• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    杜仲脂氧合酶基因家族全基因組鑒定及其表達特性研究

    2019-11-15 08:17:44朱利利杜慶鑫杜紅巖
    植物研究 2019年6期
    關鍵詞:內(nèi)含子杜仲擬南芥

    朱利利 慶 軍 杜慶鑫 何 鳳 杜紅巖*

    (1.中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心,鄭州 450003; 2.國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心,鄭州 450003)

    杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)的單科單屬植物,是第四紀冰川期后僅留存于我國的孑遺植物,具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值[1]。杜仲的皮、葉、果等器官中含有豐富的杜仲膠、黃酮、多酚、綠原酸等次生代謝物質(zhì)[2~4]。杜仲通過調(diào)節(jié)一系列代謝途徑激活防御系統(tǒng)保護其在多種環(huán)境條件下正常生長發(fā)育,其中茉莉酸、愈傷激素、脂肪酸氫過氧化物、醛類揮發(fā)物在植物的生長發(fā)育和防御過程中發(fā)揮重要作用,而這些物質(zhì)的生物合成過程受到脂氧合酶(Lipoxygenases,LOX)(EC:1.13.11.12)催化[5]。脂氧合酶(LOX)是一種含有非血紅素鐵的氧合酶,廣泛存在于真核和原核生物中,參與JA,醛類、醇類等芳香物質(zhì)的生物合成[6]。LOX在植物中以亞油酸、亞麻酸為底物,其9位或13位碳原子加氧生成脂氫過氧化物,根據(jù)加氧位置分為9-LOX和13-LOX[7]。LOX定位于植物不同亞細胞器,如黃瓜(Cucumissativus)的脂溶性LOX存在于胞槳和液泡中,而以跨膜蛋白形式存在的LOX定位于脂體膜和質(zhì)膜上[8],同時LOX也定位于葉綠體、微粒體、脂體等細胞器[9]。

    LOX是一個多基因家族,研究發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有6個LOX[10],葡萄(Vitisvinifera)中有18個LOX(有5個為假基因)[11],楊樹(Populustrichocarpa)中有21個LOX[12]。LOX是一種同工酶,植物的不同發(fā)育階段和脅迫條件可誘導相應特異LOX基因的表達。水稻(Oryzasativa)[13]、擬南芥[14]、番茄[15]等植物受到機械損傷時,其13-LOX基因特異表達誘導JA生物合成;煙草(Nicotianatabacum)受到病菌感染時,9-LOX類型基因活性增加[16];土豆(Solanumtuberosum)葉片接種真菌后,POTLX-3(9-LOX類型)表達量增加,但機械損傷對9-LOX基因沒有影響[17]。

    目前杜仲的基因組測序已完成,在全基因組水平上研究杜仲的LOX基因信息對探索杜仲的生長發(fā)育和抗脅迫能力提供參考。本研究利用生物信息學方法對杜仲的LOX基因家族進行鑒定和分類,同時結合杜仲的RNA-seq,分析LOX家族在杜仲不同發(fā)育時期、組織器官的表達譜,探索杜仲LOX基因家族功能。

    1 材料和方法

    1.1 數(shù)據(jù)來源及LOX基因家族鑒定和結構分析

    杜仲基因組測序數(shù)據(jù)、CDS序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息均來源于杜仲基因組數(shù)據(jù)(NCBI登錄號PRJNA357336、SRP095726及SRS2666014)。查閱國內(nèi)外文獻,下載已分類的5種植物的LOX氨基酸序列,水稻下載自水稻基因組(http://rice.plantbiology.msu.edu/)、擬南芥下載自TAIR(http://www.arabidopsis.org/),番茄下載自NCBI(登錄號TomLOXA(U09026)、TomLOXB(U09025)、TomLOXC(U37839)、TomLOXD(U37840)、TomLOXE(AY008278)和TomLOXF(FJ617476)),葡萄和楊樹的LOX氨基酸序列下載Phytozomev.11.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。

    LOX基因的結構域信息(PF00305)下載自Pfam數(shù)據(jù)庫,利用Hmmer 3.0軟件建立Profile HMM模型,并利用此模型檢索下載杜仲基因組數(shù)據(jù)中的蛋白質(zhì)序列,根據(jù)已得到的杜仲LOX基因家族序列建立新的HMM模型,用新的模型再次檢索杜仲蛋白質(zhì)序列,得到的序列被認為是候選蛋白質(zhì)序列,所有蛋白結構域經(jīng)過SMART(http://smart.embl/heidelberg.de/)驗證。利用GSDS在線工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)制作基因外顯子-內(nèi)含子結構圖。利用Plant-Ploc在線工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant/)、WOLFPSORT(http://wolfpsort.seq.cbrc.jp/)和Softberry(http://www.softberry.com/)預測亞細胞定位,綜合3個軟件預測結果進行分析。

    1.2 杜仲LOX氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹構建

    利用ClustalX2.0.12軟件對杜仲、擬南芥、番茄、葡萄、楊樹和水稻的LOX氨基酸序列進行多重序列比對。比對結果用軟件MEGA6.0的最大似然法(Maximum Likelihood)構建系統(tǒng)進化樹,抽樣次數(shù)為1000(bootstrap:1000 relications),其他為默認值。

    1.3 杜仲LOX蛋白質(zhì)結構預測

    使用在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)評估杜仲LOX蛋白的理論等電點、分子量、疏水性等理化性質(zhì),利用在線分析工具HNN Secondary StructurePrediction(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預測LOX蛋白的α-螺旋、延伸鏈等二級結構。

    1.4 杜仲LOX基因家族的表達分析

    通過下載不同發(fā)育時期的國家審定杜仲良種‘華仲6號’的葉片(4月18日、5月18日、6月17日、7月17日、8月16日及9月20日)、果實(采樣時間同葉片相同)和‘神農(nóng)架’樹皮(5月20日、7月20日及9月20日)的轉錄組數(shù)據(jù)獲得杜仲LOX基因的測序表達譜(FPKM值,fragments per kilobase of exon per million fragments mapped),數(shù)據(jù)來源于杜仲基因組RNA數(shù)據(jù),同時從NCBI網(wǎng)站SRA數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載‘華仲6號’花后70天和160天種仁的測序表達譜(登錄號分別是SRR3203265,70d;SRR3203241,160d)。去除在不同發(fā)育時期和組織中FPKM均小于1的基因,利用EXCELL對篩選的基因FPKM值進行l(wèi)og10(FPKM+1)轉換,對數(shù)轉換后的數(shù)據(jù)利用SPSS進行標準化,利用軟件Cluster 3.0和JAVA TreeView-1.1.6對標準化的表達數(shù)據(jù)聚類分析。

    2 結果與分析

    2.1 杜仲LOX基因家族的鑒定

    通過Hmmer 3.0搜索,杜仲基因組共鑒定出23個LOX基因家族成員(表1)。23個LOX基因分布于12條scaffolds,每條scaffold上分布的基因數(shù)量為1~5個,而多基因分布的scaffolds上的基因呈聚集形式分布,形成串聯(lián)重復,推測這些基因發(fā)生過復制事件。杜仲LOX基因內(nèi)含子數(shù)量分布范圍是0~6,有9個LOX基因不含內(nèi)含子,有4個基因含5個內(nèi)含子,有5個基因含6個內(nèi)含子,其他LOX基因分別含有1~2個內(nèi)含子,其中EU05484-RA的內(nèi)含子序列長度顯然長于其它LOX基因內(nèi)含子序列,內(nèi)含子具體分布位置如圖1所示。亞細胞定位預測結果顯示杜仲23個LOX基因有15個定位于細胞質(zhì),8個定位于葉綠體。

    表1 杜仲LOX基因家族信息

    圖1 杜仲LOX基因內(nèi)含子外顯子結構Fig.1 The intron-exon structures of LOX genes in E.ulmoide

    圖2 杜仲與其他植物LOX氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the amino acid sequences of LOX in E.ulmoides and other plants

    2.2 杜仲LOX氨基酸序列的聚類分析

    依據(jù)杜仲LOX家族氨基酸長度和序列結構特征差異等特點,運用ClustalX2.0.12和MEGA對杜仲LOX氨基酸序列和已進行分類和功能研究的水稻、擬南芥、番茄、楊樹、葡萄的LOX氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹。進化樹顯示杜仲的LOX編碼蛋白與番茄的LOX蛋白遺傳距離最近,其次與葡萄、楊樹和擬南芥的距離較近,而與水稻的LOX編碼蛋白距離最遠。杜仲23個LOX蛋白與其他5種植物的LOX蛋白分類結果相似,也可分為9-LOX蛋白和13-LOX蛋白兩個類型,其中僅有EUC05484-RA編碼蛋白屬于9-LOX,其余22個LOX蛋白均屬于13-LOX,杜仲的13-LOX蛋白家族成員數(shù)量占據(jù)明顯優(yōu)勢,說明杜仲的13-LOX家族成員在進化上產(chǎn)生了較多擴增事件。杜仲的22個13-LOX家族成員聚為2個分支,其中第一個分支由EUC09637-RA和EUC22336-RA組成,分別與葡萄的GSVIVT01010359001編碼蛋白和番茄的TomLOXD蛋白聚成一支,且較杜仲其他13-LOX家族成員與9-LOX類型聚類距離更近;杜仲其余20個13-LOX家族成員組成第二個分支,同時第二分支又繼續(xù)分為3個小支,其中有17個成員與番茄的TomLOXC和TomLOXF蛋白聚為第一個小支,而EUC19390-RA單獨與葡萄的GSVIVT01032029001編碼蛋白聚為第二小支,EUC23900-RA和EUC19389-RA與楊樹的Potri.009G022400.1蛋白聚為第三小支。杜仲的9-LOX家族唯一成員EUC05484-RA與葡萄的3個9-LOX蛋白聚在一起、遺傳距離較近。遺傳距離越近,表明蛋白結構和功能更為相似,暗示杜仲的LOX蛋白功能可能與番茄、葡萄和楊樹的特定LOX蛋白具有相似的生理作用。

    2.3 杜仲LOX基因家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

    利用Protparam在線工具分析杜仲LOX蛋白一級結構,表2顯示杜仲23個LOX基因家族成員中,EUC22336-RA編碼的氨基酸數(shù)量最多為968aa,EUC24023-RA編碼的氨基酸數(shù)量最少為92,同時結果表明杜仲LOX基因家族編碼氨基酸數(shù)目與其分子質(zhì)量整體呈正相關,23個LOX基因的氨基酸數(shù)量和分子質(zhì)量均具有差異。根據(jù)理論等電點氨基酸可以分為堿性氨基酸(Theoretical pI>7)和酸性氨基酸或中性氨基酸(Theoretical pI≦7);蛋白質(zhì)總平均疏水性正值表現(xiàn)疏水性、負值表現(xiàn)為親水性,且疏水值越大越疏水,值越小越親水。其中EUC05484-RA為9-LOX家族成員,編碼氨基酸數(shù)量為401,理論等電點是5.98,為酸性氨基酸,同時總平均疏水值為-0.312,為親水性氨基酸。其余13-LOX類型中包括6個堿性氨基酸和16個酸性氨基酸或中性氨基酸,22個LOX蛋白疏水值均為負值,表現(xiàn)為親水性。

    表2 杜仲LOX基因家族蛋白理化性質(zhì)分析

    HNN Secondary Stucture Prediction分析顯示α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲在杜仲整個LOX蛋白質(zhì)都有散布,其中無規(guī)則卷曲易受側鏈相互作用,經(jīng)常構成活性部位和功能部位,而α-螺旋在DNA結合基序中具有重要作用。杜仲有21個LOX蛋白以無規(guī)則卷曲所占比例較高為主要構成元件,α-螺旋所占比例次之,延伸鏈比例最低,其中以EUC19389-RA蛋白的無規(guī)則卷曲比例最高為60.31%。而EUC16930-RA和EUC24023-RA 2個LOX蛋白則以α-螺旋所占比例較高為主要構成元件,比例分別為47.29%和52.17%,其次無規(guī)則卷曲比例略低,分別為44.96%和35.87%,而延伸鏈比例最低。

    2.4 杜仲LOX基因家族的表達分析

    杜仲LOX基因家族在3個組織中的表達模式顯示,有6個LOX基因(EUC16892-RA、EUC16893-RA、EUC16929-RA、EUC16930-RA、EUC24023-RA和EUC26492-RA)在不同發(fā)育時期及各組織中的FPKM值為0或接近0,暗示這6個基因在杜仲皮、葉、果和種仁中均不表達,其余17個LOX基因表達具有組織和時空特異性。組織特異性表達規(guī)律顯示,這17個LOX基因表達模式可以分為3類,第Ⅰ類基因包含7個,在不同發(fā)育時期的果和葉中表達相對高,而在皮和種仁中表達相對較低;第Ⅱ類包含2個基因,在種仁中表達相對較高,其次在不同發(fā)育時期杜仲的皮、果有一定的表達量,而在不同發(fā)育時期的杜仲葉中表達相對較低;第Ⅲ類有8個基因,在杜仲皮中表達相對較高,在不同發(fā)育時期葉中有一定表達,在不同生長發(fā)育時期的果和種仁中表達相對較低,且第Ⅱ類和第Ⅲ類基因的表達更為相似。時空特異性表達規(guī)律顯示,杜仲9-LOX基因(EUC05484-RA)在5月20日的皮、4月18日的果、4月18日的葉及花后70天的種仁中表達量相對其它時期較高,可能在生長發(fā)育早期階段發(fā)揮重要作用;杜仲13-LOX基因在不同發(fā)育時期的組織中表達模式多樣,一些基因在生長初期和后期表達高于中期,如EUC18779在4月份和8月份的果和葉中表達高于其他時期;同時也存在后期生長發(fā)育階段表達高于前期的基因,如EUC16932在9月份皮、8月份果、葉及花后160天種仁中表達高于其他時期;也存在一些基因在各個發(fā)育時期的組織中表達量均相似,如EUC21473在4個組織的不同時期表達無明顯差異。表達譜聚類圖結果顯示定位于一條Scaffold的基因表達模式總體相似,說明串聯(lián)重復的基因可能具有相似的生理功能。

    圖4 杜仲LOX基因表達聚類分析Fig.4 Heat map of LOX gene expression obtained from RNA-seq in E.ulmoides

    3 討論

    通過全基因組分析,從杜仲中鑒定了23個LOX基因,13-LOX型家族成員22個,9-LOX型家族成員僅一個。其中一些13-LOX成員以基因簇形式分布,可能發(fā)生了復制,形成串聯(lián)重復?;驈椭圃诨蚣易暹M化過程中具有重要作用,可產(chǎn)生新基因并發(fā)生亞功能化或新功能化,以功能互補的方式分擔祖先基因的功能[18],串聯(lián)重復基因更易發(fā)生內(nèi)含子獲得,促進外顯子重組和基因進化[19]。杜仲表達譜聚類顯示其串聯(lián)重復基因在不同發(fā)育時期的各個組織器官中表達量雖有一定差異,但總體變化趨勢是相似的,表明杜仲的串聯(lián)重復基因在生理功能更可能發(fā)生了亞功能化,以功能互補的方式作用機體。

    前人研究顯示13-LOX及其衍生物更多參與茉莉酸、醛類、醇類物質(zhì)合成,在逆境脅迫防御過程中發(fā)揮作用[21],而9-LOX基因及其衍生物與植物生長發(fā)育[20]和抗菌[22]具有一定的相關性。Chauvin等發(fā)現(xiàn)擬南芥的13-LOX基因能夠促進JA的合成抵抗機械損傷脅迫[14]。孫炎鋒等發(fā)現(xiàn)13-LOX基因在擬南芥葉片衰老過程中也發(fā)揮重要生理作用[23]。此外,番茄的13-LOX類型(TomLOXC、TomLOXD和TomLOXF)與茉莉酸合成相關,其中TomLOXC和TomLOXD與機械損傷有關,具有抵抗生物和非生物脅迫作用,同時兩者也參與C6醛類揮發(fā)物合成以形成特殊風味;而番茄9-LOX基因(TomLOXA、TomLOXB和TomLOXE)則與果實成熟相關[15]。但研究發(fā)現(xiàn)擬南芥和小麥在感染病菌后其9-LOX基因通過調(diào)節(jié)水楊酸和茉莉酸信號傳導能力促進抗病[24]。

    杜仲的22個13-LOX基因,其中有18個基因與番茄的13-LOX基因(TomLOXC、TomLOXF)遺傳距離比較近,表明杜仲的13-LOX基因可能參與茉莉酸、醛類、醇類物質(zhì)的合成,或許與植物衰老、機械損傷等過程相關,暗示杜仲的13-LOX具有抵抗生物和非生物脅迫的潛在能力,同時13-LOX在不同組織中和不同發(fā)育時期表達特征存在多樣性,不同類型13-LOX基因在杜仲的特定生長發(fā)育階段具有高表達,這些基因可能以功能互補的方式在杜仲整個生長發(fā)育時期發(fā)揮生理作用。表達分析結果顯示杜仲9-LOX基因EU05485表達同樣具有組織特異性,且在組織發(fā)育前期表達較高,在生長后期表達量下降,但在發(fā)育后期是否作用減弱還需要試驗驗證。目前關于杜仲LOX基因家族的具體生理功能還需進一步的試驗驗證分析。

    猜你喜歡
    內(nèi)含子杜仲擬南芥
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    線粒體核糖體蛋白基因中內(nèi)含子序列間匹配特性分析
    不同方向內(nèi)含子對重組CHO細胞中神經(jīng)生長因子表達的影響
    更 正
    生物學通報(2019年1期)2019-02-15 16:33:43
    內(nèi)含子的特異性識別與選擇性剪切*
    HPLC法同時測定杜仲-當歸藥對中5種成分
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:14
    尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應機制探究
    略陽杜仲
    陜西畫報(2016年1期)2016-12-01 05:35:28
    欧美日韩精品成人综合77777| 寂寞人妻少妇视频99o| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产片特级美女逼逼视频| 一区二区三区乱码不卡18| 在线观看免费高清a一片| 色视频在线一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 男人舔女人的私密视频| 成人二区视频| 国产精品蜜桃在线观看| 婷婷成人精品国产| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 97精品久久久久久久久久精品| 一级黄片播放器| 青春草国产在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久久久久免费高清国产稀缺| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲综合精品二区| 亚洲国产最新在线播放| av卡一久久| 亚洲欧美一区二区三区久久| 精品少妇内射三级| 午夜91福利影院| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线免费观看不下载黄p国产| 人妻系列 视频| 久久久久久人人人人人| 18禁观看日本| 三级国产精品片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产老妇伦熟女老妇高清| 水蜜桃什么品种好| 超碰97精品在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 久久精品国产a三级三级三级| 日本91视频免费播放| 欧美在线黄色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲人成77777在线视频| 国产免费福利视频在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲精品,欧美精品| 欧美日韩一级在线毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 性少妇av在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级毛片电影观看| 国产精品女同一区二区软件| 丝袜美足系列| 五月天丁香电影| 一级a爱视频在线免费观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 如何舔出高潮| 午夜精品国产一区二区电影| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲三级黄色毛片| 黄片小视频在线播放| 国产熟女欧美一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品福利永久在线观看| av在线观看视频网站免费| 最黄视频免费看| 美女国产视频在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 9色porny在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 一本大道久久a久久精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 三级国产精品片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| av在线老鸭窝| 97人妻天天添夜夜摸| 中文字幕精品免费在线观看视频| 高清欧美精品videossex| 国产片特级美女逼逼视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| www.自偷自拍.com| 在线观看人妻少妇| 精品人妻在线不人妻| 熟女av电影| 免费高清在线观看日韩| 在线天堂最新版资源| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产黄色免费在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲国产欧美网| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久精品久久久久久久性| 中文字幕亚洲精品专区| videos熟女内射| 久久这里有精品视频免费| 伦精品一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 18在线观看网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美日韩视频精品一区| 人人妻人人澡人人看| 色哟哟·www| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 色婷婷久久久亚洲欧美| 丰满饥渴人妻一区二区三| av在线app专区| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产av精品麻豆| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲成国产人片在线观看| 搡老乐熟女国产| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一级黄片播放器| 97在线人人人人妻| 另类亚洲欧美激情| 久久精品人人爽人人爽视色| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜av观看不卡| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品国产亚洲| 超色免费av| 99热网站在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 韩国高清视频一区二区三区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产在线一区二区三区精| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 如何舔出高潮| 婷婷成人精品国产| 一级爰片在线观看| 九草在线视频观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产极品粉嫩免费观看在线| 97在线视频观看| 亚洲国产欧美网| 日韩一区二区三区影片| 国产乱人偷精品视频| 国产精品不卡视频一区二区| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人黄色视频免费在线看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 性色avwww在线观看| 青春草国产在线视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品.久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美bdsm另类| 免费av中文字幕在线| 久久午夜福利片| 少妇人妻精品综合一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人午夜福利电影在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 桃花免费在线播放| 人人澡人人妻人| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 久热这里只有精品99| 女人久久www免费人成看片| 黄频高清免费视频| 久久精品亚洲av国产电影网| kizo精华| 91精品三级在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产一区二区三区综合在线观看| 男女免费视频国产| 最新中文字幕久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品一二三区在线看| 国产色婷婷99| 国产探花极品一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日日撸夜夜添| 一区二区三区四区激情视频| 99热全是精品| 久久这里有精品视频免费| 国产免费现黄频在线看| 国产av精品麻豆| 制服诱惑二区| 欧美国产精品一级二级三级| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 成年女人在线观看亚洲视频| 最近中文字幕2019免费版| 香蕉国产在线看| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品久久久久久av不卡| 在线观看www视频免费| 午夜免费观看性视频| 午夜福利在线免费观看网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 日韩三级伦理在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老熟女久久久| 久久久久久久久久久免费av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产综合精华液| 国产精品一二三区在线看| 精品视频人人做人人爽| 国产av精品麻豆| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日日摸夜夜添夜夜爱| 999精品在线视频| 18禁国产床啪视频网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 日本wwww免费看| 青青草视频在线视频观看| 97精品久久久久久久久久精品| 国产成人精品一,二区| 夫妻性生交免费视频一级片| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品三级大全| 热99国产精品久久久久久7| 国产乱人偷精品视频| 国产精品一区二区在线观看99| 又大又黄又爽视频免费| 久久99热这里只频精品6学生| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久av网站| 中文欧美无线码| 欧美中文综合在线视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 黄色配什么色好看| 只有这里有精品99| 成人影院久久| 曰老女人黄片| 亚洲第一av免费看| 大话2 男鬼变身卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 老熟女久久久| 亚洲中文av在线| 看非洲黑人一级黄片| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| a级片在线免费高清观看视频| 视频在线观看一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 久久精品夜色国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 午夜91福利影院| 国产日韩欧美在线精品| 大香蕉久久网| 成人毛片a级毛片在线播放| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲国产精品一区三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人av在线免费| 国产成人91sexporn| 又黄又粗又硬又大视频| 国产免费又黄又爽又色| 视频在线观看一区二区三区| 精品少妇久久久久久888优播| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 99国产综合亚洲精品| 亚洲综合色网址| 久久久久精品性色| 成年动漫av网址| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久精品精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费大片黄手机在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品久久久久久av不卡| 成年av动漫网址| 国产有黄有色有爽视频| 一级片'在线观看视频| 免费日韩欧美在线观看| 欧美97在线视频| 人成视频在线观看免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 婷婷色av中文字幕| 黄色一级大片看看| 免费在线观看黄色视频的| 久久精品国产综合久久久| 久久久国产欧美日韩av| 成人毛片60女人毛片免费| 大香蕉久久成人网| 制服人妻中文乱码| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 在线观看一区二区三区激情| 人成视频在线观看免费观看| www.精华液| 亚洲成人一二三区av| 亚洲人成77777在线视频| 各种免费的搞黄视频| 老司机亚洲免费影院| a级片在线免费高清观看视频| 中文欧美无线码| 高清不卡的av网站| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成年美女黄网站色视频大全免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 最近的中文字幕免费完整| 另类亚洲欧美激情| 一区在线观看完整版| 久久午夜福利片| 日韩电影二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 搡老乐熟女国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲成色77777| 高清av免费在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 久久午夜综合久久蜜桃| 啦啦啦啦在线视频资源| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品久久蜜臀av无| a 毛片基地| 尾随美女入室| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产av一区二区精品久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产看品久久| 丝袜人妻中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| videos熟女内射| 午夜日本视频在线| 色视频在线一区二区三区| 日日啪夜夜爽| 在线看a的网站| 我的亚洲天堂| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费观看在线日韩| 国产精品免费大片| 蜜桃国产av成人99| 看十八女毛片水多多多| 欧美精品国产亚洲| 一区二区三区激情视频| 老司机影院毛片| 2018国产大陆天天弄谢| 免费看av在线观看网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲美女视频黄频| 不卡av一区二区三区| 国产午夜精品一二区理论片| 日本午夜av视频| 美国免费a级毛片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 男人操女人黄网站| 一本久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲国产精品999| 美女国产视频在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 美女国产视频在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 成人免费观看视频高清| 有码 亚洲区| 丝瓜视频免费看黄片| 1024视频免费在线观看| 午夜老司机福利剧场| 宅男免费午夜| 国产成人免费观看mmmm| 一二三四在线观看免费中文在| 91精品三级在线观看| 久久久久视频综合| 亚洲av综合色区一区| 久久99一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久亚洲中文字幕| 91国产中文字幕| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 考比视频在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲国产最新在线播放| 日本欧美视频一区| 天堂中文最新版在线下载| 丰满迷人的少妇在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品久久久精品久久久| 国产不卡av网站在线观看| 性少妇av在线| 国产亚洲一区二区精品| 国产有黄有色有爽视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品国产国语对白av| kizo精华| 精品午夜福利在线看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 9色porny在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩av久久| 国产精品一区二区在线观看99| 综合色丁香网| h视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 人成视频在线观看免费观看| 中文字幕av电影在线播放| 国产xxxxx性猛交| 一区二区av电影网| 免费看av在线观看网站| 国产精品 国内视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 秋霞在线观看毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲男人天堂网一区| 欧美另类一区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产男女内射视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人影院久久| av线在线观看网站| 香蕉国产在线看| 欧美精品亚洲一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 中文字幕av电影在线播放| 熟女av电影| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲国产成人一精品久久久| 只有这里有精品99| 亚洲一区中文字幕在线| 国产男女超爽视频在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成年动漫av网址| 桃花免费在线播放| 超碰97精品在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 精品少妇内射三级| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日本欧美视频一区| 久久这里只有精品19| 久久精品久久久久久久性| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲人成77777在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 久久av网站| 丰满乱子伦码专区| 精品一区二区三卡| 日韩大片免费观看网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产 精品1| 大话2 男鬼变身卡| 春色校园在线视频观看| 亚洲av电影在线进入| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产又色又爽无遮挡免| xxx大片免费视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产黄色免费在线视频| 女性被躁到高潮视频| 老司机影院毛片| 亚洲 欧美一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 久久久久国产一级毛片高清牌| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲美女视频黄频| 久久久久久人妻| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久女婷五月综合色啪小说| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲国产精品999| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 蜜桃在线观看..| 欧美少妇被猛烈插入视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| av片东京热男人的天堂| 九九爱精品视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| www.自偷自拍.com| 观看av在线不卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 电影成人av| 黄色视频在线播放观看不卡| 交换朋友夫妻互换小说| 在现免费观看毛片| 免费观看av网站的网址| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲成人av在线免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美日韩综合久久久久久| videossex国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 色播在线永久视频| 五月开心婷婷网| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产一区二区三区综合在线观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩av免费高清视频| 国产又爽黄色视频| 午夜激情久久久久久久| 美女午夜性视频免费| 日韩av免费高清视频| 日韩电影二区| 国产精品 欧美亚洲| 美女中出高潮动态图| 欧美中文综合在线视频| 精品视频人人做人人爽| 日韩av免费高清视频| 国产av一区二区精品久久| 黑人猛操日本美女一级片| 18+在线观看网站| 青青草视频在线视频观看| 捣出白浆h1v1| 亚洲色图综合在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 下体分泌物呈黄色| 日韩av不卡免费在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 青春草亚洲视频在线观看| 国产av一区二区精品久久| 国产亚洲最大av| 免费看不卡的av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 中文字幕制服av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄片播放在线免费| 在线天堂中文资源库| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久久久久久人人人人人人| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 99久国产av精品国产电影| 久久99一区二区三区| 久久久久精品性色| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 街头女战士在线观看网站| 国产精品蜜桃在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 成人国产av品久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 91成人精品电影| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩电影二区| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美人与善性xxx| 一区二区三区四区激情视频| 90打野战视频偷拍视频| av电影中文网址| 中文天堂在线官网| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人手机av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 美女国产视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 男女国产视频网站| 捣出白浆h1v1| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线天堂最新版资源| 在线 av 中文字幕| 午夜日本视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 日韩制服骚丝袜av| 青春草视频在线免费观看| 有码 亚洲区| 伦精品一区二区三区| 美女福利国产在线| 熟女电影av网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 超碰97精品在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久久久亚洲中文字幕| www.精华液| av国产久精品久网站免费入址|