用率、降低CH4排放[3]，同時，還可以影響瘤胃的生物氫化作用，調(diào)控脂肪酸的合成代謝，提高牛奶和肉類的營養(yǎng)品質(zhì)[4]。牛至精油(oregano EO)是從牛至(Origanumvulgare)中提取的具有抗菌、抗氧化活性的揮發(fā)油，其活性成分主要是香芹酚、百里酚、松油烯和芳樟醇等物質(zhì)[5]。Busquet等[6]在體外瘤胃發(fā)酵試驗中發(fā)現(xiàn)，添加香芹酚(2.2 mg·L-1)可以降低發(fā)酵液中氨氮濃度。另外，綿羊飼糧中添加牛至精油減少甲烷排放量12%[7]。牛至精油還可以維持瘤胃pH穩(wěn)定，提高干物質(zhì)消化率，促進(jìn)犢牛的生長發(fā)育[8-9]。牛至精油中的活性成分香芹酚和百里酚能加速胃腸道上皮細(xì)胞的更新率，減少病原體對腸道上皮細(xì)胞的感染，抑制有害菌的生長[10]。Patra等[11]研究發(fā)現(xiàn)，添加不同濃度的牛至精油(250、500和1000 mg·L-1)，隨著添加量的增加總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、干物質(zhì)消化率、中性洗滌纖維消化率均顯著降低，并影響揮發(fā)性脂肪酸的濃度。目前牛至精油在生產(chǎn)實踐中的研究較少，并且對牛至精油濃度范圍的研究較小，不同的研究對生產(chǎn)實踐所提供的最適濃度不同，因此本研究在前人的研究基礎(chǔ)上，增加了牛至精油的添加梯度，細(xì)化了添加水平的范圍，以100、400、700和1000 mg·L-1不同添加水平更進(jìn)一步研究其對瘤胃體外養(yǎng)分降解率及發(fā)酵特性的影響，篩選牛至精油最佳添加量，為其在反芻動物生產(chǎn)中的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供體動物及飼養(yǎng)管理

試驗選取3只體況和體重[(56.68±2.14) kg]相近裝有永久瘤胃瘺管的健康公羊(德國美利奴×小尾寒羊的雜交1代)作為瘤胃液供體羊。試驗羊單欄飼養(yǎng)，飼糧參照國家研究委員會(National Research Council, NRC)(2007)[12]推薦營養(yǎng)需要配制，精粗比為34.5∶65.5，其組成及營養(yǎng)水平見表1。每天分別于8:00和18:00等量飼喂兩次，先粗后精，自由飲水。采集瘤胃液進(jìn)行體外產(chǎn)氣試驗前供體羊預(yù)飼7 d。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平Table1 Composition and nutrient of experimental diet (dry matter basis)

1)每kg預(yù)混料含有One kg of premix contained the following: VA220000 IU, VD372000 IU, VE2000 IU, D-生物素D-biotin 40 mg，煙酰胺Nicotinic acid amide 2000 mg, Mn (as manganese sulfate) 710 mg, Zn (as zinc sulfate) 2005 mg, Fe (as ferrous sulfate) 830 mg, Cu (as copper sulfate) 680 mg, Co (as cobalt sulfate) 12 mg。2)消化能為計算值，其他為實測值。Digestive energy were calculated values and others were measured values.

1.2 試驗設(shè)計

牛至精油購自美國Ralco動物營養(yǎng)公司，牛至精油的主要活性成分為：香芹酚(carvacrol，含量為80%～85%)，百里香酚(thymol，含量為 2.5%～3.0%)，對傘花烴(p-cymene，含量為3.5%～9.0%)，γ-萜品烯 (γ-terpinene，含量為2.0%～5.5%)。試驗采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計，分為5個處理組，每個處理組4個重復(fù)，發(fā)酵瓶(250 mL)中分別添加5個不同水平的牛至精油：不添加牛至精油組(CON)，添加100(EO1)、400(EO2)、700(EO3)和1000 mg·L-1(EO4)牛至精油組。另設(shè)置一個空白對照(4個重復(fù))，即不添加發(fā)酵底物和牛至精油，用于發(fā)酵瓶產(chǎn)氣量的校正。

1.3 體外發(fā)酵及樣品采集

于晨飼后2 h通過瘤胃瘺管采集瘤胃內(nèi)容物，用4層紗布過濾，將過濾后的瘤胃液裝于提前充滿CO2的保溫瓶迅速帶回實驗室，整個操作于39 ℃水浴中進(jìn)行。體外產(chǎn)氣裝置采用ANKOM RFS(美國ANKOM technology corporation)全自動記錄裝置氣體測量系統(tǒng)。發(fā)酵所用底物與供體動物所喂飼糧一致。將烘干后的飼糧通過高速粉碎機(jī)(XFB-200)粉碎約1 mm顆粒，再準(zhǔn)確稱取約1200 mg飼糧樣品投入250 mL發(fā)酵瓶中，每個發(fā)酵瓶中分別加入相應(yīng)質(zhì)量的牛至精油。接種時迅速將每個瓶中加入100 mL預(yù)熱的人工瘤胃緩沖液和50 mL過濾后的瘤胃液，人工瘤胃緩沖液按Menke等[13]方法配制，并向瓶中持續(xù)通入CO230 s后，立即加上瓶塞，并將每個發(fā)酵瓶與產(chǎn)氣裝置的每個傳感器相連接，于39 ℃下連續(xù)培養(yǎng)48 h，自動記錄產(chǎn)氣壓力。分別在不同發(fā)酵時間點(1、3、6、9、12、18、24、36和48 h)利用密封氣體進(jìn)樣針采集5 mL發(fā)酵瓶頂部氣體，用于CH4產(chǎn)量的測定。發(fā)酵結(jié)束后，將所有發(fā)酵瓶在冰水中終止發(fā)酵，收集15 mL發(fā)酵液測定發(fā)酵參數(shù)，將剩余發(fā)酵液離心收集發(fā)酵殘渣測定養(yǎng)分含量。

1.4 測定指標(biāo)及測定方法

1.4.1飼糧養(yǎng)分測定 參照《飼料分析及飼養(yǎng)質(zhì)量檢測技術(shù)》[14]測定飼糧和發(fā)酵殘渣干物質(zhì)(dry matter,DM)、粗蛋白(crude protein,CP)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)和中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)含量。干物質(zhì)降解率(dry matter degradability，DMD)、粗蛋白降解率(crude protein degradability，CPD)、酸性洗滌纖維降解率(acid detergent fiber degradability，ADFD)、中性洗滌纖維降解率(neutral detergent fiber degradability，NDFD)，根據(jù)Tilley等[15]的方法計算。

1.4.2發(fā)酵參數(shù)及CH4產(chǎn)量測定 用pH 211型精密pH計(HAN-NA)測定發(fā)酵液pH值；使用苯酚-次氯酸鈉比色法測定NH3-N濃度[16]；采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)配合WD-2102B型全自動酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司)測定微生物蛋白(microbial protein，MCP)含量，測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行；采用氣相色譜儀(日本島津GC-2010 Plus)測定揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)和CH4含量[17]。ANKOM RFS氣體測量系統(tǒng)自動記錄產(chǎn)氣瓶發(fā)酵產(chǎn)生的壓力，氣壓可以轉(zhuǎn)化成氣體體積，根據(jù)理想氣體方程，累計產(chǎn)氣量可以按以下公式進(jìn)行計算：

Vx=VjPpsi×0.068004084

式中：Vx為產(chǎn)氣總體積(mL)；Vj為發(fā)酵瓶頂部空間體積(mL)；Ppsi為氣體測量系統(tǒng)自動記錄的壓力(kPa)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 19.0軟件的 One-way ANOVA和GLM進(jìn)行方差分析。以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外情況下牛至精油對飼料養(yǎng)分降解率的影響

與CON組相比，EO1組DMD顯著升高1.81%(P<0.001)，而EO3、EO4組分別顯著下降1.65%、2.14%(P<0.001)；EO1組CPD、NDFD分別顯著升高2.05%(P=0.032)、1.65%(P=0.009)，而EO4組分別顯著降低1.91%(P=0.032)、1.16%(P=0.009)。牛至精油對ADFD無顯著影響(P=0.106)(表2)。

表2 牛至精油對體外養(yǎng)分體外降解率的影響Table 2 Effects of oregano EO on nutrient degradability of diet in vitro

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，SEM為平均標(biāo)準(zhǔn)誤。下同。

Note: In the same row, values with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with the same letters mean no significant difference (P>0.05). SEM indicates: Mean standard error. The same below.

2.2 牛至精油對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

EO1組pH顯著低于其他4組(P<0.05)，TVFA、丙酸濃度顯著高于其他4組(P<0.05)，丙酸/總揮發(fā)性脂肪酸顯著高于CON 、EO2和EO4組(P<0.05)；EO1組乙酸濃度顯著高于EO2、EO3和EO4(P<0.05)，但乙酸/總揮發(fā)性脂肪酸顯著低于EO3、EO4組(P<0.05)；與CON相比，添加牛至精油組均顯著降低了培養(yǎng)液丁酸、丁酸/總揮發(fā)性脂肪酸和NH3-N濃度(P<0.05)，但對MCP濃度無顯著影響(P=0.563)(表3)。

2.3 牛至精油對體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響

結(jié)果顯示，時間對總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量以及CH4/總產(chǎn)氣均有顯著效應(yīng)(P<0.001)，牛至精油添加水平和時間的互作用對CH4產(chǎn)量有顯著效應(yīng)(P<0.05)，但對總產(chǎn)氣量和CH4/總產(chǎn)氣無顯著效應(yīng)(P>0.05)(表4)。從牛至精油不同添加水平來看，總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣整體呈現(xiàn)降低趨勢； EO1組在發(fā)酵1、3、9、12 h時總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣均無顯著變化(P>0.05)，發(fā)酵6、18～48 h時總產(chǎn)氣量顯著降低(P<0.05)，CH4產(chǎn)量無顯著變化，CH4/總產(chǎn)氣顯著升高(P<0.05)；EO2、EO3組在發(fā)酵1 h時，CH4產(chǎn)量、總產(chǎn)氣量、CH4/總產(chǎn)氣均無顯著變化(P>0.05)，發(fā)酵3、6、24、48 h時，總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)，CH4/總產(chǎn)氣無顯著變化(P>0.05)，發(fā)酵18、36 h時總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣均顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵12 h時，總產(chǎn)氣量無顯著變化(P>0.05)，CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣顯著降低(P<0.05)；EO4組在發(fā)酵1 h時總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣均無顯著變化(P>0.05)，發(fā)酵6、12、18、36 h時總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量、CH4/總產(chǎn)氣均顯著降低(P<0.05)，發(fā)酵3、9、24、48 h時總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量顯著降低(P<0.05)，CH4/總產(chǎn)氣無顯著變化(P>0.05)。

表3 牛至精油對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of oregano EO on parameters in vitro fermentation

3 討論

3.1 牛至精油對飼糧養(yǎng)分體外瘤胃降解率的影響

體外養(yǎng)分降解率不僅能夠反映飼料在發(fā)酵體系中被微生物的降解程度，還能反映其被動物消化利用的難易程度[18]。關(guān)于不同植物精油對體內(nèi)和體外養(yǎng)分降解率的影響報道不盡相同。體外研究表明，添加5、50 mg·L-1植物精油活性成分(丁子香酚，檸檬烯和百里香酚)對干物質(zhì)降解率無顯著影響[19]，另外，添加250、500和1000 mg·L-1丁香油、桉樹油和大蒜油對體外養(yǎng)分消化率無顯著影響[11]。而金恩望等[20]研究發(fā)現(xiàn)，添加量高于1.0 g·L-1的植物精油(茶樹油、肉桂油、丁香油)能抑制飼料底物的降解，而當(dāng)添加量低于1.0 g·L-1時，對體外干物質(zhì)降解率無顯著影響。本試驗結(jié)果與其不同，原因可能是不同的植物精油對養(yǎng)分降解率影響的劑量不同。然而也有研究表明牛至油對飼糧養(yǎng)分降解率無顯著影響[21]。以上結(jié)果表明，由于不同植物精油及其有效化學(xué)成分復(fù)雜多樣，導(dǎo)致其功能特性各異，對體外養(yǎng)分消化率的影響也各不相同。本研究發(fā)現(xiàn)，添加100 mg·L-1牛至精油時，養(yǎng)分降解率最高，當(dāng)牛至精油添加量大于100 mg·L-1時，養(yǎng)分降解率逐漸下降，其原因可能是牛至精油添加量為100 mg·L-1時，可以選擇性地促進(jìn)瘤胃原蟲、細(xì)菌和真菌的活性，改善瘤胃機(jī)能[22]，從而提高飼糧養(yǎng)分降解率，添加量高于100 mg·L-1時，可能對瘤胃微生物活性及瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，降低飼糧養(yǎng)分降解率。

3.2 牛至精油對體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

揮發(fā)性脂肪酸是飼糧中碳水化合物在瘤胃中降解的主要產(chǎn)物，是反芻動物主要的能量來源以及合成乳脂和體脂的重要原料[23]。瘤胃pH是衡量反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要指標(biāo)，主要受飼料性質(zhì)、唾液分泌量和有機(jī)酸積累的影響[24]。徐方華[25]利用瘤胃體外批次培養(yǎng)方法研究發(fā)現(xiàn)，牛至油可以提高培養(yǎng)液pH，且與牛至油的添加水平成正比。 另外， 張然等[21]研究表明， 體外培養(yǎng)液中添加牛至油可以顯著提高培養(yǎng)液pH，而添加高水平的牛至油(300、400 mg·L-1)顯著降低了培養(yǎng)液TVFA濃度和丙酸比例，同時培養(yǎng)液乙酸占TVFA比例和乙酸/丙酸顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的牛至精油(100 mg·L-1)顯著升高了TVFA、丙酸濃度，同時pH顯著降低，而高濃度(大于100 mg·L-1)的牛至精油使pH顯著升高，這可能是高濃度的牛至精油抑制了瘤胃發(fā)酵，使得TVFA和乙酸、丙酸、丁酸濃度顯著降低，本研究中養(yǎng)分降解率變化與此相一致。另外本研究中乙酸占TVFA的比例在高濃度(大于100 mg·L-1)條件下顯著升高，而丙酸、丁酸占TVFA的比例顯著降低，這些結(jié)果表明高濃度的牛至精油會使瘤胃更加趨向于乙酸發(fā)酵。林波[26]研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)液中添加高濃度牛至油(500、750 mg·L-1)，能夠破壞瘤胃壁細(xì)胞膜的完整性，影響瘤胃的健康發(fā)育，從而抑制瘤胃發(fā)酵。Patra等[27]試驗表明，體外培養(yǎng)液中添加牛至油會減少瘤胃原蟲、細(xì)菌和主要纖維素分解菌(產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌)的數(shù)量，且與牛至油的添加水平呈線性關(guān)系。結(jié)合本試驗結(jié)果，可以推斷高濃度(大于100 mg·L-1)牛至精油可能通過影響微生物活性，降低TVFA濃度，抑制瘤胃發(fā)酵。

表4 牛至精油對體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of oregano EO on total gas production and CH4 production in vitro fermentation

注：Tre表示不同梯度牛至精油，T表示發(fā)酵時間。

Note: Tre indicates different concentrations of oregano essential oil, T indicates fermentation times.

NH3-N濃度是飼糧含氮物質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解及微生物對氨利用的綜合反映[28]。NH3-N濃度作為評價瘤胃中氮存留率的重要指標(biāo)，其降低意味著瘤胃中蛋白降解率的降低或者瘤胃微生物對NH3-N利用率的提高。大量體外試驗表明，植物精油能夠抑制瘤胃NH3的產(chǎn)生，提高氮的利用率。Wang等[7]研究表明，給綿羊連續(xù)飼喂15 d添加250 mg·d-1牛至油預(yù)混劑的飼糧后，綿羊瘤胃液氨氮濃度顯著降低。Noorian等[29]研究發(fā)現(xiàn)，植物精油可以降低NH3-N濃度，并且可以減少原蟲的數(shù)量。本試驗結(jié)果表明，添加牛至精油NH3-N濃度顯著降低，而牛至精油對MCP濃度無顯著影響，可能是牛至精油能夠抑制瘤胃產(chǎn)氨菌的生長，降低脫氨酶活性，使得氨基酸脫氨基作用降低[30]，同時生成的TVFA和NH3-N降低，也可能會抑制瘤胃液原蟲數(shù)量，降低NH3-N濃度[31]。另外，由于發(fā)酵處于密閉的發(fā)酵瓶內(nèi)，發(fā)酵48 h后發(fā)酵底物不斷被消耗，微生物總數(shù)以及活性基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，因此MCP濃度無顯著差異。

3.3 牛至精油對體外瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量的影響

總產(chǎn)氣量是反映飼料可發(fā)酵程度及瘤胃微生物活性的重要指標(biāo)[31]。目前，植物精油對反芻動物總產(chǎn)氣量的相關(guān)報道較少。反芻動物瘤胃內(nèi)合成CH4的主要途徑是氫氣還原二氧化碳形成甲烷，其次是乙酸、甲酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸合成CH4[32]。張然等[21]研究表明，牛至油能調(diào)控瘤胃發(fā)酵和降低甲烷產(chǎn)量，但添加高水平(300、400 mg·L-1)的牛至油對綿羊瘤胃發(fā)酵具有抑制作用。Chaudhary等[33]研究表明，添加450 mg·L-1的百里香油和牛至油能顯著降低體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量，而50、150 mg·L-1的添加水平對CH4產(chǎn)量沒有顯著影響。Oskoueian等[34]認(rèn)為，植物精油在降低CH4產(chǎn)量的同時伴隨著對瘤胃微生物發(fā)酵的抑制，這種改變與植物精油的種類和劑量以及所采用的底物有關(guān)。Patra等[11]對5種植物精油(丁香油、桉樹油、大蒜油、起酥油、和薄荷油)在體外發(fā)酵試驗中發(fā)現(xiàn)，1 g·L-1大蒜油對CH4產(chǎn)生抑制最顯著，表明植物精油對CH4產(chǎn)量降低的效果與植物精油的種類和劑量有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時間對總產(chǎn)氣、CH4產(chǎn)量以及CH4比例均具有顯著效應(yīng)，而發(fā)酵時間和處理的互作效應(yīng)主要表現(xiàn)在對CH4產(chǎn)量的影響上，對總產(chǎn)氣和CH4占總產(chǎn)氣比例互作效應(yīng)不顯著。在發(fā)酵1～12 h，添加100 mg·L-1的牛至精油對總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量無顯著影響，發(fā)酵18～48 h，由于碳水化合物的減少，可能會導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生的CO2等其他氣體相應(yīng)降低，使得總產(chǎn)氣量降低，而CH4可能會通過累積的VFA以及甲醇等途徑合成[35]，因此CH4產(chǎn)量無顯著變化，當(dāng)添加量高于100 mg·L-1時，從整體看，牛至精油對總產(chǎn)氣量、CH4產(chǎn)量均有抑制作用，尤其對發(fā)酵18、36 h時CH4產(chǎn)量的抑制作用大于對總產(chǎn)氣量的抑制作用，這可能與瘤胃發(fā)酵氣體的產(chǎn)生機(jī)制有關(guān)，高劑量的牛至精油一方面抑制了產(chǎn)CH4菌的生長[36]并改變了古細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，從而減少了CH4產(chǎn)量[37]，另一方面，可能抑制微生物對碳水化合物的利用，抑制瘤胃發(fā)酵，本研究TVFA降低的結(jié)果與此一致，總產(chǎn)氣量下降的同時CH4產(chǎn)量也相應(yīng)降低，最終使得CH4產(chǎn)量在總產(chǎn)氣量中的比例顯著下降。

4 結(jié)論

1)添加100 mg·L-1牛至精油可提高DMD、CPD、NDFD，添加量大于100 mg·L-1時養(yǎng)分降解率逐漸降低。

2)牛至精油可降低培養(yǎng)液丁酸和NH3-N濃度，添加100 mg·L-1牛至精油可提高培養(yǎng)液TVFA、乙酸和丙酸濃度，而添加量大于100 mg·L-1牛至精油降低培養(yǎng)液TVFA、乙酸和丙酸濃度，對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。

3) 添加100 mg·L-1牛至精油可降低發(fā)酵18 h后總產(chǎn)氣量，但對CH4產(chǎn)量無顯著影響，添加量高于100 mg·L-1時，可以降低總產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量。

綜合認(rèn)為，在綿羊瘤胃體外發(fā)酵條件下，牛至精油添加量不應(yīng)高于100 mg·L-1。