白樺BpZFP4基因啟動子克隆和逆境響應(yīng)元件功能分析

秦琳琳 張 曦 姜 騁 李 莉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

植物的生長和發(fā)育會受到各種不利環(huán)境的影響，為了抵抗這些逆境，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了許多復(fù)雜的防御機(jī)制，這種防御機(jī)制往往是通過一系列感知和傳導(dǎo)逆境信號的分子來實(shí)現(xiàn)的，如轉(zhuǎn)錄因子、酶和離子通道等[1]。轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，能夠與基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程，在調(diào)控基因表達(dá)中起著重要作用[2]。鋅指蛋白是一類具有“手指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛的分布于人類和動植物中[3～4]。根據(jù)半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)殘基的數(shù)目和位置的不同可將鋅指轉(zhuǎn)錄因子分為C2H2、C8、C6、C3HC4(RING型)、C2HC、C2HC5(LIM型)、C4、C3H和C4HC3九個(gè)亞類，其中大部分鋅指蛋白屬于C2H2型[5]。

C2H2型鋅指蛋白在植物應(yīng)答生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻C2H2型鋅指蛋白基因ZFP245受高鹽、低溫和干旱的誘導(dǎo)，過表達(dá)ZFP245能夠顯著提高煙草的耐鹽性[7]。水稻ZFP182在低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫下表達(dá)量顯著提高，過表達(dá)ZFP182的水稻植株在沒有顯著改變植株株型的同時(shí)提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性[8]。Cheuk and Houde[9]等研究了53個(gè)小麥C2H2型鋅指蛋白基因在不同脅迫條件下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)有44個(gè)基因?qū)?qiáng)光、37個(gè)基因?qū)Ω珊得{迫、31個(gè)基因?qū)λ疂钞a(chǎn)生應(yīng)答，其中有16個(gè)基因能夠響應(yīng)所有實(shí)驗(yàn)脅迫條件，表明這些TaZFPs在小麥耐受非生物脅迫中具有重要的作用。對毛果楊109個(gè)C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因的啟動子區(qū)域包含有光響應(yīng)元件或者非生物脅迫響應(yīng)元件，RT-PCR分析結(jié)果表明這些基因在高鹽、干旱和高溫的脅迫下表達(dá)量顯著增加[10]。這些脅迫相關(guān)元件的大量存在，預(yù)示著這些基因可能受脅迫響應(yīng)蛋白的調(diào)控，進(jìn)而在諸多逆境脅迫及生理過程中其重要作用。

本課題組應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)對白樺在鹽、干旱脅迫下的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因BpZFP4(GenBank Accession number:KU234173.1)在鹽、干旱脅迫處理下表達(dá)顯著增強(qiáng)[11]，為了進(jìn)一步研究該基因啟動子的功能，本研究首先通過染色體步移技術(shù)克隆獲得BpZFP4基因啟動子片段，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中包含許多與逆境響應(yīng)和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，推測該啟動子受干旱、鹽等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，為此我們通過5′端一系列缺失突變分析了啟動子序列響應(yīng)干旱(滲透脅迫)、鹽脅迫以及植物激素ABA的主要調(diào)節(jié)區(qū)域及可能的順式作用元件，為進(jìn)一步探究BpZFP4基因?qū)Ω珊怠⒏啕}以及ABA脅迫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用于提取植物基因組DNA的白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)無性系組培苗和遺傳轉(zhuǎn)化受體植物煙草(Nicotianabenthamiana)以及pCAMBIA 1301載體由本課題組保存。無縫克隆ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit購自Vazyme。Genome Walking Kit、Ex Taq Polymerase、dNTPs Mixture以及DNA Marker均購自TaKaRa。膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)，質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega。XbaⅠ、BglⅡ、T4DNA聚合酶以及T4-DNA連接酶購自Promega，大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。GUS組織化學(xué)染色底物X-Gluc和GUS酶活測定所用4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide購自Sigma公司。

1.2 白樺BpZFP4基因啟動子的克隆

按照BioTeke公司“新型快速植物基因組DNA提取試劑盒”的操作流程，以白樺無性系葉片為材料提取基因組DNA。采用染色體步移技術(shù)(TaKaRa Genome Walking Kit)，根據(jù)白樺BpZFP4基因5′端序列信息，設(shè)計(jì)三條特異性引物SP1:5′-GGTGTCAAGTTCAAGTCCAAGCACA-3′，SP2:5′-CCACAGATTGAGCACTCATGCATCT-3′，SP3:5′-GTCGGTCGTGTTTAGCACATGAGA-3′，與試劑盒中隨機(jī)引物AP1、AP2、AP3和AP4組合進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參照試劑盒說明書，經(jīng)三次巢式PCR反應(yīng)得到一段BpZFP4的CDS5′端側(cè)翼序列。根據(jù)已獲取的片段的5′端側(cè)翼序列，繼續(xù)設(shè)計(jì)三條特異引物，分別為SP4:5′-GGAAAGGCAATTGGGAAGTTGGGTA-3′，SP5:5′-CAGAGGTACGGAATATGAACGAGGA-3′，SP6:5′-GGAAGGATCCGATGACGCTCATA-3′進(jìn)行第二次染色體步移。用BioEdit軟件將通過兩次染色體步移擴(kuò)增的兩條片段拼接成為BpZFP4基因啟動子片段。

1.3 BpZFP4基因啟動子順式作用元件預(yù)測

將克隆獲得的BpZFP4基因的啟動子序列提交到New PLACE[12](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE[13](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測分析。

1.4 BpZFP4基因啟動子5′-缺失片段融合GUS基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit(Vazyme)使用說明設(shè)計(jì)PCR引物，其中在正反向引物中分別引入XbaⅠ和BglⅡ酶切位點(diǎn)以及線性化載體兩末端的同源序列(表1)。以攜帶BpZFP4全長啟動子的T載體質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：10×Ex PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL，10 mmol·L-1上下游引物各0.5 μL，100 ng DNA，2 U·μL-1Ex Taq DNA Polymerase 0.1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s,58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。將不同片段PCR產(chǎn)物膠回收，酶切驗(yàn)證并與去除CaMV35S啟動子的pCAMBIA1301載體片段進(jìn)行重組反應(yīng)。

表1BpZFP4啟動子5′缺失片段與GUS基因融合所用引物序列

Table 1 A list of primers used to construct different deletions of theBpZFP4 promoter::GUSexpression vector

引物名稱Primer引物序列Sequence(5′—3′)pZF-1360-FGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTGCGAACAGTCGCACTATGpZF-1096-FGGTACCCGGGGATCCTCTAGAAACGCAGGATAGTGCAACTTTTApZF-682-FGGTACCCGGGGATCCTCTAGACATTGTAAGTTTTTAGTAATTTGpZF-396-FGGTACCCGGGGATCCTCTAGAACACAAAGAGAACCTGAATApZF-RTAGAAATTTACCCTCAGATCTCATGGCTACGTTAATGGACG1301-GUS-FTGTTGTGTGGAATTGTGAGC1301-GUS-RGGGTCCTAACCAAGAAAATG

將含有CaMV35S啟動子的pCAMBIA1301載體作為陽性對照；以去除CaMV35S啟動子的pCAMBIA1301載體作為陰性對照，其構(gòu)建方法是采用XbaⅠ和BglⅡ雙酶切pCAMBIA1301載體質(zhì)粒以去除CaMV 35S啟動子，用T4DNA聚合酶將線性化載體的5′突出末端補(bǔ)平后，使用T4DNA連接酶將平末端載體相連。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草參照Yang等[14]。方法如下：將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，把經(jīng)測序比對正確的重組質(zhì)粒通過液氮凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，在含有50 mg·L-1Kan的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，5 000 r·min-1常溫離心10 min收集菌體，用滲透液MMA[10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 mmol·L-1乙酰丁香酮，pH=5.7]重懸，室溫靜置3 h，分別將陽性對照、陰性對照和含有重組載體的農(nóng)桿菌滲透緩沖液注射到6周齡、長勢接近的煙草植株葉片中，浸染后的植株在16 h/8 h光照/黑暗和25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h時(shí)，用直徑為1 cm的葉片打孔器制備煙草葉盤，并立即進(jìn)行逆境脅迫處理。

1.6 非生物脅迫處理煙草葉盤的GUS組織化學(xué)染色分析

分別將葉盤懸浮在含有200 mmol·L-1NaCl、18% PEG6000、100 mmol·L-1ABA的1/2MS液體培養(yǎng)基中處理24 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，未做脅迫處理組作對照。

按照J(rèn)efferson[15]等的方法,對材料進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析,將材料浸泡于GUS染液中，染液包含0.1 mol·L-1K4Fe(CN)6、0.1 mol·L-1K3Fe(CN)6、50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、10 mmol·L-1Na2EDTA、0.001%(V/V) Triton X-100、0.5 mg·mL-1X-Gluc和20%甲醇。37℃保溫過夜，用脫色液(無水乙醇∶冰乙酸=3∶1)脫色，觀察葉盤上深藍(lán)色分布情況和顏色深淺，并拍照保存。

1.7 非生物脅迫處理煙草葉盤的GUS活性定量分析

剪取100 mg處理后的煙草葉盤加入3倍體積的GUS提取緩沖液[50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液(pH7.0),10 mmol·L-1EDTA(pH8.0),0.1% Triton X-100,0.1%(w/v)SDS和0.1% β-巰基乙醇]，研磨成勻漿，于12 000 r·min-1，4℃離心10 min，收集上清4℃保存?zhèn)溆?。利用TAKARA Bradford protein assay kit測定總蛋白含量，使用Infinie200 PRO多功能酶標(biāo)儀測定樣品的熒光強(qiáng)度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，測定結(jié)果利用Origin 8.0作圖軟件繪制圖形。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpZFP4基因啟動子的克隆

以白樺基因組DNA為模板,采用染色體步移技術(shù)經(jīng)過三輪PCR擴(kuò)增獲得一條長度約為900 bp的片段(圖1a),將該產(chǎn)物膠回收純化,連接至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用載體通用引物M13-47和RV-M對菌液進(jìn)行PCR鑒定，選擇陽性單克隆測序。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)該片段3′端的99個(gè)堿基與BpZFP4基因的CDS起始序列(1～99 bp)完全一致，說明分離到的片段是BpZFP4基因的啟動子序列。

圖1 BpZFP4啟動子片段的克隆 a～b.第一次和第二次染色體步移擴(kuò)增產(chǎn)物(M.DNA Marker DL2000；1～3.第1、2及3三輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物Fig.1 Cloning of the BpZFP4 promoter fragment by Genome Walking a-b.1st and 2nd amplification by genome walking(M.DNA Marker DL2000; 1-3.The 1st, 2nd and 3rd Nested PCR amplification products

根據(jù)第一次染色體步移獲取的片段序列信息，設(shè)計(jì)第二次染色體步移的特異性引物，經(jīng)三輪PCR擴(kuò)增獲得長度約為750 bp的側(cè)翼序列(圖1b)。將兩次獲得的片段序列拼接，根據(jù)其兩端序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物按照如上所述方法連接、轉(zhuǎn)化及測序驗(yàn)證，序列分析表明，該序列長度為1 360 bp。

2.2 BpZFP4基因啟動子順式作用元件預(yù)測分析

利用New PLACE和PlantCARE在線分析軟件預(yù)測BpZFP4啟動子上順式作用元件，結(jié)果顯示該啟動子含有14個(gè)TATA box和18個(gè)CAAT box啟動子核心元件，除此以外，在啟動子序列多個(gè)區(qū)域分布有多種與BpZFP4誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件，它們是6種光響應(yīng)相關(guān)元件，包括AT1-motif、Box4、G-Box、IBOXCORE、INRNTPSADB、TCT-motif；14種激素響應(yīng)相關(guān)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、生長素和水楊酸響應(yīng)元件As-1、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和WBOXATNPR1、MeJA響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif、乙烯響應(yīng)元件ERE、光及水楊酸響應(yīng)元件GT1CONSENSUS、赤霉素及ABA響應(yīng)元件PYRIMIDINEBOXHVEPB1、赤霉素響應(yīng)元件GARE2OSREP1、GAREAT、MYBGAHV、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A和WRKY71OS；15種與防御和逆境響應(yīng)相關(guān)元件包括低溫誘導(dǎo)響應(yīng)LTR、鹽和病原物響應(yīng)元件GT1GMSCAM4、厭氧誘導(dǎo)必須的順式調(diào)控元件ARE、缺氧特殊誘導(dǎo)類似的增強(qiáng)順式作用元件GT-motif、脫水脅迫響應(yīng)元件ACGTATERD1、MYB1AT、MYBCORE和MYCCONSENSUSAT、抗病響應(yīng)元件BIHD1OS、損傷響應(yīng)元件WBOXNTERF3以及參與防御和脅迫反應(yīng)的順式作用元件CACGTG motif、TC-rich repeats、DOFCOREZM、As-1和SEBFCONSSTPR10A等(表2)。這些元件的存在，表明BpZFP4基因的表達(dá)可能被識別這些元件的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控，從而在植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素信號分子的刺激以及逆境脅迫等過程中發(fā)揮作用。

2.3 BpZFP4啟動子元件缺失突變分析

為了分析非生物脅迫和ABA響應(yīng)相關(guān)元件在BpZFP4啟動子中的作用，尋找存在的關(guān)鍵功能區(qū)域，根據(jù)順式作用元件的功能及分布區(qū)域?qū)幼臃殖伤亩尾煌L度的缺失片段(圖2a)，分別命名為pZF-1360，pZF-1096，pZF-682，pZF-396，其中數(shù)字代表該片段相對于翻譯起始位點(diǎn)的位置(ATG中的A為+1)(表1)。以上述啟動子缺失片段定向替換植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上GUS基因前的CaMV35S啟動子片段，構(gòu)建獲得含有啟動子不同缺失長度片段融合GUS報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)載體，其構(gòu)建策略如圖2b所示。

2.4 BpZFP4啟動子5′-缺失片段的表達(dá)載體構(gòu)建

以攜帶BpZFP4全長啟動子的T載體質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得四條不同長度的啟動子缺失目的條帶，與預(yù)期大小一致(圖3a)，將其純化回收進(jìn)行XbaⅠ和BglⅡ雙酶切，與pCAMBIA1301載體片段進(jìn)行重組反應(yīng)，新的重組質(zhì)粒利用載體序列引物1301-GUS-F或1301-GUS-R(表1)與缺失片段擴(kuò)增引物經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證(圖3b)，證明四條啟動子缺失片段已克隆到pCAMBIA1301載體上。采用液氮凍融法，分別將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌落PCR鑒定,獲得陽性克隆,完成工程菌制備。

表2 BpZFP4啟動子順式作用元件功能預(yù)測

注：堿基序列:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

Note:Base sequence:R=G/A,W=A/T,N=A/T/C/G

圖2 BpZFP4啟動子5′-缺失突變分析 a.BpZFP4啟動子主要干旱、鹽、ABA響應(yīng)相關(guān)元件分布示意圖；b.BpZFP4基因啟動子缺失片段與GUS基因融合示意圖Fig.2 Deletion analysis of the BpZFP4 gene promoter in transgenic tobacco plants a. Nucleotide sequence and distribution map of cis-acting elements of the main cis-elements in BpZFP4 promoter; b. Schematic representation of BpZFP4 promoter::GUS vector constructs

圖3 BpZFP4啟動子融合GUS重組載體構(gòu)建 a.BpZFP4不同長度啟動子缺失片段PCR產(chǎn)物(M. DNA Marker DL2000；2～5. pZF-1360,pZF-1098,pZF-682,pZF-396)；b.BpZFP4啟動子不同片段的重組質(zhì)粒交叉PCR驗(yàn)證(M. DNA Marker DL2000；2～5.四條不同長度缺失片段重組質(zhì)粒交叉PCR產(chǎn)物)Fig.3 PCR amplification of BpZFP4 full length promoter a. (M.DL2000 DNA Marker; 2-5. pZF-1360,pZF-1098,pZF-682,pZF-396)； b.The four different length recombinant vectors were verified by plasmid PCR(M.DL2000 DNA Marker; 2-5.BpZFP4 four different length promoter fragment)

圖4 BpZFP4啟動子不同缺失片段對非生物脅迫和激素脅迫響應(yīng)分析 A. 18%(w/v) PEG 6000,200 mmol·L-1 NaCl 和100 mmol·L-1 ABA脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉盤GUS組織化學(xué)染色分析；B. 18%(w/v) PEG 6000,200 mmol·L-1 NaCl和100 mmol·L-1 ABA脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草GUS活性染色分析，所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)。Fig.4 Analysis of BpZFP4 promoter deletion constructs in tobacco plants under drought,salt and ABA treatments A. GUS histochemical staining of four deletions constructs in tobacco plants under 18%(w/v) PEG6000,200 mmol·L-1 NaCl and 100 mmol·L-1 ABA treatments; B. GUS activity of different deletion constructs in tobacco plants under 18%(w/v) PEG6000(a),200 mmol·L-1 NaCl(b) and 100 mmol·L-1 ABA(c) treatments(Values represent the means±SD from three repeats)

2.5 BpZFP4啟動子不同缺失片段對非生物脅迫和激素脅迫響應(yīng)分析

利用注射法分別將含有BpZFP4啟動子5′缺失片段重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌浸染煙草葉片，以帶有CaMV35S的pCAMBIA1301載體質(zhì)粒作為陽性對照；并以去除35S啟動子片段的pCAMBIA1301載體質(zhì)粒作為陰性對照，對浸染后的葉盤分別進(jìn)行200 mmol·L-1NaCl、18% PEG6000及100 mmol·L-1ABA脅迫處理，以未脅迫處理的葉片為對照組。

GUS組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示(圖4A)，陰性對照的煙草葉盤未被染上藍(lán)色，而陽性對照的葉盤被染成了明顯的深藍(lán)色。在經(jīng)過PEG脅迫處理的啟動子系列缺失表達(dá)實(shí)驗(yàn)組中，轉(zhuǎn)入pZF-1360、pZF-396載體質(zhì)粒的葉盤在未做脅迫處理下染色較淺，而將浸染后的葉片用PEG處理24h后，染色效果明顯加深，說明pZF-1360和pZF-396片段在干旱脅迫條件下能夠顯著誘導(dǎo)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。觀察受NaCl處理的啟動子缺失片段的GUS染色結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入pZF-396缺失結(jié)構(gòu)的葉盤在脅迫前后染色結(jié)果沒有明顯的區(qū)別，而轉(zhuǎn)pZF-1360、pZF-1096和pZF-682質(zhì)粒的葉盤均被染成藍(lán)色，且染色比未做脅迫處理的葉盤更深，表明這三個(gè)啟動子缺失片段均響應(yīng)鹽脅迫，驅(qū)動GUS基因在植株中的表達(dá)。在ABA處理后，轉(zhuǎn)入pZF-1096和pZF-396質(zhì)粒的葉盤染色比對照深，說明GUS的表達(dá)受到ABA脅迫的誘導(dǎo)，而轉(zhuǎn)入pZF-1360和pZF-682片段卻沒有表現(xiàn)出這種誘導(dǎo)效果。

通過以上GUS組織化學(xué)染色，我們初步明確了BpZFP4啟動子受干旱、鹽及ABA脅迫誘導(dǎo)，屬于逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動子。為了進(jìn)一步明確該啟動子中與逆境響應(yīng)相關(guān)的區(qū)域，在進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析的同時(shí)，我們對不同長度5′端缺失啟動子片段的轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行了三種脅迫處理和GUS酶活性測定，結(jié)果如圖4B所示，在PEG脅迫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)入pZF-1360和pZF-396片段的葉盤中GUS酶活性均有顯著的提高，分別是未脅迫處理葉盤中GUS酶活的11.44和6.05倍，而轉(zhuǎn)入pZF-1096和pZF-682片段的葉片中在誘導(dǎo)前后的酶活性無明顯變化(圖4B:a)，這與上述的染色結(jié)果相一致。綜合染色和酶活分析的結(jié)果可以看出，啟動子的-1 360～-1 096 bp和-396～-1 bp區(qū)域具有明顯的干旱誘導(dǎo)特性，進(jìn)一步結(jié)合順式作用元件的分布位置分析，發(fā)現(xiàn)在-1 360～-1 096 bp區(qū)域中存在MYB1AT和MYCCONSENSUSAT以及在-396～-1 bp區(qū)域中含有ACGTATERD1，ABRELATERD1和MYCCONSENSUSAT等與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件。雖然-1 096～-396 bp區(qū)域中也同樣存在MYB1AT，MYBCORE和MYCCONSENSUSAT等干旱響應(yīng)相關(guān)元件，但是GUS活性增加不明顯，說明在該區(qū)域可能存在有負(fù)調(diào)控元件。用同樣的方法我們對BpZFP4基因啟動子片段在NaCl脅迫下的GUS酶活進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在未脅迫情況下，轉(zhuǎn)入四個(gè)缺失片段的葉盤中GUS酶活均約為1左右，而在NaCl脅迫之后，轉(zhuǎn)pZF-1360，pZF-1096和pZF-682的GUS酶活比正常情況下分別上升了8.30，8.09和6.18倍，而轉(zhuǎn)pZF-396片段的GUS酶活與正常情況下沒有顯著的差異(圖4B:b)。這可能是由于位于-396～-682 bp和-682～-1 096 bp區(qū)域的GT1CONSENSUS和GT1GMSCAM4兩個(gè)順式作用元件響應(yīng)了鹽脅迫，使GUS表達(dá)量明顯增加。在-1 096～-1 360 bp區(qū)域內(nèi)雖然并不包含有鹽響應(yīng)相關(guān)元件，但可能存在并未明確功能的順式作用元件，所以pZF-1360片段也響應(yīng)了鹽脅迫。在ABA脅迫處理的實(shí)驗(yàn)組中，轉(zhuǎn)入pZF-1096和pZF-396片段的葉盤中受到ABA誘導(dǎo)后GUS酶活明顯地增強(qiáng)，分別是對照組的7.3和6.19倍，而轉(zhuǎn)pZF-1360和pZF-682片段與對照組沒有明顯變化(圖4B:c)。序列分析發(fā)現(xiàn)在-396～-1區(qū)域有三個(gè)ABRE元件，它們可能參與了ABA脅迫的響應(yīng)。

3 討論

啟動子是一段能與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生特異性結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列，位于基因的上游[16]。啟動子中包含的順式作用元件可以與反式作用因子相互作用，使生物能根據(jù)需要或環(huán)境的改變，在特定的時(shí)間與位置表達(dá)目的基因。根據(jù)啟動子的作用方式和功能的不同，可將其分為3種類型：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異型啟動子[17～18]。組成型啟動子可使目的基因在轉(zhuǎn)基因植物中非組織特異性和非誘導(dǎo)性高水平表達(dá)，具穩(wěn)定性和持續(xù)性。如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子[19]，而誘導(dǎo)型啟動子可以根據(jù)需要在植物體特定發(fā)育階段和組織器官中通過外界信號誘導(dǎo)目的基因表達(dá)[20]，如泛素核糖體蛋白融合基因ubi3啟動子在受到損傷后才能啟動下游基因表達(dá)[21]；組織特異性啟動子可以調(diào)控基因只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育上的時(shí)空特異性。如白樺4CL基因啟動子調(diào)控GUS基因在莖中表達(dá)；小黑楊I(lǐng)CE1基因啟動子調(diào)控GUS基因在花和根中表達(dá)；而花生AhNCED1基因啟動子調(diào)控GUS基因在葉片中表達(dá)[22～24]。近年來，隨著對植物轉(zhuǎn)基因研究的深入，對轉(zhuǎn)基因植物生物安全性要求的提高，使用誘導(dǎo)型啟動子和組織特異型啟動子培育抗逆作物新品種在很多情況下成為最佳選擇。

本研究利用染色體步移技術(shù)，成功克隆獲得白樺BpZFP4基因啟動子片段，進(jìn)一步以生物信息學(xué)預(yù)測分析和GUS報(bào)告基因在煙草中瞬時(shí)表達(dá)的手段對BpZFP4基因啟動子響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件及其所在區(qū)域和功能進(jìn)行了分析。揭示了-1 360～-1 096 bp和-396～-1 bp區(qū)域?yàn)楦珊嫡T導(dǎo)響應(yīng)的正調(diào)控區(qū)，在該區(qū)域中發(fā)現(xiàn)有MYB1AT、MYCCONSENSUSAT等與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件。這與Abe等關(guān)于擬南芥干旱響應(yīng)基因rd22啟動子中MYB1AT和MYCCONSENSUSAT元件能夠被MYB或MYC識別，增強(qiáng)了靶基因在干旱和ABA脅迫下表達(dá)的結(jié)果一致[25～26]。MYCCONSENSUSAT還是低溫脅迫基因的識別位點(diǎn)，擬南芥CBF/DREB1和玉米ZmCBF3基因的轉(zhuǎn)錄是通過ICE1識別該位點(diǎn)起始的[27～28]，預(yù)示了BpZFP4對脅迫響應(yīng)的多樣性。此外，在高鹽響應(yīng)的正調(diào)控區(qū)-1 360～-396 bp中，存在有6個(gè)GT1GMSCAM4元件。前人在對大豆SCaM-4[29]、豌豆PsSEOF1[30]、甜瓜CmLOX08[31]等基因啟動子逆境響應(yīng)元件及其功能分析中報(bào)道，GT1GMSCAM4元件在鹽脅迫條件下能夠顯著誘導(dǎo)GUS報(bào)告基因的表達(dá)。因此GT1GMSCAM4可能對BpZFP4基因在鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用。

ABA是一種重要的逆境植物激素，在許多逆境下能夠增加積累,并通過整合多種脅迫信號，調(diào)控下游應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)[32]。植物對脅迫信號應(yīng)答的途徑分為依賴于ABA和不依賴于ABA受體兩種類型[33],轉(zhuǎn)錄因子通過不同的ABREs、DRE/CRTs或者M(jìn)YB和MYC識別motifs激活應(yīng)激反應(yīng)[26,34]。BpZFP4基因啟動子的pZF-1096和pZF-396片段響應(yīng)ABA脅迫，GUS基因的表達(dá)獲得顯著增強(qiáng)，分析發(fā)現(xiàn)，在-396～-1區(qū)域分布有三個(gè)ABRE元件。根據(jù)這些分析結(jié)果，我們可以推測BpZFP4啟動子中的ABREs元件可能在響應(yīng)外源ABA處理中發(fā)揮作用，但是BpZFP4基因是否通過依賴ABA途徑對非生物脅迫作出響應(yīng)還需要進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)BpZFP4啟動子序列中含有多個(gè)干旱、高鹽及ABA響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，其中一些元件對啟動子受逆境脅迫和激素的誘導(dǎo)起著重要的作用，這對進(jìn)一步深入地了解逆境脅迫下白樺BpZFP4基因的表達(dá)調(diào)控和指導(dǎo)林木轉(zhuǎn)基因育種提供了新的依據(jù)。