高效液相色譜法同時測定地黃滋腎合劑中3種有效成分的含量

郭社民 趙永旗 韓石蕊 張 峰

地黃滋腎合劑(豫藥制字Z20120908)為結(jié)合中醫(yī)臨床應(yīng)用研制的復(fù)方中藥制劑，主要由生地黃、牡丹皮、茯苓皮、石韋、益母草、黃芪、丹參、醋龜甲、酒萸肉、鹽澤瀉、鹽知母等組成，具有滋補肝腎、清熱涼血、利水消腫、益氣活血的功效，主治肝腎陰虛、氣虛水濕失運所致形體消痩、頭昏目眩、陰虛發(fā)熱、虛煩不寐、口干舌紅、少苔、面浮身腫、小便不利或赤少，用于以尿蛋白長期不退、高血壓、水腫等為主要臨床特征的腎病綜合癥及慢性腎炎浮腫。處方中主藥酒萸肉所含有效成分為莫諾苷、馬錢苷。莫諾苷具有健胃、預(yù)防糖尿病性血管病的作用，馬錢苷具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎及抗休克作用[1]；主藥牡丹皮所含有效成分丹皮酚具有保肝護腎、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、降溫、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙、降血糖、增強免疫力等多種藥理作用[2～4]。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項，為更好地控制制劑質(zhì)量，保證臨床療效。參考有關(guān)文獻[5～11]建立了高效液相色譜法同時測定地黃滋腎合劑中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205DU型電子分析天平(瑞士mettler公司)；UVIKONxl 型紫外分光光度計(法國塞克曼公司)。

1.2 材料莫諾苷對照品(批號：111998-201602，含量：96.3%)、馬錢苷對照品(批號：111640-201707，含量：99.2%)、丹皮酚對照品(批號：110708-201801，含量：99.9%)均購于中國食品藥品檢定研究院；地黃滋腎合劑(批號分別為：180923、181017、181125)及陰性樣品均由濮陽市人民醫(yī)院制劑室提供；甲醇、乙腈為色譜純，其他均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )；以乙腈為流動相A, 以0.3%磷酸溶液為流動相B, 梯度洗脫：0～5 min，5%～8% A；5～20 min，8% A；20～35 min，8%～20% A；35～45 min，20%～60% A；45～55 min，60% A；流速為1.0 ml/min；柱溫40℃；檢測波長為240 nm(莫諾苷、馬錢苷)、274 nm(丹皮酚)；進樣量 10 μl。

2.2 對照品溶液的制備分別精密稱取莫諾苷對照品、馬錢苷對照品和丹皮酚對照品適量，加50%甲醇制成每1 ml中含莫諾苷0.2556 mg、馬錢苷0.2592 mg和丹皮酚0.6214 mg的溶液，作為混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液2 ml置25 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備精密量取樣品5 ml置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取陰性樣品按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 專屬性及系統(tǒng)適用性試驗分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果表明本方法測定莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚具有良好的專屬性，陰性對照無干擾。在此色譜條件下，各待測成分峰形良好，理論板數(shù)按莫諾苷、馬錢苷計算均不低于4000。結(jié)果見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察分別精密量取混合對照品儲備液 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置25ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度,搖勻，作為系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件，分別取10 μl注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品溶液濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo), 以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚回歸方程分別為:Y=17.8669X-0.1722，r=0.9999；Y=15.8567X+0.0661， r=0.9999；Y=11.2182X+0.1595，r=0.9999。表明莫諾苷在5.112～51.120 μg/ml、馬錢苷在5.184～51.840 μg/ml、丹皮酚在12.428～124.285 μg/ml范圍內(nèi)濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

1. 莫諾苷 2.馬錢苷 3.丹皮酚圖1 高效液相色譜圖

2.6 精密度試驗精密吸取混合對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別計算峰面積的RSD。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.86%、0.73%、0.85%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗精密稱取同一批號的樣品(批號：180923),按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液, 按“2.1”項下色譜條件測定。分別計算含量和RSD，結(jié)果平均含量為每1ml含莫諾苷0.1667 mg、馬錢苷0.1917 mg和丹皮酚0.4516 mg，RSD分別為0.99%、1.11%、0.95%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、10 、12 h時，精密吸取10μl，進樣測定。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.13%、1.05%、1.07%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性試驗取同一份供試品溶液，其他色譜條件不變，改變色譜柱品牌： Eclipse Plus C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )、Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)、 Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm )，按擬訂的色譜條件進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚峰面積的RSD均小于2%，且分離度均大于1.5，表明方法耐用性好。

2.10 加樣回收率試驗取已知含量的同一批樣品(批號：180923) ，精密量取2.5ml，置50 ml量甁中，共6份,分別精密加入混合對照品儲備液1.7 ml, 按“2.3”項下方法制備供試品溶液,依法測定,結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

注： A為莫諾苷，B為馬錢苷， C為丹皮酚

2.11 樣品含量測定取樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別取供試品溶液和混合對照品溶液, 按“2.1”項下色譜條件進行測定，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

三種待測成分溶解性不同[12，13]，丹皮酚在水中溶解性較差而易溶于甲醇，莫諾苷、馬錢苷是酒萸肉中的水溶性成分。在選擇溶劑時，分別以乙醇、甲醇、50%甲醇為溶劑，制備混合對照品溶液和供試品溶液，試驗結(jié)果表明，以50%甲醇為溶劑效果較好，故以50%甲醇為溶劑制備供試品溶液。

取莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚對照品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的最大吸收波長分別為240、238、274 nm，經(jīng)過試驗比較，確定莫諾苷和馬錢苷的檢測波長為240 nm、丹皮酚的檢測波長為274 nm。

由于供試品成分復(fù)雜，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚三者的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)差別較大，在流動相選擇試驗時，曾試用甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液等不同組分和比例的流動相進行梯度洗脫，最終以流動相組分為乙腈(A)-3%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚三者峰型較好且均能與相鄰色譜峰達到基線分離。

經(jīng)方法學(xué)考察表明，通過變換檢測波長，采用高效液相色譜法能夠同時準(zhǔn)確測定兩主藥中的3種有效成分，因此，在本制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量測定方法，能夠更好控制產(chǎn)品質(zhì)量，以便臨床合理有效用藥。