Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中微小RNA-192表達(dá)及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

張建林 吳 韋 林見敏

結(jié)直腸癌是1種常見惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和病死率中，結(jié)直腸癌已經(jīng)上升到第四位[1]。由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿，患者在就診時(shí)往往已經(jīng)屬于進(jìn)展期，預(yù)后比較差，治療結(jié)直腸癌的主要方法是結(jié)直腸癌根治術(shù)[2]。近年來，微小RNA成為腫瘤分子研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，微小RNA參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、凋亡、增殖、多藥耐藥等過程。已有報(bào)道顯示在多種腫瘤中，微小RNA-192表達(dá)異常。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，微小RNA-192能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[3-4]。在正常組織和結(jié)直腸癌組織中，微小RNA-192存在表達(dá)差異。本文對(duì)微小RNA-192在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性進(jìn)行探究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年1月至2018年12月的130例進(jìn)行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者的新鮮標(biāo)本。所有患者明確研究目的，簽署知情同意書?；颊咝g(shù)前沒有進(jìn)行放化療治療。所有患者臨床資料完整。排除炎性腸病患者、家族性息肉患者、多原發(fā)癌患者?；颊咝g(shù)后12個(gè)月內(nèi)進(jìn)行腸鏡檢查。術(shù)后每3個(gè)月或者半年，進(jìn)行一次腹盆腔影像學(xué)檢查以及癌胚抗原檢測。75例患者術(shù)后進(jìn)行輔助化療，使用5-氟尿嘧啶。依據(jù)影像學(xué)檢查、病理活檢、腸鏡檢查或者二次手術(shù)病理學(xué)結(jié)果，3年內(nèi)沒有發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的81例，作為未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組，3年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有49例，作為轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組。選取無癌細(xì)胞的癌旁組織，作為對(duì)照組，共50例患者。所有標(biāo)本術(shù)后放置于液氮中?；颊邚牟扇〗Y(jié)直腸癌根除術(shù)進(jìn)行治療后，到第一次轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的時(shí)間，為無復(fù)發(fā)生存時(shí)間。

1.2 方法

使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高速冷凍式離心機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀、紫外分光光度儀等材料和儀器。①將液氮中的標(biāo)本進(jìn)行研磨，使用Trizol試劑盒，提取標(biāo)本中的總RNA。嚴(yán)格按照試劑盒的要求進(jìn)行操作。對(duì)獲得的總RNA檢測吸光度，使用紫外分光光度儀。對(duì)于A260和A280的比值超過1.8的樣本，檢測miRNA。檢測RNA的完整性，采用1%瓊脂糖凝膠電泳的方式[5]。②配置反轉(zhuǎn)錄體系20 μl。使用無RNA酶雙蒸水、酶混合物、緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、混合引物等，在37 ℃條件下一小時(shí)，在95 ℃條件下5 min，迅速冷卻后，在-80 ℃的冰箱中保存。③使用Primer 5.0軟件，對(duì)微小RNA-192和內(nèi)參U6引物進(jìn)行上下游設(shè)計(jì)[6]。下游引物使用試劑盒中Uni-miR qPCR Primer，嚴(yán)格按照操作說明，在94 ℃條件下，預(yù)變性10 cm，94 ℃下的14 s，60 ℃下25 s，依次進(jìn)行40次循環(huán)。設(shè)置3個(gè)反應(yīng)復(fù)孔，取每個(gè)待測樣本的平均值。使用內(nèi)參U6，對(duì)微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況

未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況，包括年齡、性別、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、術(shù)前CEA、N分期、TNM分期、術(shù)后輔助化療、T分期，與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者相比，兩組數(shù)據(jù)沒有明顯差異(P>0.5)，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.2 微小RNA-192在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

130例進(jìn)行結(jié)直腸癌根除術(shù)的Ⅱ、Ⅲ期患者，微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.09，無癌細(xì)胞的癌旁組織的對(duì)照組，微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量為0.58±0.10，結(jié)直腸癌患者的微小RNA-192相對(duì)表達(dá)量，明顯低于癌旁組織的對(duì)照組，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者，腫瘤組織中微小RNA-192的相對(duì)表達(dá)量為0.33±0.08，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組結(jié)直腸癌患者，腫瘤組織中微小RNA-192的相對(duì)表達(dá)量為0.12±0.02，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組明顯低于未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組患者的一般情況比較(例，%)

2.3 微小RNA-192表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)130例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá)情況，將患者分為低表達(dá)組，以及高表達(dá)組。低表達(dá)組有35例，高表達(dá)組有95例。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá)，與患者的性別、年齡、腫瘤位置、脈管癌栓、分化程度、N分期、TNM分期、T分期無明顯關(guān)系(P>0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯差異(P<0.05)，見表2。

2.4 微小RNA-192表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

微小RNA-192低表達(dá)組患者有35例，術(shù)后復(fù)發(fā)22例，占62.86%，微小RNA-192高表達(dá)組患者有95例，術(shù)后復(fù)發(fā)26例，占27.37%，微小RNA-192低表達(dá)組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率，明顯高于微小RNA-192高表達(dá)組患者，兩組存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低表達(dá)組患者術(shù)后中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(14.1±1.2)個(gè)月，高表達(dá)組患者術(shù)后的中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間為(18.6±2.1)個(gè)月，兩組數(shù)據(jù)存在明顯差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ期患者的無復(fù)發(fā)生存率，微小RNA-192低表達(dá)患者和高表達(dá)患者沒有明顯差異(P>0.05)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅲ期患者的無復(fù)發(fā)生存率，微小RNA-192低表達(dá)患者和高表達(dá)患者，存在明顯差異(P<0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，影響結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，有微小RNA-192表達(dá)和腫瘤分期。

表2 微小RNA-192表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

臨床上治療Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的主要方式是根治性手術(shù)切除，但術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然比較高，影響患者的生存。微小RNA是1種小分子單鏈非編碼RNA，含有22-26個(gè)堿基，能夠與相應(yīng)的mRNA靶基因互補(bǔ)匹配，從而對(duì)該靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯進(jìn)行抑制，也可以與其他蛋白組成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體[7-8]。微小RNA在細(xì)胞遷移、凋亡、分化、增殖，以及組織生長中發(fā)揮著重要的作用。在多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、發(fā)展和進(jìn)展中，微小RNA也發(fā)揮著生物學(xué)作用[9-10]。在正常腎臟、肝臟、結(jié)直腸等組織中，微小RNA-192均有表達(dá)。腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中，微小RNA-192通過調(diào)控相關(guān)的蛋白、靶基因，從而發(fā)生作用。有認(rèn)為微小RNA-192對(duì)同源異形盒2，與鋅指E-盒結(jié)合的表達(dá)的調(diào)控，調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白，從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[11]。也有認(rèn)為通過p53作用，在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的過程中，微小RNA-192發(fā)揮作用，使用癌細(xì)胞停滯在G1和G2期[12]。本次研究顯示，相比癌旁組織，微小RNA-192在患者的腫瘤組織中低表達(dá)(P<0.05)，未轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組的表達(dá)高于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)組(P<0.05)，提示結(jié)直腸癌腫瘤組織中，微小RNA-192低表達(dá)，并且可能與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中的微小RNA-192表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，提示在結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，微小RNA-192發(fā)揮著重要的作用。本次研究中，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的患者，微小RNA-192低表達(dá)的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間，比高表達(dá)的短，提示微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時(shí)間有密切的關(guān)系。低表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于高表達(dá)組，進(jìn)一步顯示了微小RNA-192與患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，低表達(dá)微小RNA-192會(huì)促進(jìn)術(shù)后復(fù)發(fā)[13-14]。腫瘤分期、微小RNA-192表達(dá)，是影響患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此對(duì)腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測，可以采用微小RNA-192作為1個(gè)參考指標(biāo)[15]。

綜上所述，在Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌組織中，微小RNA-192低表達(dá)，微小RNA-192與結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。