心肌再生途徑的研究

陳佩兒　鐘劍鋒　梁政　陳燦

摘要：急性心肌梗死（AMI）已成全球缺血性心血管疾病的主要死因之一。近年來，隨著經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和再灌注時間的改善，急性心梗患者死亡率顯著降低。但心肌梗死后導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量減少，纖維瘢痕增生，引起心室結(jié)構(gòu)重建、心肌彈性下降、臟壁擴張變薄和心功能下降等，逐漸形成慢性心力衰竭（CHF）。結(jié)合我國人口老齡化及冠心病發(fā)病的特點，意味著更多的人會逐漸發(fā)展形成CHF，將嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量。心肌再生是讓受損心肌周圍細(xì)胞和血管再次增殖分化，從而減輕心室結(jié)構(gòu)重建，改善心功能。本文就促心肌再生方法，包括信號通路調(diào)節(jié)、干細(xì)胞移植治療、心臟重編碼、外泌體旁分泌刺激、新興組織工程做一綜述。

關(guān)鍵詞：急性心肌梗死;心肌細(xì)胞;心肌再生

中圖分類號：R54 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.016

文章編號：1006-1959（2019）19-0051-04

Study on Myocardial Regeneration Pathway

CHEN Pei-er，ZHONG Jian-feng，LIANG Zheng，CHEN Can

（Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524000，Guangdong，China）

Abstract：Acute myocardial infarction （AMI） has become one of the leading causes of global ischemic cardiovascular disease. In recent years， with the improvement of percutaneous coronary intervention and reperfusion time， the mortality of patients with acute myocardial infarction has been significantly reduced. However， after myocardial infarction， the number of myocardial cells is reduced， fibrous scar hyperplasia， ventricular structural reconstruction， myocardial elasticity decline， dilated wall thinning and cardiac function decline， and chronic heart failure （CHF） is gradually formed. Combined with the characteristics of China's aging population and the incidence of coronary heart disease， it means that more people will gradually develop CHF， which will seriously affect the prognosis and quality of life of patients. Myocardial regeneration is the proliferation and differentiation of cells and blood vessels around the damaged myocardium， thereby reducing ventricular structural remodeling and improving cardiac function. This article summarizes the methods of promoting myocardial regeneration， including signal pathway regulation， stem cell transplantation therapy， cardiac re-encoding， exocrine paracrine stimulation， and emerging tissue engineering.

Key words：Acute myocardial infarction;Myocardial cells;Myocardial regeneration

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡造成患者心功能衰竭和惡性心律失常發(fā)生的主要原因，為家庭及社會帶來巨大的精神壓力和沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。心肌再生的目標(biāo)是心肌損傷或死亡后通過增加有活力的心肌細(xì)胞，恢復(fù)心臟收縮功能，減輕AMI后的心臟重構(gòu)。本文簡要對幾種常見促心肌再生的方法，包括信號通路調(diào)節(jié)、干細(xì)胞移植治療、心臟重編碼、外泌體旁分泌刺激、新興組織工程等作一綜述，以期為臨床治療提供參考依據(jù)。

1 Hippo-YAP信號通路

Hippo通路首次在果蠅身上發(fā)現(xiàn)，其可通過控制細(xì)胞的增殖、存活和分化來調(diào)節(jié)器官的大小，是一條典型、保守的信號通路。人類的YAP基因位于染色體11q22區(qū)，該基因存在YAP1和YAP2兩種變位剪切形式，其中YAP1包含1個WW結(jié)構(gòu)域，而YAP2則包含2個WW結(jié)構(gòu)域。YAP基因有多個特異氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域，包括SH3結(jié)合基序、C端的轉(zhuǎn)錄激活域、PDZ結(jié)合基序、2個WW結(jié)構(gòu)域、N端富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域以及轉(zhuǎn)錄因子TEADs結(jié)合區(qū)。YAP基因通過這些氨基酸序列或結(jié)構(gòu)域，可與多種蛋白相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的多條信號通路，行使多種生物學(xué)功能[1]。YAP基因主要位于細(xì)胞質(zhì)中，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄共激活因子，其缺乏明顯的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不能獨立進行轉(zhuǎn)錄，需與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進入細(xì)胞核內(nèi)共同激活與生長直接相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

在正常成年哺乳動物的心臟中大約有30%的細(xì)胞是心肌細(xì)胞，另外的70%為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和免疫細(xì)胞[2]。Wu S等[3]通過對脊椎動物研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞有低度的再生潛能，在切除斑馬魚心臟（<20%）后，其心臟能通過殘余心肌細(xì)胞有絲分裂恢復(fù)原來的大小，主要與Hippo-YAP信號通路激活有關(guān)。Jones NC等[4]在小鼠的動物模型中對Hippo-YAP信號通路進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YAP基因在胚胎和出生后7 d之內(nèi)為高表達，而經(jīng)過一過性再生窗口期后，其表達量迅速下降，心肌細(xì)胞也由此進入不可再生的階段;心肌細(xì)胞的YAP基因一旦出現(xiàn)特異性失活，小鼠出生后可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、纖維化、心腔擴大或過早的死亡，而YAP基因重新激活可刺激心肌細(xì)胞的再生，減輕心肌損傷、增加心肌的收縮力，進而改善心功能及心室重構(gòu)。

2干細(xì)胞移植治療

近年來，干細(xì)胞療法已成為一種治療急性或慢性缺血性心肌病最有前景的策略。干細(xì)胞類型包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞，及心臟干細(xì)胞等[5]。

胚胎干細(xì)胞是來源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團、具有全能性的細(xì)胞，其最大的優(yōu)勢體現(xiàn)為可以分化成不同類型的細(xì)胞，其中包括心肌細(xì)胞。在特定的培養(yǎng)條件下，胚胎干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞，例如小鼠的內(nèi)胚層樣細(xì)胞與各種心臟分化所需生長因子共同培養(yǎng)下，可通過旁分泌作用促使胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞[6]。Nakamura T等[7]研究證實了多能干細(xì)胞的存在，其類似于胚胎干細(xì)胞，卻源于成熟體細(xì)胞，利用反轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Oct3/4、Klf4和c-Myc誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞。多潛能干細(xì)胞是類似于胚胎干細(xì)胞的多能干細(xì)胞，其迅速成為干細(xì)胞療法的一種新來源，并克服了胚胎干細(xì)胞帶來的一些倫理問題。內(nèi)皮祖細(xì)胞可分化為內(nèi)皮細(xì)胞，其來源于骨髓的多能造血干細(xì)胞，參與血管內(nèi)皮功能的維持、損傷的修復(fù)和血管的再生。臨床研究顯示[8]，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以作為預(yù)測AMI后心血管突發(fā)事件的再發(fā)生。動物實驗研究同樣發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射內(nèi)皮祖細(xì)胞后可以減輕心臟纖維化和促進心室重構(gòu)。間充質(zhì)干細(xì)胞是從骨髓、脂肪組織和臍帶血等多種孤立的組織中獲得，其可分化成心肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，骨骼肌成肌細(xì)胞和脂肪組織。間充質(zhì)干細(xì)胞移植到體內(nèi)后，通過旁分泌途徑，釋放多種細(xì)胞因子、生長因子來促進MI周邊的細(xì)胞增殖和分化，這是間充質(zhì)干細(xì)胞治療最主要的作用[9]。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫抑制功能和免疫特權(quán)，在異體移植中，可作為基礎(chǔ)干細(xì)胞治療的重要來源。

3心臟重編碼

有研究表明[10]，胰腺外分泌細(xì)胞可以直接重新編程β細(xì)胞過表達的轉(zhuǎn)錄因子。同樣，成纖維細(xì)胞可以利用體外3個轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2C和Tbx5直接重組成類似心肌樣細(xì)胞。幼鼠心肌內(nèi)病毒逆轉(zhuǎn)錄GATA4、MEF2C和Tbx5因子，可以比體外更高效率地把成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成心肌樣細(xì)胞，從而更好地改善心肌梗死后心肌細(xì)胞的功能[11]。另外，其它轉(zhuǎn)錄因子，如GATA4、HAND2、MEF2C、Tbx5、ETS2、MESP1及microRNA等也表現(xiàn)出類似的作用[12-15]。

目前，重編程效率仍然很低。重編程的外顯率，即心肌細(xì)胞表型并不完整，其轉(zhuǎn)分化機制仍未明確。此外，由于尚未深入研究，暫未明確其在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄重編碼是否會影響相鄰非心臟組織，以及重新編程后是否會導(dǎo)致心律失常等不良事件。但重編程在體外能將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成心肌細(xì)胞而獲得心肌組織的再生，生成數(shù)量充足的心肌細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞的治療應(yīng)用上是可行的，技術(shù)上較為簡單，能避免免疫抑制的情況發(fā)生[16]。

早期研究報道[17]，在小鼠正常衰老過程中心肌細(xì)胞基本保持穩(wěn)定，而心肌梗死后可從非心肌祖細(xì)胞群（重鏈非α-肌球蛋白）形成新的心肌細(xì)胞。此外，臨床病例報告結(jié)果指出，使用人類胚胎干細(xì)胞來源的心臟祖細(xì)胞嵌入纖維蛋白基質(zhì)治療心力衰竭，在改善左室射血功能的同時，并沒有觀察到心律失常、腫瘤形成和免疫抑制等相關(guān)不良事件的發(fā)生。FoxOs轉(zhuǎn)錄因子屬于叉頭框蛋白家族中的一個亞類，其最大的特點是擁有一個被稱為叉頭盒的翼狀螺旋DNA結(jié)合域，細(xì)胞可通過該結(jié)構(gòu)域?qū)寡趸瘬p傷[18]。

4外泌體旁分泌刺激

外泌體是細(xì)胞分泌的一種在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳遞信息（包括miRNA、蛋白、分子伴侶、信號分子）的磷脂雙分子層囊泡。越來越多的研究證實，外泌體在心肌再生機制中是一個潛在的重要媒介，心肌祖細(xì)胞和干細(xì)胞來源的外泌體可以促進心臟內(nèi)源性修復(fù)和改善心梗后的心功能。來源于心肌祖細(xì)胞的外泌體，可通過ERK/Akt信號刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成，不僅增加毛細(xì)血管的密度，還刺激血管形成進入基質(zhì)膠塞。Vrijsen KR等[19]通過對促血管生成因子的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子的表達水平很高，同時心肌祖細(xì)胞自身釋放出生長因子、細(xì)胞因子以及趨化因子發(fā)揮血管再生成和抗凋亡的效應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)作用。Ibrahim AG等[20]通過在心梗模型的老鼠心梗周邊區(qū)分點注射心肌祖細(xì)胞來源的外泌體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可抑制心肌細(xì)胞程序性死亡、增強血管再生能力和提高心功能。通過對外泌體成分的研究，發(fā)現(xiàn)miRNAs起著關(guān)鍵性作用，miRNAs是一類約為22～25 bp的內(nèi)源性、非編碼的小RNA分子，大約調(diào)節(jié)著人類1/3的基因，其中miR-210和miR-132能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進血管內(nèi)皮再生;miR-146a協(xié)同miR-22和miR-24可以干擾TOLL樣受體和TGF-β纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減少心肌纖維化以及瘢痕形成[21，22]。

5新興組織工程

近年來，組織工程學(xué)是一門新興的生物高技術(shù)，指在體外利用細(xì)胞和生物材料模擬三維結(jié)構(gòu)進行組織重建，最常見的是，在細(xì)胞層面上注入多孔的、可降解的生物支架。合成材料在制造上具有很大的優(yōu)勢，操作簡單、成本較低、可再生合成，但缺點是其生物相容性較差，會引起局部炎癥反應(yīng)，甚至釋放有毒降解物[23]。

用于組織工程的心肌細(xì)胞一般來源于未成熟的胚胎細(xì)胞和干細(xì)胞，為達到成熟心肌細(xì)胞的能力，這些細(xì)胞需要組織成索樣心肌結(jié)構(gòu)以及10倍以上的心肌厚度。Zimmermann WH等[24]利用新生兒的心肌細(xì)胞來制備組織工程的心臟組織，并運用循環(huán)拉伸系統(tǒng)將這些心臟組織進行拉伸（時間為7 d），再將這些心臟組織移植到心梗后的老鼠心臟表面，1個月后發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞呈現(xiàn)較好的收縮功能。同時，梗死區(qū)域的心肌傳導(dǎo)速度也有所改善，可能是移植的心臟組織與梗死周邊區(qū)建立了電生理聯(lián)系。Pascual-Gil S等[25]研究表明，應(yīng)用人工合成水凝膠、纖維納米、微米和脂質(zhì)體等生物材料，并結(jié)合輔助生長因子可增加細(xì)胞的存活，將長期有效替代心臟組織并恢復(fù)其結(jié)構(gòu)與功能。

6其它心肌再生的策略研究

6.1內(nèi)源性因子刺激心肌再生 ?內(nèi)源性刺激心臟祖細(xì)胞的蛋白因子或生長因子，如Tβ4、VEGF、MCP3、PGF、SCDF1等，通過細(xì)胞增殖、血管生成和血管新生進行心臟修復(fù)[26，27]。

6.2心外膜來源細(xì)胞刺激心肌再生 ?在胚胎發(fā)育過程中，來源于中胚層心臟系祖細(xì)胞的Wt1+心外膜前體細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等[28]。早期切去斑馬魚的心尖部，發(fā)現(xiàn)心外膜細(xì)胞可以向心內(nèi)膜遷移而參與心肌再生。同時也發(fā)現(xiàn)，心梗模型小鼠的Wt1+基因表達上調(diào)，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞參與冠狀動脈的血管重建[29]。

6.3細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 ?成年哺乳動物的心肌細(xì)胞，幾乎不再增殖與分裂，心肌細(xì)胞從此退出了細(xì)胞周期[30]。但有研究發(fā)現(xiàn)[31]，胚胎時期心臟中的細(xì)胞周期蛋白激酶復(fù)合物（CyclinB-CDK1、CyclinA-CDK1/2、CyclinE-CDK2和CyclinD-CDK4/6）的表達水平較高，出生后明顯下降。細(xì)胞周期調(diào)控蛋白可能與心肌內(nèi)源性再生密切相關(guān)，調(diào)控蛋白種類和發(fā)揮途徑可能影響著心肌細(xì)胞的分裂與增殖。

7總結(jié)

心肌細(xì)胞具有自律、興奮、傳導(dǎo)、收縮等功能，心肌梗死后心肌細(xì)胞數(shù)目減少，引起心室重構(gòu)，嚴(yán)重影響心功能。因此，心肌細(xì)胞再生及轉(zhuǎn)化無疑是將來治療心血管疾病的重要手段。目前心肌細(xì)胞再生及轉(zhuǎn)化的研究仍局限于臨床前實驗階段，對于臨床心血管疾病的應(yīng)用，尚存在一些問題亟待解決：①如何保持基因高表達及基因特異性從而刺激心肌細(xì)胞再生;②如何安全、有效地將干細(xì)胞轉(zhuǎn)入機體并穩(wěn)定高效表達;③如何避免外源性細(xì)胞與宿主細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng);④如何解決體內(nèi)生物材料帶來的不相容性。盡管多種研究策略為心肌再生提供了廣闊的應(yīng)用前景，但迄今尚未成功。隨著心肌再生機制的繼續(xù)探索與研究，相信心肌再生技術(shù)會給心衰患者帶來新的治療策略。

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