林棟,張德罡,McCulley Rebecca L.
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.美國肯塔基大學(xué)植物與土壤科學(xué)系,肯塔基州 列克星敦 40546-0091)
作物長期連作會(huì)導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降,營養(yǎng)元素失衡,自毒物質(zhì)和病原微生物積累[1],尤其在蔬菜類作物連作中更為常見[2]。而蔬菜與牧草輪作能夠有效緩解連作障礙,改善土壤理化性狀和微生態(tài)環(huán)境,提高農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力[3]。采用輪作種植模式是全球溫帶地區(qū)可持續(xù)農(nóng)業(yè)重要的土地利用策略之一[4-5],該輪作方式在全球范圍內(nèi)被證實(shí)有諸多好處[6],如增加土壤有機(jī)質(zhì)和生物量,形成潛在的土壤碳匯,減緩氣候變化,對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義,是集生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益于一體的草地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式,具有廣泛的推廣應(yīng)用前景[7]。Conant等[8]對(duì)全球115項(xiàng)有關(guān)耕地或原生植被轉(zhuǎn)變?yōu)椴莸兀约疤岣卟莸毓芾泶胧┑难芯拷Y(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果表明耕地轉(zhuǎn)變?yōu)椴莸仫@著增加了土壤碳沉積。Franzluebbers[9]在美國東南部對(duì)作物-家畜系統(tǒng)的研究表明,被侵蝕的農(nóng)田種植多年生牧草后土壤有機(jī)質(zhì)、土壤營養(yǎng)循環(huán)、生物和物理狀況顯著提升。中國春秋戰(zhàn)國時(shí)期伴隨著土地連作制度的出現(xiàn),輪作就在古代農(nóng)耕制度中逐漸形成,雛形是作物和綠肥輪作[10],目前已廣泛應(yīng)用于各地區(qū)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護(hù)。李靜等[11]對(duì)黃土區(qū)不同退耕年限草地土壤理化性質(zhì)的研究結(jié)果表明,隨著退耕年限的增加,草地土壤分離速率逐漸降低,不同退耕年限草地土壤容重、水穩(wěn)性團(tuán)聚體含量、根系生物量密度均有不同程度的改變。
土壤微生物直接參與土壤有機(jī)質(zhì)積累和礦化等過程,影響土壤養(yǎng)分循環(huán)及其有效性,調(diào)節(jié)和指示土壤功能[12],是反映生態(tài)系統(tǒng)受到一定干擾后土壤質(zhì)量變化的指標(biāo)之一[13-15]。土壤微生物生物量比土壤有機(jī)質(zhì)變化更敏感,其群落結(jié)構(gòu)能很好地區(qū)分不同草地生長年限土壤有機(jī)質(zhì)存在的差異。土壤微生物對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)非常迅速,由于能夠較早地預(yù)測(cè)土壤養(yǎng)分及環(huán)境質(zhì)量的變化過程,被認(rèn)為是最具潛力的敏感性指標(biāo)之一[16]。傳統(tǒng)耕作措施下的蔬菜生產(chǎn),被證實(shí)會(huì)減少土壤微生物生物量[17-18]和真菌種群數(shù)量[19-20]。而放牧草地土壤相比蔬菜農(nóng)田,能夠維持更高的微生物生物量和新陳代謝潛力[14]。同時(shí),研究表明草地土壤由于較高的微生物群落豐富度和多樣性,而更能抵抗環(huán)境脅迫[21]。生態(tài)系統(tǒng)忍耐外界干擾的能力,部分依賴于土壤微生物組成[22]。定量分析土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu),在探究土壤營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和積累過程中至關(guān)重要,然而在蔬菜-牧草輪作系統(tǒng)中,草地生長年際和季節(jié)間的變化規(guī)律尚缺乏系統(tǒng)和精確的分析結(jié)論。研究蔬菜-牧草輪作過程中牧草生長時(shí)間序列上土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能動(dòng)態(tài)特征,有助于深入理解該輪作措施影響土壤狀況和功能發(fā)揮的生物學(xué)機(jī)制。
研究區(qū)位于美國肯塔基州喬治敦縣的埃爾姆伍德有機(jī)畜牧場(chǎng)(N 38°13′26″-38°14′00″、W 84°30′08″-84°30′53″),海拔165~323 m,處于亞熱帶濕潤氣候區(qū)的北緣[23],年均降水量1209 mm,年均氣溫12 ℃,無霜期163~192 d。該有機(jī)牧場(chǎng)不使用化肥和除草劑等農(nóng)藥,一直沿用3年低投入蔬菜生產(chǎn)和5年多年生牧草輪作的生產(chǎn)方式。研究地坡度約2%~6%,土壤類型為淋溶土(國際土壤分類系統(tǒng)),采樣點(diǎn)土壤類型、坡度、朝向、植被總蓋度等基本立地條件保持一致[24]。
運(yùn)用空間代替時(shí)間的方法,選取蔬菜-牧草輪作系統(tǒng)中處于不同建植年限的多年生草地作為研究對(duì)象,以永久性草地為對(duì)照,分析連續(xù)5年牧草輪作過程中不同生長年限和不同季節(jié)之間草地土壤微生物群落動(dòng)態(tài)特征。研究區(qū)輪作草地前茬蔬菜作物種類一致,主要為:甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、甜菜(Betavulgaris)和胡蘿卜(Daucuscarota)等。多年生草地主要物種為:苜蓿(Medicagosativa)、草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festucaarundinacea)、鴨茅(Dactylisglomerata)、白三葉(Trifoliumrepens)、紅三葉(Trifoliumpratense)和梯牧草(Phleumpratense)。輪作草地生長年限從第1~5年的處理,分別標(biāo)記為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5,近50年未曾耕種過的永久性草地(permanent pasture)標(biāo)記為P。從每個(gè)相同生長年限的草地中隨機(jī)選取立地條件基本一致的3個(gè)小區(qū)(5 m×5 m)作為重復(fù),每個(gè)小區(qū)內(nèi)以“S”形布置6個(gè)采樣點(diǎn),于2015年4個(gè)季節(jié)(春、夏、秋、冬)分別采集0~15 cm土層土壤,6土鉆混合為一袋樣品,塑料自封袋封裝后用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,過5.66 mm篩,剔除可見植物根莖組織后進(jìn)行檢測(cè)。
運(yùn)用改進(jìn)后的Buyer等[25]的方法進(jìn)行高通量磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)分析,檢測(cè)研究區(qū)草地土壤微生物群落。將新鮮土樣冷凍干燥后取1.0~1.5 g在玻璃試管中溶于4 mL的Bligh-Dyer提取劑(氯仿∶甲醇∶0.05 mol·L-1磷酸鉀緩沖液,體積比1.0∶2.0∶0.8,pH 7.4),含內(nèi)標(biāo)(19∶0, 1, 2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)0.5 μL·mL-1,測(cè)試組前中后分別加入3個(gè)空白對(duì)照。通過超聲波降解,加入氯仿和去離子水渦旋振蕩,并離心濃縮進(jìn)行分離。用1 mL甲醇淋洗50 mg硅膠固相萃取(solid phase extraction,SPE)96孔板(Phenomenex,Torrance,美國)3次,再用1 mL氯仿淋洗3次。加入分離出的樣品后,用1 mL氯仿和1 mL丙酮間隔5 min淋洗,再用0.5 mL甲醇∶氯仿∶水為5∶5∶1的溶劑洗提磷脂。脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters,F(xiàn)AMEs)提取用0.2 mL酯交換反應(yīng)試劑(0.285 g KOH溶于25 mL甲醇后加8.3 mL甲苯),在39 ℃下培養(yǎng)15 min進(jìn)行甲基化。加入0.4 mL 0.075 mol·L-1醋酸、0.4 mL氯仿,反復(fù)振蕩分離后在真空離心濃縮系統(tǒng)中干燥30 min提取FAMEs,再用75 μL正己烷溶解。用搭載有自動(dòng)進(jìn)樣器、Ultra 2毛細(xì)管柱、火焰離子化檢測(cè)器和MIDI Sherlock系統(tǒng)(Microbial Identification System Inc.,版本6.2, Newark, DE)的安捷倫7890A氣相色譜儀(Agilent Technologies,Wilmington,美國)測(cè)定脂肪酸種類和含量。脂肪酸命名參照Vestal等[26]和Frosteg?rd等[27]的方法,通過MIDI系統(tǒng)微生物特征PLFA譜圖數(shù)據(jù)庫比對(duì),參考已被廣泛證實(shí)的微生物標(biāo)志脂肪酸,并結(jié)合研究區(qū)同類土壤微生物區(qū)系分析,用特定FAMEs指示不同微生物類群。
草地生長年限、季節(jié)及其交互效應(yīng)對(duì)土壤中不同種類FAMEs含量、特定脂肪酸比例和微生物生物量的影響,用JMP統(tǒng)計(jì)分析軟件(版本12.0, SAS軟件研究所)進(jìn)行雙因素方差分析。草地不同生長年限和季節(jié)間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分異(或相似性),用多元統(tǒng)計(jì)分析軟件PC-ORD 6.0(MjM軟件,美國)進(jìn)行判別,PLFA提取物中相對(duì)豐度>1%的FAMEs(n=22)用于非度量多維測(cè)度(nonmetric multidimensional scaling,NMS)排序。用S?rensen距離(Bray-Curtis法計(jì)算[28])確定樣本間非線性梯度的相關(guān)性及方向,并將草地不同生長年限和季節(jié)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異轉(zhuǎn)化為可視化的NMS排序圖。模型不穩(wěn)定性判別標(biāo)準(zhǔn)0.00001,步長為0.2,隨機(jī)運(yùn)行250次。同時(shí),分析驅(qū)動(dòng)微生物群落結(jié)構(gòu)分異的主要環(huán)境因子。環(huán)境變量在NMS排序中顯示為矢量圖,箭頭的長度和角度分別表示相關(guān)性強(qiáng)度和方向。多響應(yīng)置換過程(multi-response permutation procedure,MRPP)是一種非參數(shù)多元分析方法,用于判別不同生長年限和季節(jié)間土壤各類FAMEs豐度比例的兩兩比較和組間差異顯著性。多重比較的差異顯著性P值進(jìn)行Bonferroni校正,不同生長年限間15組,季節(jié)間6組。
從不同生長年限草地和永久性草地土壤中,共檢測(cè)出C10到C24的98種FAMEs,其中草地生長第5年土壤中FAMEs種類最多,為92種,比草地建植初期高出19%,永久性草地土壤檢測(cè)到85種FAMEs。脂肪酸10:0 3OH和13:1ω4c在草地生長第4和第5年土壤中出現(xiàn),19:1ω6c、19:0cyclo ω9c、20:2ω6c、24:1ω9c和16:2DMA 5種脂肪酸僅在第5年草地土壤中出現(xiàn),而14:1ω7c僅在永久性草地土壤中檢測(cè)到。不同季節(jié)有部分特征脂肪酸出現(xiàn),例如:10:0(癸酸)、14:1ω9c、19:0cyclo ω9c僅在春季土樣中檢測(cè)到,24:1ω9c僅出現(xiàn)在夏季土樣中,16:3ω6c和16:2DMA僅在秋季土樣中檢測(cè)到,13:1ω4c和14:1ω7c僅在冬季土樣中出現(xiàn)。夏季、秋季和冬季草地土壤中均檢測(cè)到11:0、12:0DMA和19:1ω6c,而在春季土壤中未檢測(cè)到。10:0 3OH、20:0iso、20:2ω6c、22:6ω3c和22:4ω6c 5種脂肪酸在春、夏、冬季草地土壤中均有分布,而在秋季土壤中消失。春、夏、秋季草地土壤中均含有10:0 2OH,冬季土壤中卻未檢測(cè)到。
隨著草地生長年限的增加,土壤中各類主要脂肪酸比例也隨之發(fā)生變化(表1)。草地生長年限對(duì)飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比(saturated/monounsaturated,sat/mono)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌脂肪酸的比例(gram positive/gram negative,G+/G-)產(chǎn)生極顯著影響(P<0.01),而對(duì)環(huán)丙烷脂肪酸與其前體脂肪酸之比(cyclopropane/precursors,cy/pre)無顯著影響(P=0.1188)。永久性草地土壤sat/mono低于生長1~5年草地,第2年草地亦低于第1和4年草地。隨草地生長年限的增加,G+/G-有逐漸減小的趨勢(shì),第5年草地G+/G-顯著低于第1和3年,比草地建植初期降低8%,接近永久性草地土壤G+/G-。草地生長5年間異構(gòu)與反異構(gòu)脂肪酸之比(isomers/ante-isomers,i/a)無顯著差異(P>0.05),但除第3年草地外,其他年限草地均顯著高于永久性草地(P<0.01)。真菌脂肪酸與細(xì)菌脂肪酸的比例(fungi/bacteria,F(xiàn)/B),在不同生長年限草地土壤中也表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05),Y5比Y1、Y2、Y3、Y4均高13%,且與永久性草地土壤F/B無顯著差異(P=0.6561)。
季節(jié)顯著影響研究區(qū)草地土壤中sat/mono、cy/pre、i/a和G+/G-(P<0.01),sat/mono夏、秋季比春、冬季分別高出20%和27%,cy/pre和i/a夏、秋季亦顯著高于春、冬季,G+/G-在各季節(jié)草地土壤中的高低順序?yàn)榍锛?夏季>冬季≈春季。F/B在不同季節(jié)草地土壤中,也表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05),秋季F/B均比春、夏、冬季低13%(表2)。
草地生長年限與季節(jié)對(duì)sat/mono(P=0.1215)、cy/pre(P=0.2802)、i/a(P=0.9663)、F/B(P=0.0506)和G+/G-(P=0.4700)的交互效應(yīng)均不顯著。
表1 不同生長年限草地土壤特定脂肪酸比例Table 1 Special FAMEs ratio of pasture soils in different growing years
注:sat/mono,飽和脂肪酸/單一不飽和脂肪酸;cy/pre,環(huán)丙烷脂肪酸/前體脂肪酸;i/a,異構(gòu)脂肪酸/反異構(gòu)脂肪酸;G+/G-,革蘭氏陽性菌脂肪酸/革蘭氏陰性菌脂肪酸;F/B,真菌脂肪酸/細(xì)菌脂肪酸;Y1~Y5,生長1~5年草地;P,永久性草地;不同小寫字母表示在0.05水平上處理間差異顯著,下同。
Note: sat/mono, ratio of saturated to monounsaturated fatty acids; cy/pre, ratio of cyclopropane to precursors fatty acid; i/a, ratio of isomers to ante-isomers fatty acid; G+/G-, ratio of gram positive to negative bacteria; F/B, ratio of fungi to bacteria; Y1-Y5, pastures 1 to 5 years old; P, permanent pasture. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P=0.05), the same below.
表2 不同季節(jié)草地土壤特定脂肪酸比例Table 2 Special FAMEs ratio in pasture soil in different seasons
草地生長年限顯著影響土壤細(xì)菌、真菌、真核生物、原生動(dòng)物及其總微生物生物量(P<0.01),隨著草地生長年限的增加,土壤總微生物量逐年增加,從Y1到Y(jié)5增加了46 nmol·g-1土壤,增長了45%,Y5接近永久性草地土壤微生物總量(表3)。細(xì)菌和真菌生物量經(jīng)過草地生長5年分別增長了44%和63%,變化趨勢(shì)與土壤總微生物量相似,Y2均高于Y1、Y3和Y4,且與Y5和永久性草地土壤微生物量之間無顯著差異(P>0.05)。真核生物生物量5年增加69%,Y5高于其他年份草地和永久性草地土壤。原生動(dòng)物生物量在草地生長前4年無顯著差異(P>0.05),生長5年后增加1倍,且顯著高于生長1~4年草地和永久性草地(P<0.05)。
季節(jié)顯著影響草地土壤中真核生物(P=0.0327)和原生動(dòng)物(P<0.01)生物量的變化(圖1)。春季草地土壤中真核生物生物量為1.8 nmol·g-1,比秋季草地土壤高20%。原生動(dòng)物生物量在夏季(1.2 nmol·g-1)高于其他3個(gè)季節(jié),且存在顯著的草地生長年限×季節(jié)的交互效應(yīng)(P<0.01),生長第5年草地在夏季的土壤原生動(dòng)物生物量最高。
表3 不同生長年限草地土壤微生物生物量Table 3 PLFA concentrations of the major microbial groups in pasture soils in different growing years (nmol FAMEs·g-1 soil)
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差;Y,草地生長年限;S,季節(jié);Y×S,草地生長年限和季節(jié)的交互效應(yīng)。**表示P<0.01,*表示P<0.05,NS表示不顯著,下同。
Note: Mean±SE; Y, pasture growing year; S, season; Y×S, pasture growing year and season interaction. ** indicates significant difference atP<0.01, * indicates significant difference atP<0.05, NS indicates no significance, the same below.
由表4可知,草地生長5年,土壤細(xì)菌中革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)生物量分別增加了38%和49%。Y5草地土壤G+和G-生物量大于Y1、Y3和Y4,與Y2和永久性草地?zé)o顯著差異。Y5草地土壤中的厭氧菌含量高于所有其他年限草地和永久性草地,比草地建植第1年增加67%,但與Y2和永久性草地的差異并不顯著。放線菌在永久性草地土壤中含量最高,生長5年增加38%,Y4與Y5之間無顯著差異。真菌中腐生真菌和叢枝菌根真菌經(jīng)過草地生長5年,分別增加了75%和41%,并接近永久性草地含量。
圖1 不同季節(jié)草地土壤真核生物和原生動(dòng)物生物量Fig.1 Microbial biomass of eukaryote and protozoa in pasture soil in different seasons 不同小寫字母表示真核生物生物量在季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05),不同大寫字母表示原生動(dòng)物生物量在季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of eukaryote biomass between seasons while different capital letters indicate significant differences of protozoa biomass between seasons (P<0.05).
研究區(qū)草地土壤中的厭氧菌和腐生真菌生物量在不同季節(jié)間存在顯著差異(圖2),但草地生長年限×季節(jié)的交互效應(yīng)均不顯著(表4)。冬季草地土壤厭氧菌平均含量1.8 nmol·g-1,顯著高于秋季(1.5 nmol·g-1)和夏季(1.4 nmol·g-1),春季亦比夏季高24%。腐生真菌生物量在秋季草地土壤中平均為7.7 nmol·g-1,比春季、夏季和冬季(平均9.7 nmol·g-1)低21%。
用相對(duì)豐度>1%的22種FAMEs進(jìn)行非度量多維測(cè)度(NMS)排序,其結(jié)果揭示了微生物群類在草地不同生長年限和季節(jié)間的分異。對(duì)不同生長年限草地土壤微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行NMS排序(圖3),生長第5年草地和永久性草地土壤微生物結(jié)構(gòu)與生長第1、2、3年草地分離,排序軸1和2累計(jì)解釋了82.9%的變異。多響應(yīng)置換過程(MRPP)分析顯示,Y1、Y2、Y3與Y5、P差異顯著(P<0.05),而Y1、Y2、Y3、Y4之間無顯著差異(P>0.05),Y4、Y5、P之間差異亦不顯著(P>0.05)。可見,草地生長4年改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),并趨近于永久性草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步用PC-ORD識(shí)別驅(qū)動(dòng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在草地生長年際間分異的環(huán)境因子,環(huán)境變量包括土壤有機(jī)碳氮、顆粒與非顆粒有機(jī)質(zhì)、碳礦化率、Ca、P、K、Mg、Zn元素含量及其交換量、陽離子交換量等,結(jié)果表明土壤碳礦化(carbon mineralization,CM)和顆粒有機(jī)質(zhì)(particulate organic matter,POM)含量是主要驅(qū)動(dòng)因子。
表4 不同生長年限草地土壤細(xì)菌和真菌生物量Table 4 PLFA concentrations of bacteria and fungi in pasture soils in different growing years (nmol FAMEs·g-1 soil)
對(duì)不同季節(jié)草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)NMS排序(圖4)結(jié)果表明,秋季草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與春季、夏季、冬季草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)明顯分離(P<0.01),排序軸1和2累計(jì)解釋82.9%的變異。同時(shí),MRPP分析結(jié)果顯示,夏季草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與冬季草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.01),而春季與夏季(P=0.1003)、冬季(P=0.3664)差異均不顯著。
圖2 不同季節(jié)草地土壤厭氧菌和腐生真菌生物量Fig. 2 Microbial biomass of anaerobe and saprophytic fungi in pasture soil in different seasons 不同小寫字母表示厭氧菌生物量在季節(jié)間存在顯著差異(P<0.01),不同大寫字母表示腐生真菌生物量在季節(jié)間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of anaerobe biomass between seasons (P<0.01) while different capital letters indicate significant differences of saprophytic fungi biomass between seasons (P<0.05).
對(duì)各季節(jié)草地土壤中不同種類FAMEs含量的方差分析表明,秋季草地土壤含有較豐富的G+、G-和放線菌的脂類標(biāo)志物,例如:15:0iso、15:0anteiso、19:0cycloω7c和16:0 10-methyl等。而在冬季草地土壤中FAMEs類群向叢枝菌根真菌和放線菌生物標(biāo)記轉(zhuǎn)變,如16:0 10-methyl和16:1ω5c。腐生真菌(18:1ω9c)和原生動(dòng)物(20:4ω6c)生物標(biāo)記在夏季草地土壤中顯著影響微生物群落,而在春季草地土壤中G-標(biāo)志物(16:1ω7c、18:1ω7c等)含量顯著增加。
從檢測(cè)到的FAMEs種類可以看出,輪作系統(tǒng)中隨著牧草生長年限的增加,F(xiàn)AMEs種類不斷增加,表明土壤微生物多樣性隨牧草種植年限的延長有提高的趨勢(shì),但永久性草地土壤FAMEs種類數(shù)低于生長5年的草地。白麗等[29]對(duì)黃土高原草地次生演替的研究表明,前30年土壤微生物多樣性逐漸增大,之后緩慢下降。長期單一的土地利用方式相比草地輪作降低了土壤微生物多樣性,此結(jié)果與張笑宇等[30]對(duì)煙草(Nicotianatabacum)輪作的研究結(jié)果一致,同時(shí)符合中度干擾假說[31]的生態(tài)學(xué)規(guī)律。
不同土地利用方式的土壤具有特定的脂肪酸類群和微生物群落結(jié)構(gòu)[32],Acosta-Martínez等[14]報(bào)道了放牧草地與蔬菜農(nóng)田相比,真菌PLFA標(biāo)志物增加(例如18:2ω6c、18:1ω9c、16:1ω5c),造成了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。蔬菜輪作為牧草4年后,土壤中陸續(xù)出現(xiàn)一些新的脂肪酸種類,例如表征革蘭氏陰性菌的10:0 3OH、13:1ω4c、19:1ω6c、19:0cyclo ω9c、24:1ω9c,表征厭氧菌的16:2DMA和表征真核生物的20:2ω6c,可以指示草地生長年限增加過程中土壤微生物的發(fā)生學(xué)關(guān)系,說明部分脂肪酸種類更適宜于較長生長年限的草地土壤微環(huán)境。研究表明[33],20:4ω6c與土壤酶活性和土壤微生物量密切相關(guān)。永久性草地土壤飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比顯著降低,可能是土壤有機(jī)質(zhì)含量較高的結(jié)果。Bossio等[34]的研究表明,在養(yǎng)分充足的土壤環(huán)境中,不飽和脂肪酸的比例會(huì)更高。
圖3 不同生長年限草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)非度量多維測(cè)度排序Fig. 3 PC-ORD nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination biplots using relative abundance of FAMEs>1% in pasture soil in different growing years Y1~Y5:生長1~5年草地 Pastures 1 to 5 years old;P:永久性草地 Permanent pasture;POM:土壤顆粒有機(jī)質(zhì) Particulate organic matter;CM:土壤碳礦化 Carbon mineralization.
圖4 不同季節(jié)草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)非度量多維測(cè)度排序Fig. 4 NMS ordination biplots using relative abundance of FAMEs>1% in pasture soil in different seasons Sp:春季 Spring;Su:夏季 Summer;F:秋季 Fall;W:冬季 Winter.
不同季節(jié)草地土壤中出現(xiàn)了特異脂肪酸,或有部分脂肪酸在特定季節(jié)消失,可能是土壤微生物對(duì)季節(jié)間水熱配比狀況差異的響應(yīng)。不同生長年限草地土壤在夏秋季飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比顯著高于春冬季,Moore-Kucera等[35]的研究結(jié)果也表明,夏季干旱脅迫引起飽和與不飽和脂肪酸比例升高。特定脂肪酸比例變化可以表征土壤微生物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答,但前提條件是環(huán)境壓力導(dǎo)致了細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)組成的改變[36]。
蔬菜-牧草輪作系統(tǒng)中,隨著草地生長年限的增加,土壤微生物量顯著增加,并接近永久性草地土壤微生物含量。Acosta-Martínez等[33]在德州西部的研究表明,多年生牧草和黑麥(Secalecereale)-棉花(Gossypiumhirsutum)輪作土壤微生物量高于棉花連作。徐麗君等[37]對(duì)不同生長年限紫花苜蓿人工草地的研究結(jié)果表明,1~4年土壤微生物量逐漸增加,第5年開始減少。不同生長年限草地土壤的微生物總量、細(xì)菌、真菌和放線菌生物量在季節(jié)間無顯著差異,暗示季節(jié)并不影響土壤中占比較大的微生物類群的生物量,大部分微生物量在季節(jié)間保持基本穩(wěn)定。然而,占比較小的真核生物、原生動(dòng)物、腐生真菌、厭氧菌生物量在不同季節(jié)間有顯著差異。李振高等[38]和Bell等[39]指出,土壤溫度和水分的季節(jié)變化直接控制著生態(tài)系統(tǒng)中微生物量和酶活性波動(dòng),土壤微生物量碳與土壤濕度、溫度、降水和平均氣溫等非生物因素具有顯著正相關(guān)關(guān)系。同時(shí),土壤微生物量季節(jié)性漲落還與土壤中可利用碳和養(yǎng)分資源的限制、植物生長節(jié)律有關(guān)[40]。
牧草種植5年土壤真菌與細(xì)菌比率顯著提高,指示土壤功能發(fā)生重要變化[21]。研究表明,土壤微生物真菌途徑對(duì)碳的存儲(chǔ)能力較強(qiáng)[41],部分ε-變形菌屬的細(xì)菌通過分泌特異性酶影響CO2固定能力[42]。真菌菌絲被認(rèn)為是土壤中不穩(wěn)定性碳和營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源,在細(xì)菌接近顆粒碳底物的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[43]。草地生長5年,叢枝菌根真菌含量增加,且在永久性草地土壤中最多。Bainard等[44]在加拿大草原的研究表明,對(duì)于長期放牧草地,叢枝菌根真菌能增強(qiáng)土壤氮和磷的吸收與轉(zhuǎn)化,提高牧草耐受干旱脅迫的能力,促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成和穩(wěn)定性。隨著草地生長年限的延長,革蘭氏陽性菌占比逐漸減小,而革蘭氏陰性菌比例增大。Romaniuk等[45]也證實(shí)革蘭氏陰性細(xì)菌在生長10年的放牧草地土壤中較多,革蘭氏陰性菌含量常隨著土壤有機(jī)碳有效性的增強(qiáng)而增加[46]。Riah-Anglet等[21]對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究表明,永久性草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變與功能的變化緊密關(guān)聯(lián)。草地生長第2年土壤微生物生物量顯著增加,但群落結(jié)構(gòu)在草地生長4年才發(fā)生顯著變化,說明量變積累到一定階段后才會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)性的質(zhì)變。Xue等[47]對(duì)不同土地利用系統(tǒng)的研究也發(fā)現(xiàn),微生物生物量的變化不一定總是伴隨著微生物群落多樣性和活性的變化。
季節(jié)變化影響草地土壤微生物群落[48],不同生長年限草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在秋季顯著區(qū)別于其他季節(jié),夏季與冬季不同。Slaughter等[49]在本試驗(yàn)區(qū)附近的草地研究結(jié)果也表明,季節(jié)顯著影響草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。Stevenson等[48]對(duì)新西蘭北島溫帶氣候區(qū)草地的研究也表明,秋季土壤細(xì)菌群落明顯區(qū)別于其他季節(jié),本研究結(jié)果與此一致。季節(jié)間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與非生物因素有關(guān),例如土壤溫度、濕度及其綜合作用等。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致其分解功能穩(wěn)定性發(fā)生改變[50],本研究中草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)秋季不同于其他季節(jié),秋季土壤碳礦化潛力也顯著低于其他季節(jié)。
隨著蔬菜-牧草輪作系統(tǒng)中草地生長年限的增加,土壤微生物的脂肪酸種類和數(shù)量逐漸增加。草地生長4年后土壤中出現(xiàn)新的脂肪酸種類,不同季節(jié)亦有特征脂肪酸出現(xiàn)或消失。草地生長5年土壤微生物總生物量增加45%,接近永久性草地土壤微生物生物量。其中原生動(dòng)物生物量增加1倍,腐生真菌增加75%。季節(jié)顯著影響真核生物、原生動(dòng)物、腐生真菌、厭氧菌生物量和特定脂肪酸比例。草地生長4年后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,且趨近于永久性草地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤碳礦化和顆粒有機(jī)質(zhì)含量的變化是驅(qū)動(dòng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分異的主要環(huán)境因子。