TiO2-Ag復(fù)合薄膜的制備及其抗菌性能

李 綱,付 濤

(1.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400054； 2.西安交通大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 西安 710049)

鈦及其合金因具有密度低、彈性模量較小、機(jī)械加工性能優(yōu)、耐腐蝕能力強(qiáng)和生物相容性好等諸多優(yōu)點，而成為目前最具有實用價值的生物醫(yī)用金屬材料，在人體硬組織替代和修復(fù)醫(yī)用領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景[1]。然而，隨著鈦及其合金在臨床上使用數(shù)量的增加，由周圍炎癥引起的植入體感染繼而導(dǎo)致植入失效的案例也相應(yīng)增多。因此，如何對生物醫(yī)用鈦及合金在植入人體后可能發(fā)生的感染進(jìn)行有效預(yù)防，借此來提高植入手術(shù)的成功率，越來越受生物醫(yī)用材料和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重視。

對鈦及其合金進(jìn)行表面抗菌化處理是實現(xiàn)上述目標(biāo)的有效手段之一。研究表明，在基體表面引入純的或者改性的TiO2涂層后，在紫外光或可見光的參與下，它們將具有良好的殺菌能力。然而，TiO2涂層的半導(dǎo)體特性使得它們在無光線介入時表現(xiàn)出的滅菌效果較差[2-3]。因此，賦予生物醫(yī)用鈦及合金材料在類似體內(nèi)的暗光環(huán)境下亦具有高抗菌活性具有十分重要的臨床實際意義。Ag具有廣譜的抗菌活性，耐久性好，且對正常細(xì)胞的毒性較低，加之其易于與多種材料復(fù)合，因此成為近年來對鈦及其合金進(jìn)行表面抗菌化處理的首選材料。迄今為止，已有磁控濺射[4]、微弧氧化[5]、離子注入[6]、熱驅(qū)動分解[7]、水熱還原[8]等方法被報道用于鈦及其合金表面的Ag負(fù)載，并且采用這些方法制得的載銀涂層在暗光環(huán)境下都顯示出良好的抗菌效果。郭楊陽等[4]采用磁控濺射法在醫(yī)用鈦合金Ti6Al4V表面制備出了Ti-Ag及Ti-Ag-N薄膜，兩種薄膜對大腸桿菌均有較好的抗菌性，且后者的抗菌性能更為優(yōu)異。余森等[5]采用兩步微弧氧化法在Ti6Al4V表面制備出載銀多孔涂層，它們在與金黃色葡萄糖球菌作用1 d后殺菌率可達(dá)96.94%。

本研究嘗試采用兩步法來制備含Ag的二氧化鈦抗菌膜層，即將鈦片置于H2O2-KCl的混合溶液中進(jìn)行水熱處理，繼而煅燒后獲得鈦基TiO2晶態(tài)多孔薄膜；隨后將該鈦基薄膜放入AgNO3水溶液中，利用晶態(tài)TiO2在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生的光生電子具有還原能力的特性來進(jìn)行光化學(xué)沉積載Ag，從而得到TiO2-Ag復(fù)合結(jié)構(gòu)。本研究將重點考察紫外光照射時間對鈦基TiO2薄膜表面載銀的影響，并以大腸桿菌為實驗菌種，采用覆膜-平板計數(shù)法對經(jīng)歷不同照射時間所得到的Ag-TiO2復(fù)合薄膜的抗菌性能進(jìn)行評價。

1 實驗

1.1 TiO2薄膜的制備

將純鈦片(純度99.9%，厚度0.3 mm)剪切成10 mm×10 mm的方形試樣，經(jīng)化學(xué)拋光后，依次用無水乙醇和去離子水超聲清洗干凈。隨后，將鈦片移入容積為100 mL的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，釜內(nèi)裝有20 mL溶有KCl的H2O2溶液，KCl的濃度為1 mol/L。將反應(yīng)釜密封，置于鼓風(fēng)干燥箱中于95 ℃反應(yīng)20 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將鈦片取出用去離子水反復(fù)沖洗，然后自然晾干。為了得到具有結(jié)晶態(tài)的TiO2膜層，將晾干的鈦片置于馬弗爐中煅燒，熱處理溫度為450 ℃，熱處理時間為2 h。

1.2 Ag-TiO2復(fù)合薄膜的制備

采用光沉積法制備載Ag二氧化鈦薄膜。將熱處理過的鈦基TiO2薄膜浸泡在35 mL濃度為25 mmol/L的硝酸銀水溶液中，用高壓汞燈(功率300 W，主波長365 nm)照射，高壓汞燈和液面的距離約14 cm。到達(dá)設(shè)定的照射時間后，立即從溶液中取出鈦片并用去離子水沖洗，然后自然風(fēng)干。為了探索照射時間對薄膜表面光化學(xué)沉積Ag的影響，控制高壓汞燈照射的時間分別為10、20和30 min。

1.3 材料表征

使用日本日立公司的S4800型掃描電子顯微鏡觀察樣品的形貌。樣品的晶相結(jié)構(gòu)用X射線衍射表征，在日本理學(xué)D/max 2500PC全自動粉末X射線衍射儀上完成。利用LabRAM HR800型共聚焦顯微拉曼光譜儀對樣品進(jìn)行拉曼光譜檢測，激光器波長為633 nm。X射線光電子能譜測試在Kratos XSAM-800型能譜儀上完成。Al靶、Kα射線作為發(fā)射源，分析儀器使用標(biāo)準(zhǔn)Au和Ag進(jìn)行校正。

1.4 抗菌性能評價

以大腸桿菌為實驗菌種，采用覆膜-平板計數(shù)法來評價試樣的抗菌性能。實驗前對培養(yǎng)皿、細(xì)菌培養(yǎng)管等進(jìn)行高溫蒸汽滅菌，試樣和濾膜用紫外光滅菌，每面均照射30 min。把經(jīng)過隔夜活化的大腸桿菌菌液稀釋一定倍數(shù)后，取10 μL滴加在試樣表面，用相同面積的濾膜覆蓋，室溫避光作用3 h。隨后把覆有濾膜的試樣放入細(xì)菌培養(yǎng)管，加入3 mL無菌水，充分震蕩后取100 μL，滴加到鋪好的無菌LB固體培養(yǎng)基上，用無菌涂布器涂布均勻。把接種的培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)24 h，用數(shù)碼相機(jī)拍照，觀察菌落數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEM分析

圖1(a)是將鈦片置于H2O2-KCl溶液中水熱處理后其表面的SEM圖片。由圖可知，鈦片經(jīng)歷水熱處理后，在其表面生成了數(shù)量可觀的納米片。這些納米片垂直于基體表面取向生長，且彼此之間相互交叉，形成開放的陣列多孔結(jié)構(gòu)。從放大圖片可知(見圖1(b))，單個納米片的厚度約10～30 nm。根據(jù)納米片的幾何形狀，可以判斷出在鈦片基體上形成的陣列薄膜的厚度僅有數(shù)百納米。圖1(c)～(d)是鈦基納米片陣列薄膜經(jīng)歷熱處理后的SEM。由圖可知，熱處理前后鈦基納米片陣列膜的形貌未發(fā)生顯著的變化。從圖1(e)～(f)可以觀察到：將熱處理過的鈦基納米片陣列膜浸泡于AgNO3溶液中經(jīng)歷10 min的紫外光照射，有數(shù)量較多的納米顆粒在其表面均勻沉積，它們的尺寸約 10 nm。對比紫外光照射前后薄膜的SEM圖片，推測這些顆粒應(yīng)該為含Ag物種。圖1(g)～(j)顯示，隨紫外光照射時間的延長，這些納米顆粒的尺度有明顯的增加，從約25 nm增至約40 nm，并出現(xiàn)聚集生長的趨勢，分散性變差。

(a)～(b)水熱處理; (c)～(d) 煅燒后; (e)～(f) 光沉積10 min; (g)～(h)光沉積20 min; (i)～(j)光沉積30 min。

2.2 XRD分析

圖2(a)是將鈦片置于H2O2-KCl溶液中進(jìn)行水熱處理后其表面的XRD譜。譜圖上除了有歸屬于α-Ti的強(qiáng)衍射峰外(JCPDS no.44-1294)，未見有歸屬于TiO2的衍射峰存在，表明鈦片表面垂直于基體生長的納米片薄膜是非晶態(tài)的。將鈦基納米片薄膜于450 ℃熱處理2 h后，其XRD譜如圖2(b)所示。該譜圖中除了鈦的特征衍射峰出現(xiàn)外，在2θ=25.3°處還出現(xiàn)了一個較為微弱的衍射峰，該峰對應(yīng)于銳鈦礦型TiO2的(101)晶面(JCPDS no.21-1272)，這表明通過水熱反應(yīng)在鈦片表面獲得的薄膜經(jīng)歷后續(xù)熱處理后從無定形態(tài)轉(zhuǎn)變成了銳鈦礦型。將該鈦基TiO2薄膜置于AgNO3溶液中，用高壓汞燈照射30 min后，樣品的XRD譜如圖2(c)所示。由圖可知，在2θ=38.1°、44.3°、64.5°和77.4°處出現(xiàn)了4個新衍射峰，分別對應(yīng)于單質(zhì)Ag的(111)、(200)、(220)和(311)晶面(JCPDS no.87-0717)，證實經(jīng)紫外光照射后，在樣品表面成功得到了Ag-TiO2復(fù)合結(jié)構(gòu)。

(a) 水熱處理; (b) 煅燒后; (c) 光沉積30 min

2.3 拉曼光譜分析

為進(jìn)一步確認(rèn)熱處理后樣品的物相組成，采用共聚焦顯微拉曼光譜儀對其進(jìn)行拉曼光譜測試，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，在145.6、207.3、398.1、520.6和641.1 cm-1處出現(xiàn)了5個明顯的拉曼響應(yīng)峰，分別對應(yīng)于銳鈦礦型二氧化鈦晶格的Eg(1)、Eg(2)、B1g(1)、A1g(1)+ B1g(2)和Eg(3)拉曼活躍模式[9-10]。拉曼光譜結(jié)果進(jìn)一步證實，鈦片經(jīng)由水熱反應(yīng)并煅燒處理后在其表面獲得了銳鈦礦型的晶態(tài)TiO2薄膜。

圖3 水熱處理-熱處理樣品的Raman光譜

2.4 XPS分析

為了分析樣品的表面成分和各元素的化學(xué)價態(tài)，選擇光化學(xué)沉積20 min的樣品進(jìn)行XPS測試，所得全譜如圖4(a)所示。由譜圖可知，樣品含有Ti、O、Ag及C元素，其中電子結(jié)合能位于284.8 eV處出現(xiàn)的C 1s信號來源于儀器自身的污染碳。圖4(b)為Ti 2p的高分辨XPS掃描譜。由圖可知，Ti 2p譜包含兩個峰，峰值分別位于458.6 eV和464.2 eV 處，對應(yīng)于Ti 2p3/2和Ti 2p1/2的電子結(jié)合能。兩峰的峰型對稱，電子結(jié)合能差值為5.6 eV，證實Ti元素以TiO2的形式存在[11-12]。這與本文的XRD以及Raman光譜結(jié)果完全吻合。圖4(c)為O 1s的高分辨XPS掃描譜。該譜圖可以擬合為兩條曲線，峰值分別為530.1 eV和531.7 eV，與晶格氧(Ti-O)及化學(xué)羥基氧(-OH)的電子結(jié)合能值分別相對應(yīng)[13-14]。Ag 3d掃描譜(圖4(d))顯示該譜包含兩個峰型對稱的峰，峰值分別位于電子結(jié)合能368.2 eV和374.2 eV處，電子結(jié)合能差為6.0 eV，這是Ag以單質(zhì)態(tài)形式存在的判據(jù)[15]。XPS結(jié)果證實，在鈦片表面成功得到了TiO2-Ag復(fù)合結(jié)構(gòu)。

2.5 抗菌性能評價

圖5是不同制備條件下所得樣品在暗光環(huán)境下對大腸桿菌的抗菌實驗結(jié)果。對未負(fù)載Ag顆粒的鈦基TiO2薄膜樣品而言，接種后的培養(yǎng)基經(jīng)24 h有氧培養(yǎng)后，在培養(yǎng)皿中可以觀察到大量細(xì)菌菌落(圖5(a))，表明該鈦基TiO2薄膜不具有抗菌性能。而對于紫外光照射10、20及30 min后得到的載Ag-TiO2薄膜樣品，在培養(yǎng)皿中已觀察不到細(xì)菌菌落出現(xiàn)(圖5(b)～(d))，表明此3種含Ag二氧化鈦復(fù)合薄膜均具有良好的抗菌活性。

圖4 紫外光下沉積20 min所得樣品的XPS譜

圖5 樣品的抗菌實驗結(jié)果

3 結(jié)論

1) 采用水熱處理-光化學(xué)沉積兩步法在鈦片表面成功構(gòu)筑出復(fù)合TiO2-Ag薄膜。將鈦片置于KCl-H2O2溶液中水熱處理并經(jīng)后續(xù)煅燒，在其表面獲得了垂直基體取向生長的銳鈦礦型TiO2納米片陣列多孔薄膜。隨后在AgNO3水溶液中對該薄膜進(jìn)行紫外光照射，在其表面得到了以單質(zhì)形態(tài)存在的Ag納米顆粒。

2) 紫外光照射時間對薄膜表面Ag的沉積有較大的影響，隨照射時間的增長，Ag納米顆粒的尺度逐漸從約 10 nm增大至約40 nm，且分散性變差。

3) 大腸桿菌的覆膜-平板計數(shù)法實驗結(jié)果表明：3種TiO2-Ag復(fù)合薄膜對大腸桿菌均顯示出良好的抗菌效果。