• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    杜仲脂氧合酶基因家族全基因組鑒定及其表達特性研究

    2019-11-15 08:17:44朱利利杜慶鑫杜紅巖
    植物研究 2019年6期
    關鍵詞:內(nèi)含子杜仲擬南芥

    朱利利 慶 軍 杜慶鑫 何 鳳 杜紅巖*

    (1.中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心,鄭州 450003; 2.國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心,鄭州 450003)

    杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)的單科單屬植物,是第四紀冰川期后僅留存于我國的孑遺植物,具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值[1]。杜仲的皮、葉、果等器官中含有豐富的杜仲膠、黃酮、多酚、綠原酸等次生代謝物質(zhì)[2~4]。杜仲通過調(diào)節(jié)一系列代謝途徑激活防御系統(tǒng)保護其在多種環(huán)境條件下正常生長發(fā)育,其中茉莉酸、愈傷激素、脂肪酸氫過氧化物、醛類揮發(fā)物在植物的生長發(fā)育和防御過程中發(fā)揮重要作用,而這些物質(zhì)的生物合成過程受到脂氧合酶(Lipoxygenases,LOX)(EC:1.13.11.12)催化[5]。脂氧合酶(LOX)是一種含有非血紅素鐵的氧合酶,廣泛存在于真核和原核生物中,參與JA,醛類、醇類等芳香物質(zhì)的生物合成[6]。LOX在植物中以亞油酸、亞麻酸為底物,其9位或13位碳原子加氧生成脂氫過氧化物,根據(jù)加氧位置分為9-LOX和13-LOX[7]。LOX定位于植物不同亞細胞器,如黃瓜(Cucumissativus)的脂溶性LOX存在于胞槳和液泡中,而以跨膜蛋白形式存在的LOX定位于脂體膜和質(zhì)膜上[8],同時LOX也定位于葉綠體、微粒體、脂體等細胞器[9]。

    LOX是一個多基因家族,研究發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有6個LOX[10],葡萄(Vitisvinifera)中有18個LOX(有5個為假基因)[11],楊樹(Populustrichocarpa)中有21個LOX[12]。LOX是一種同工酶,植物的不同發(fā)育階段和脅迫條件可誘導相應特異LOX基因的表達。水稻(Oryzasativa)[13]、擬南芥[14]、番茄[15]等植物受到機械損傷時,其13-LOX基因特異表達誘導JA生物合成;煙草(Nicotianatabacum)受到病菌感染時,9-LOX類型基因活性增加[16];土豆(Solanumtuberosum)葉片接種真菌后,POTLX-3(9-LOX類型)表達量增加,但機械損傷對9-LOX基因沒有影響[17]。

    目前杜仲的基因組測序已完成,在全基因組水平上研究杜仲的LOX基因信息對探索杜仲的生長發(fā)育和抗脅迫能力提供參考。本研究利用生物信息學方法對杜仲的LOX基因家族進行鑒定和分類,同時結合杜仲的RNA-seq,分析LOX家族在杜仲不同發(fā)育時期、組織器官的表達譜,探索杜仲LOX基因家族功能。

    1 材料和方法

    1.1 數(shù)據(jù)來源及LOX基因家族鑒定和結構分析

    杜仲基因組測序數(shù)據(jù)、CDS序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息均來源于杜仲基因組數(shù)據(jù)(NCBI登錄號PRJNA357336、SRP095726及SRS2666014)。查閱國內(nèi)外文獻,下載已分類的5種植物的LOX氨基酸序列,水稻下載自水稻基因組(http://rice.plantbiology.msu.edu/)、擬南芥下載自TAIR(http://www.arabidopsis.org/),番茄下載自NCBI(登錄號TomLOXA(U09026)、TomLOXB(U09025)、TomLOXC(U37839)、TomLOXD(U37840)、TomLOXE(AY008278)和TomLOXF(FJ617476)),葡萄和楊樹的LOX氨基酸序列下載Phytozomev.11.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。

    LOX基因的結構域信息(PF00305)下載自Pfam數(shù)據(jù)庫,利用Hmmer 3.0軟件建立Profile HMM模型,并利用此模型檢索下載杜仲基因組數(shù)據(jù)中的蛋白質(zhì)序列,根據(jù)已得到的杜仲LOX基因家族序列建立新的HMM模型,用新的模型再次檢索杜仲蛋白質(zhì)序列,得到的序列被認為是候選蛋白質(zhì)序列,所有蛋白結構域經(jīng)過SMART(http://smart.embl/heidelberg.de/)驗證。利用GSDS在線工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)制作基因外顯子-內(nèi)含子結構圖。利用Plant-Ploc在線工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/)、WOLFPSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)和Softberry(http://www.softberry.com/)預測亞細胞定位,綜合3個軟件預測結果進行分析。

    1.2 杜仲LOX氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹構建

    利用ClustalX2.0.12軟件對杜仲、擬南芥、番茄、葡萄、楊樹和水稻的LOX氨基酸序列進行多重序列比對。比對結果用軟件MEGA6.0的最大似然法(Maximum Likelihood)構建系統(tǒng)進化樹,抽樣次數(shù)為1000(bootstrap:1000 relications),其他為默認值。

    1.3 杜仲LOX蛋白質(zhì)結構預測

    使用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)評估杜仲LOX蛋白的理論等電點、分子量、疏水性等理化性質(zhì),利用在線分析工具HNN Secondary StructurePrediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預測LOX蛋白的α-螺旋、延伸鏈等二級結構。

    1.4 杜仲LOX基因家族的表達分析

    通過下載不同發(fā)育時期的國家審定杜仲良種‘華仲6號’的葉片(4月18日、5月18日、6月17日、7月17日、8月16日及9月20日)、果實(采樣時間同葉片相同)和‘神農(nóng)架’樹皮(5月20日、7月20日及9月20日)的轉錄組數(shù)據(jù)獲得杜仲LOX基因的測序表達譜(FPKM值,fragments per kilobase of exon per million fragments mapped),數(shù)據(jù)來源于杜仲基因組RNA數(shù)據(jù),同時從NCBI網(wǎng)站SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載‘華仲6號’花后70天和160天種仁的測序表達譜(登錄號分別是SRR3203265,70d;SRR3203241,160d)。去除在不同發(fā)育時期和組織中FPKM均小于1的基因,利用EXCELL對篩選的基因FPKM值進行l(wèi)og10(FPKM+1)轉換,對數(shù)轉換后的數(shù)據(jù)利用SPSS進行標準化,利用軟件Cluster 3.0和JAVA TreeView-1.1.6對標準化的表達數(shù)據(jù)聚類分析。

    2 結果與分析

    2.1 杜仲LOX基因家族的鑒定

    通過Hmmer 3.0搜索,杜仲基因組共鑒定出23個LOX基因家族成員(表1)。23個LOX基因分布于12條scaffolds,每條scaffold上分布的基因數(shù)量為1~5個,而多基因分布的scaffolds上的基因呈聚集形式分布,形成串聯(lián)重復,推測這些基因發(fā)生過復制事件。杜仲LOX基因內(nèi)含子數(shù)量分布范圍是0~6,有9個LOX基因不含內(nèi)含子,有4個基因含5個內(nèi)含子,有5個基因含6個內(nèi)含子,其他LOX基因分別含有1~2個內(nèi)含子,其中EU05484-RA的內(nèi)含子序列長度顯然長于其它LOX基因內(nèi)含子序列,內(nèi)含子具體分布位置如圖1所示。亞細胞定位預測結果顯示杜仲23個LOX基因有15個定位于細胞質(zhì),8個定位于葉綠體。

    表1 杜仲LOX基因家族信息

    圖1 杜仲LOX基因內(nèi)含子外顯子結構Fig.1 The intron-exon structures of LOX genes in E.ulmoide

    圖2 杜仲與其他植物LOX氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequences of LOX in E.ulmoides and other plants

    2.2 杜仲LOX氨基酸序列的聚類分析

    依據(jù)杜仲LOX家族氨基酸長度和序列結構特征差異等特點,運用ClustalX2.0.12和MEGA對杜仲LOX氨基酸序列和已進行分類和功能研究的水稻、擬南芥、番茄、楊樹、葡萄的LOX氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹。進化樹顯示杜仲的LOX編碼蛋白與番茄的LOX蛋白遺傳距離最近,其次與葡萄、楊樹和擬南芥的距離較近,而與水稻的LOX編碼蛋白距離最遠。杜仲23個LOX蛋白與其他5種植物的LOX蛋白分類結果相似,也可分為9-LOX蛋白和13-LOX蛋白兩個類型,其中僅有EUC05484-RA編碼蛋白屬于9-LOX,其余22個LOX蛋白均屬于13-LOX,杜仲的13-LOX蛋白家族成員數(shù)量占據(jù)明顯優(yōu)勢,說明杜仲的13-LOX家族成員在進化上產(chǎn)生了較多擴增事件。杜仲的22個13-LOX家族成員聚為2個分支,其中第一個分支由EUC09637-RA和EUC22336-RA組成,分別與葡萄的GSVIVT01010359001編碼蛋白和番茄的TomLOXD蛋白聚成一支,且較杜仲其他13-LOX家族成員與9-LOX類型聚類距離更近;杜仲其余20個13-LOX家族成員組成第二個分支,同時第二分支又繼續(xù)分為3個小支,其中有17個成員與番茄的TomLOXC和TomLOXF蛋白聚為第一個小支,而EUC19390-RA單獨與葡萄的GSVIVT01032029001編碼蛋白聚為第二小支,EUC23900-RA和EUC19389-RA與楊樹的Potri.009G022400.1蛋白聚為第三小支。杜仲的9-LOX家族唯一成員EUC05484-RA與葡萄的3個9-LOX蛋白聚在一起、遺傳距離較近。遺傳距離越近,表明蛋白結構和功能更為相似,暗示杜仲的LOX蛋白功能可能與番茄、葡萄和楊樹的特定LOX蛋白具有相似的生理作用。

    2.3 杜仲LOX基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

    利用Protparam在線工具分析杜仲LOX蛋白一級結構,表2顯示杜仲23個LOX基因家族成員中,EUC22336-RA編碼的氨基酸數(shù)量最多為968aa,EUC24023-RA編碼的氨基酸數(shù)量最少為92,同時結果表明杜仲LOX基因家族編碼氨基酸數(shù)目與其分子質(zhì)量整體呈正相關,23個LOX基因的氨基酸數(shù)量和分子質(zhì)量均具有差異。根據(jù)理論等電點氨基酸可以分為堿性氨基酸(Theoretical pI>7)和酸性氨基酸或中性氨基酸(Theoretical pI≦7);蛋白質(zhì)總平均疏水性正值表現(xiàn)疏水性、負值表現(xiàn)為親水性,且疏水值越大越疏水,值越小越親水。其中EUC05484-RA為9-LOX家族成員,編碼氨基酸數(shù)量為401,理論等電點是5.98,為酸性氨基酸,同時總平均疏水值為-0.312,為親水性氨基酸。其余13-LOX類型中包括6個堿性氨基酸和16個酸性氨基酸或中性氨基酸,22個LOX蛋白疏水值均為負值,表現(xiàn)為親水性。

    表2 杜仲LOX基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

    HNN Secondary Stucture Prediction分析顯示α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲在杜仲整個LOX蛋白質(zhì)都有散布,其中無規(guī)則卷曲易受側鏈相互作用,經(jīng)常構成活性部位和功能部位,而α-螺旋在DNA結合基序中具有重要作用。杜仲有21個LOX蛋白以無規(guī)則卷曲所占比例較高為主要構成元件,α-螺旋所占比例次之,延伸鏈比例最低,其中以EUC19389-RA蛋白的無規(guī)則卷曲比例最高為60.31%。而EUC16930-RA和EUC24023-RA 2個LOX蛋白則以α-螺旋所占比例較高為主要構成元件,比例分別為47.29%和52.17%,其次無規(guī)則卷曲比例略低,分別為44.96%和35.87%,而延伸鏈比例最低。

    2.4 杜仲LOX基因家族的表達分析

    杜仲LOX基因家族在3個組織中的表達模式顯示,有6個LOX基因(EUC16892-RA、EUC16893-RA、EUC16929-RA、EUC16930-RA、EUC24023-RA和EUC26492-RA)在不同發(fā)育時期及各組織中的FPKM值為0或接近0,暗示這6個基因在杜仲皮、葉、果和種仁中均不表達,其余17個LOX基因表達具有組織和時空特異性。組織特異性表達規(guī)律顯示,這17個LOX基因表達模式可以分為3類,第Ⅰ類基因包含7個,在不同發(fā)育時期的果和葉中表達相對高,而在皮和種仁中表達相對較低;第Ⅱ類包含2個基因,在種仁中表達相對較高,其次在不同發(fā)育時期杜仲的皮、果有一定的表達量,而在不同發(fā)育時期的杜仲葉中表達相對較低;第Ⅲ類有8個基因,在杜仲皮中表達相對較高,在不同發(fā)育時期葉中有一定表達,在不同生長發(fā)育時期的果和種仁中表達相對較低,且第Ⅱ類和第Ⅲ類基因的表達更為相似。時空特異性表達規(guī)律顯示,杜仲9-LOX基因(EUC05484-RA)在5月20日的皮、4月18日的果、4月18日的葉及花后70天的種仁中表達量相對其它時期較高,可能在生長發(fā)育早期階段發(fā)揮重要作用;杜仲13-LOX基因在不同發(fā)育時期的組織中表達模式多樣,一些基因在生長初期和后期表達高于中期,如EUC18779在4月份和8月份的果和葉中表達高于其他時期;同時也存在后期生長發(fā)育階段表達高于前期的基因,如EUC16932在9月份皮、8月份果、葉及花后160天種仁中表達高于其他時期;也存在一些基因在各個發(fā)育時期的組織中表達量均相似,如EUC21473在4個組織的不同時期表達無明顯差異。表達譜聚類圖結果顯示定位于一條Scaffold的基因表達模式總體相似,說明串聯(lián)重復的基因可能具有相似的生理功能。

    圖4 杜仲LOX基因表達聚類分析Fig.4 Heat map of LOX gene expression obtained from RNA-seq in E.ulmoides

    3 討論

    通過全基因組分析,從杜仲中鑒定了23個LOX基因,13-LOX型家族成員22個,9-LOX型家族成員僅一個。其中一些13-LOX成員以基因簇形式分布,可能發(fā)生了復制,形成串聯(lián)重復?;驈椭圃诨蚣易暹M化過程中具有重要作用,可產(chǎn)生新基因并發(fā)生亞功能化或新功能化,以功能互補的方式分擔祖先基因的功能[18],串聯(lián)重復基因更易發(fā)生內(nèi)含子獲得,促進外顯子重組和基因進化[19]。杜仲表達譜聚類顯示其串聯(lián)重復基因在不同發(fā)育時期的各個組織器官中表達量雖有一定差異,但總體變化趨勢是相似的,表明杜仲的串聯(lián)重復基因在生理功能更可能發(fā)生了亞功能化,以功能互補的方式作用機體。

    前人研究顯示13-LOX及其衍生物更多參與茉莉酸、醛類、醇類物質(zhì)合成,在逆境脅迫防御過程中發(fā)揮作用[21],而9-LOX基因及其衍生物與植物生長發(fā)育[20]和抗菌[22]具有一定的相關性。Chauvin等發(fā)現(xiàn)擬南芥的13-LOX基因能夠促進JA的合成抵抗機械損傷脅迫[14]。孫炎鋒等發(fā)現(xiàn)13-LOX基因在擬南芥葉片衰老過程中也發(fā)揮重要生理作用[23]。此外,番茄的13-LOX類型(TomLOXC、TomLOXD和TomLOXF)與茉莉酸合成相關,其中TomLOXC和TomLOXD與機械損傷有關,具有抵抗生物和非生物脅迫作用,同時兩者也參與C6醛類揮發(fā)物合成以形成特殊風味;而番茄9-LOX基因(TomLOXA、TomLOXB和TomLOXE)則與果實成熟相關[15]。但研究發(fā)現(xiàn)擬南芥和小麥在感染病菌后其9-LOX基因通過調(diào)節(jié)水楊酸和茉莉酸信號傳導能力促進抗病[24]。

    杜仲的22個13-LOX基因,其中有18個基因與番茄的13-LOX基因(TomLOXC、TomLOXF)遺傳距離比較近,表明杜仲的13-LOX基因可能參與茉莉酸、醛類、醇類物質(zhì)的合成,或許與植物衰老、機械損傷等過程相關,暗示杜仲的13-LOX具有抵抗生物和非生物脅迫的潛在能力,同時13-LOX在不同組織中和不同發(fā)育時期表達特征存在多樣性,不同類型13-LOX基因在杜仲的特定生長發(fā)育階段具有高表達,這些基因可能以功能互補的方式在杜仲整個生長發(fā)育時期發(fā)揮生理作用。表達分析結果顯示杜仲9-LOX基因EU05485表達同樣具有組織特異性,且在組織發(fā)育前期表達較高,在生長后期表達量下降,但在發(fā)育后期是否作用減弱還需要試驗驗證。目前關于杜仲LOX基因家族的具體生理功能還需進一步的試驗驗證分析。

    猜你喜歡
    內(nèi)含子杜仲擬南芥
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    線粒體核糖體蛋白基因中內(nèi)含子序列間匹配特性分析
    不同方向內(nèi)含子對重組CHO細胞中神經(jīng)生長因子表達的影響
    更 正
    生物學通報(2019年1期)2019-02-15 16:33:43
    內(nèi)含子的特異性識別與選擇性剪切*
    HPLC法同時測定杜仲-當歸藥對中5種成分
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:14
    尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應機制探究
    略陽杜仲
    陜西畫報(2016年1期)2016-12-01 05:35:28
    一区二区三区国产精品乱码| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久久网色| 大型黄色视频在线免费观看| 成人av一区二区三区在线看| 成年人黄色毛片网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲精品久久久久5区| 90打野战视频偷拍视频| 久久中文字幕一级| 国产成人精品在线电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲成国产人片在线观看| 女警被强在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩大码丰满熟妇| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 99九九在线精品视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产片内射在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久99热这里只频精品6学生| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人免费观看mmmm| 无遮挡黄片免费观看| 国产xxxxx性猛交| 一区二区日韩欧美中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 黄色a级毛片大全视频| 黄色毛片三级朝国网站| 在线观看舔阴道视频| 757午夜福利合集在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人欧美| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线不卡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日本精品一区二区三区蜜桃| 日韩有码中文字幕| 咕卡用的链子| 久久狼人影院| 亚洲五月婷婷丁香| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲人成77777在线视频| 人人妻人人澡人人看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜视频精品福利| 国产精品av久久久久免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费观看a级毛片全部| 高潮久久久久久久久久久不卡| 超碰97精品在线观看| 日韩欧美三级三区| 久久午夜亚洲精品久久| 91精品国产国语对白视频| 亚洲 国产 在线| av有码第一页| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲成人免费av在线播放| 精品国产乱码久久久久久男人| 两人在一起打扑克的视频| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久av美女十八| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 午夜激情av网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 麻豆av在线久日| 久久久久精品国产欧美久久久| 久热爱精品视频在线9| 另类亚洲欧美激情| a级毛片在线看网站| 99久久精品国产亚洲精品| 一区在线观看完整版| 精品久久久久久电影网| 中文字幕色久视频| 成人三级做爰电影| 国产视频一区二区在线看| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美日韩一级在线毛片| 我要看黄色一级片免费的| 国产成人系列免费观看| 中国美女看黄片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日韩大码丰满熟妇| 在线观看免费高清a一片| 嫩草影视91久久| 俄罗斯特黄特色一大片| 黑人猛操日本美女一级片| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲第一青青草原| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 色老头精品视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 久久精品国产综合久久久| 无遮挡黄片免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 黄色怎么调成土黄色| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲av电影在线进入| 欧美黄色淫秽网站| 欧美成人午夜精品| 免费高清在线观看日韩| 男女高潮啪啪啪动态图| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产免费现黄频在线看| 日韩有码中文字幕| 91老司机精品| 国产精品影院久久| 黄色视频不卡| 999久久久精品免费观看国产| 久久久欧美国产精品| 交换朋友夫妻互换小说| 精品国内亚洲2022精品成人 | 日韩视频在线欧美| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男女午夜视频在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 大片免费播放器 马上看| 亚洲美女黄片视频| 成人手机av| 一级毛片精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 麻豆国产av国片精品| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣av一区二区av| 交换朋友夫妻互换小说| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 免费av中文字幕在线| 日本黄色视频三级网站网址 | 精品国产一区二区久久| av免费在线观看网站| 91精品三级在线观看| 极品人妻少妇av视频| 757午夜福利合集在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 高清毛片免费观看视频网站 | 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品国产高清国产av | 天天添夜夜摸| 久久久久国内视频| 国产深夜福利视频在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人国语在线视频| 脱女人内裤的视频| 另类精品久久| 无遮挡黄片免费观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 两性夫妻黄色片| 老司机福利观看| 高清欧美精品videossex| 成人av一区二区三区在线看| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利一区二区在线看| 久久中文字幕一级| 性少妇av在线| 中文字幕高清在线视频| 黄色 视频免费看| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久免费观看电影| 人人妻人人澡人人看| 欧美久久黑人一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 成人国产一区最新在线观看| 黄片小视频在线播放| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲成a人片在线一区二区| 99精品在免费线老司机午夜| 国产一区二区三区视频了| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久久国内视频| 日本av手机在线免费观看| av免费在线观看网站| 新久久久久国产一级毛片| 国产成人精品在线电影| 亚洲黑人精品在线| 操美女的视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| www.自偷自拍.com| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产国语露脸激情在线看| 中文字幕av电影在线播放| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品免费一区二区三区在线 | 韩国精品一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产成人aa在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av免费在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 午夜福利欧美成人| 久9热在线精品视频| 免费看光身美女| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产乱人伦免费视频| АⅤ资源中文在线天堂| 成人18禁在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色片一级片一级黄色片| 精品福利观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产av麻豆久久久久久久| 精品国产三级普通话版| 亚洲欧美激情综合另类| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文资源天堂在线| 亚洲熟妇熟女久久| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩欧美精品v在线| 一边摸一边抽搐一进一小说| 757午夜福利合集在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩精品青青久久久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 9191精品国产免费久久| 深夜精品福利| 黄色丝袜av网址大全| 神马国产精品三级电影在线观看| 久9热在线精品视频| 白带黄色成豆腐渣| а√天堂www在线а√下载| 国产精品电影一区二区三区| 午夜免费观看网址| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产成人系列免费观看| 成年人黄色毛片网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 免费观看的影片在线观看| 日韩国内少妇激情av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美在线黄色| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久中文字幕一级| 看片在线看免费视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产单亲对白刺激| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 两性夫妻黄色片| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲avbb在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美日韩一级在线毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 精品久久久久久久末码| 国产乱人伦免费视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲av成人av| 国产成人av激情在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲成人久久性| 久久精品91无色码中文字幕| 国语自产精品视频在线第100页| 中文字幕熟女人妻在线| 真人做人爱边吃奶动态| 床上黄色一级片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲国产看品久久| 又爽又黄无遮挡网站| 成人国产一区最新在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色播亚洲综合网| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲九九香蕉| 欧美日本视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99热精品在线国产| 国产高清视频在线观看网站| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品,欧美在线| 午夜成年电影在线免费观看| 最新中文字幕久久久久 | 午夜福利高清视频| 亚洲人成电影免费在线| 悠悠久久av| 青草久久国产| 国产午夜福利久久久久久| 午夜福利在线观看吧| 不卡av一区二区三区| 极品教师在线免费播放| 香蕉久久夜色| 99国产综合亚洲精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 岛国视频午夜一区免费看| 国产久久久一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲欧美激情综合另类| 免费看a级黄色片| 亚洲人与动物交配视频| 男人舔奶头视频| 日韩有码中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩欧美 国产精品| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲成人久久性| 香蕉国产在线看| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 日韩国内少妇激情av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 91av网站免费观看| 国产免费男女视频| 国产高清有码在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 狠狠狠狠99中文字幕| 99国产精品一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 波多野结衣巨乳人妻| 国产成人福利小说| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕av在线有码专区| 波多野结衣高清作品| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 色综合亚洲欧美另类图片| 色尼玛亚洲综合影院| 国产主播在线观看一区二区| svipshipincom国产片| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久久性生活片| 精品久久久久久,| 成年免费大片在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| www国产在线视频色| 午夜影院日韩av| 成人鲁丝片一二三区免费| 午夜影院日韩av| xxxwww97欧美| 男人舔奶头视频| 热99re8久久精品国产| 此物有八面人人有两片| 国产麻豆成人av免费视频| 国产高清视频在线播放一区| 无人区码免费观看不卡| 精品人妻1区二区| 国产美女午夜福利| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产激情久久老熟女| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜成年电影在线免费观看| 一进一出好大好爽视频| 两个人看的免费小视频| 久久香蕉国产精品| 亚洲无线观看免费| 久久久久久久精品吃奶| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美在线一区亚洲| 久久香蕉精品热| 亚洲成av人片免费观看| 在线观看66精品国产| 99国产综合亚洲精品| netflix在线观看网站| 久久久久久大精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩欧美国产在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲人成网站高清观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 看片在线看免费视频| 露出奶头的视频| 韩国av一区二区三区四区| 观看美女的网站| 亚洲最大成人中文| 中国美女看黄片| 欧美三级亚洲精品| 可以在线观看的亚洲视频| 成人国产一区最新在线观看| www国产在线视频色| 在线观看一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲中文日韩欧美视频| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲成av人片免费观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产男靠女视频免费网站| 久久草成人影院| 亚洲片人在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产一区二区激情短视频| 欧美高清成人免费视频www| 午夜亚洲福利在线播放| 一级黄色大片毛片| 成人av在线播放网站| 嫩草影视91久久| 国产成人欧美在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 99热精品在线国产| 十八禁网站免费在线| 真人做人爱边吃奶动态| 51午夜福利影视在线观看| 精品福利观看| 好男人在线观看高清免费视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| e午夜精品久久久久久久| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 丰满人妻一区二区三区视频av | 中文字幕高清在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 久久香蕉精品热| 在线观看日韩欧美| 成人三级黄色视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 视频区欧美日本亚洲| 特级一级黄色大片| www.www免费av| 999精品在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久久精品国产欧美久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 中国美女看黄片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 两人在一起打扑克的视频| 最新中文字幕久久久久 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲中文av在线| 搞女人的毛片| 久久久久国内视频| 男人舔奶头视频| 午夜福利成人在线免费观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 老鸭窝网址在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产97色在线日韩免费| 国产精品久久久久久精品电影| 精品国内亚洲2022精品成人| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲电影在线观看av| 精品无人区乱码1区二区| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕久久专区| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩中文字幕欧美一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 久久这里只有精品中国| 啦啦啦韩国在线观看视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 一个人看的www免费观看视频| 国产淫片久久久久久久久 | 又黄又粗又硬又大视频| 午夜免费激情av| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久电影中文字幕| 国产成人福利小说| 日韩精品中文字幕看吧| 香蕉国产在线看| 亚洲美女黄片视频| 欧美大码av| 亚洲av成人av| www日本在线高清视频| 最近最新免费中文字幕在线| 老熟妇仑乱视频hdxx| 婷婷丁香在线五月| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品亚洲美女久久久| 又大又爽又粗| 最好的美女福利视频网| 最近最新中文字幕大全电影3| 综合色av麻豆| 国产精品99久久99久久久不卡| 后天国语完整版免费观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美三级亚洲精品| 国产成人欧美在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产亚洲精品久久久com| 久久人人精品亚洲av| 最近最新中文字幕大全电影3| 听说在线观看完整版免费高清| av福利片在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产免费av片在线观看野外av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 性色av乱码一区二区三区2| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产成人欧美在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品电影一区二区在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品午夜福利视频在线观看一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久伊人香网站| 日韩欧美三级三区| 看免费av毛片| 久久久久久国产a免费观看| 黑人操中国人逼视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久精品国产综合久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲18禁久久av| 最新美女视频免费是黄的| 午夜免费观看网址| 中文字幕最新亚洲高清| 18禁国产床啪视频网站| 天堂影院成人在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 欧美大码av| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久国产精品人妻蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲在线观看片| 亚洲av成人av| 国产激情欧美一区二区| 国产av不卡久久| 成人一区二区视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 久久精品国产综合久久久| 日本免费a在线| 成人国产综合亚洲| 岛国在线免费视频观看| 精品福利观看| 后天国语完整版免费观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 色综合婷婷激情| 禁无遮挡网站| 亚洲国产看品久久| 亚洲av片天天在线观看| 毛片女人毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 在线观看午夜福利视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 窝窝影院91人妻| 国模一区二区三区四区视频 | 日韩有码中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 在线观看一区二区三区| 亚洲成av人片在线播放无| tocl精华| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产v大片淫在线免费观看| 成人特级av手机在线观看| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品av久久久久免费| 一区二区三区高清视频在线| 天堂影院成人在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 此物有八面人人有两片| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品 国内视频| 日韩成人在线观看一区二区三区|