黃精多糖的分離、鑒定及免疫調(diào)節(jié)功效研究*

余亞英

黃精是一種中草藥[1]，是百合科黃精屬植物，種類(lèi)繁多，常見(jiàn)以根莖入藥，能提高人體的免疫功能[2]，能補(bǔ)氣、潤(rùn)肺、健脾，還可以抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等[3]，研究黃精所含黃精多糖的結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用具有重要的意義[4]，本文以研究黃精多糖的分離、鑒定及免疫調(diào)節(jié)功效為主題，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 黃精多糖的分離與鑒定

1.1 材料與試劑實(shí)驗(yàn)材料黃精，購(gòu)買(mǎi)于河南的藥材市場(chǎng)；使用萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠研制的硫酸，北京索萊寶科技公司生產(chǎn)的DPPH、DEAE-Sepharose Fast Flow、ABTS，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、PMP。

1.2 儀器上海天宇新企業(yè)發(fā)展有限公司生產(chǎn)的多功能粉碎機(jī)、日本島津的GC-17AATF氣相色譜儀，Alpha 1-2LDplus牌的冷凍干燥機(jī)，北京浦西通用儀器公司生產(chǎn)的紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1900)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃精多糖的提取取適量的干燥黃精為實(shí)驗(yàn)材料，將黃精研磨粉碎，并過(guò)30目篩，然后再碾碎以后的黃精中加入相當(dāng)于黃精10倍劑量的95%的乙醇溶液，進(jìn)行回流提取1 h，收集濾渣，進(jìn)行干燥處理。然后在收集起來(lái)的黃精濾渣中加入黃精濾渣的8倍劑量的水，將黃精濾渣與水混合攪勻，再回流提取1 h，再次進(jìn)行抽濾，收集濾液，然后將收集起來(lái)的濾液置于60℃的條件下，進(jìn)行壓縮操作，將濾液壓縮到一定的體積，然后再將無(wú)水乙醇緩慢滴入到濾液中，不斷攪拌，等到乙醇的濃度到達(dá)80%以后，將其放入冰箱，冰箱溫度控制在4℃，在冰箱中靜置、沉淀12 h，第2日再進(jìn)行抽濾操作，最后得到的濾餅就是黃精粗多糖。

1.3.2 黃精多糖的純化對(duì)黃精多糖進(jìn)行純化操作。第一：脫蛋白。在黃精中加入適量的水，溶解黃精，按照體積比1∶3的比例混合溶解后的黃精與Sevage試劑，使其充分混合，靜置，分層。收集上層的水相溶液，去掉下層的變性的蛋白質(zhì)，將收集到的溶液減壓濃縮，并凍干。第二：脫色。在黃精中加入適量的水，溶解黃精，在溶解后的黃精里加入適量的活性炭進(jìn)行攪拌1 h，抽濾除掉活性炭，然后同樣將收集到的溶液減壓濃縮，并凍干。

1.3.3 黃精多糖鑒定利用斐林試劑鑒別法、Molisch反應(yīng)沉淀方法、雙縮脲反應(yīng)方法、茚三酮反應(yīng)方法、離子交換色譜分離黃精多糖的方法、柱前衍生化HPLC方法、Size-exclusion chromatography測(cè)分子量法、紅外光譜法、MMR分析法對(duì)黃精多糖進(jìn)行鑒定。利用DPPH方法、ABTS方法、鑒定黃精多糖的體外抗氧化能力。

1.4 結(jié)果與分析

1.4.1 鑒定結(jié)果經(jīng)鑒定，黃精多糖的斐林試劑反應(yīng)呈陰性，證明其不含游離的還原性單糖，Molisch反應(yīng)呈陽(yáng)性，證明其含有糖類(lèi)物質(zhì)，此外，在蛋白質(zhì)的鑒定中，黃精多糖呈陰性，證明其不含蛋白質(zhì)。見(jiàn)表1、表2。

表1 多糖鑒別

表2 蛋白質(zhì)鑒定

1.4.2 黃精多糖的單糖組成經(jīng)過(guò)鑒定分析，D-半乳糖、D-鼠李糖是四種多糖的主要組成部分，4種多糖中D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖的含量相對(duì)較少。見(jiàn)表3。

表3 單糖組成

1.4.3 黃精多糖的分離純化經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose Fast Flow的分離，黃精多糖得到PSP1、PSP2、PSP3、PSP4 4個(gè)部分。PSP是由純水洗脫得到的，是中性多糖。PSP2、PSP3、PSP4是經(jīng)過(guò)氯化鈉溶液洗脫、然后脫鹽、濃縮凍干后而得到的白色或者淺黃色固體，融水。

2 黃精多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用

2.1 材料與儀器材料采用黃精多糖提取物；購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)園細(xì)胞庫(kù)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系。儀器采用Tecan公司的酶標(biāo)儀、美國(guó)Bio-Rad公司的CFX96 PCR儀，電泳儀。上海安亭儀器公司生產(chǎn)的低速臺(tái)式離心機(jī)、日本Hyrayama公司提供的高壓蒸汽滅菌鍋、美國(guó)Eppenddorf公司生產(chǎn)的可調(diào)式微量加樣器、美國(guó)Alphalnnotech公司提供的Alphalnnotech HP system凝膠成像儀等。實(shí)驗(yàn)試劑采用美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的MTT、SRB；澳洲Biological Industries 生產(chǎn)的胎牛血清；東洋紡上海生物科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑；碧云天生物技術(shù)公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒評(píng)；上海西塘生物科技有限公司的TNE-a、IL-6 ELISA kit；北京Solarbio公司的RIPA細(xì)胞快速裂解液等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代操作，然后利用MTT法和SRB法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，再觀察黃精多糖對(duì)LDH活性的影響、黃精多糖對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，并用中性紅法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力等。

2.3 結(jié)果與討論

2.3.1 對(duì)細(xì)胞存活率的影響本研究利用MTT法、SRB法對(duì)黃精多糖進(jìn)行不同濃度對(duì)24 h RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響的檢測(cè)以后，發(fā)現(xiàn)黃精多糖的濃度與細(xì)胞的存活率有關(guān)系。當(dāng)黃精多糖的濃度在0～400 μg/ml時(shí)，黃精多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性沒(méi)有明顯的影響；當(dāng)黃精多糖的濃度在800 μg/ml以上時(shí)，RAW264.7的細(xì)胞活性明顯受到影響，由此可知，在日后的實(shí)驗(yàn)中，為了避免細(xì)胞毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，應(yīng)該將黃精多糖濃度控制在低于400 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。

2.3.2 對(duì)細(xì)胞受損的影響經(jīng)過(guò)研究得出，黃精多糖的濃度對(duì)細(xì)胞的受損程度有一定的影響，當(dāng)黃精多糖濃度在0～400 μg/ml時(shí) RAW264.7細(xì)胞膜完好，無(wú)毒性。當(dāng)黃精多糖的濃度在800 μg/ml以上時(shí)，RAW264.7細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞毒性增加[5～8]。

2.3.3 黃精多糖對(duì)細(xì)胞吞噬能力的影響研究得知，黃精多糖對(duì)細(xì)胞的巨噬能力能明顯的增強(qiáng)作用，能激活巨噬細(xì)胞[9]，當(dāng)黃精多糖濃度在200～400 μg/ml時(shí)，細(xì)胞的吞噬能力能明顯提高，并且有一定的劑量依賴(lài)性，當(dāng)黃精多糖的濃度在400 μg/ml以上時(shí)，RAW264.7細(xì)胞吞噬能力與陽(yáng)性對(duì)照LPS組相近[10]。

3 總結(jié)

通過(guò)對(duì)黃精多糖進(jìn)行提取、純化、鑒定操作，發(fā)現(xiàn)黃精多糖是一種含有糖類(lèi)物質(zhì)、不含游離的還原性單糖、不含蛋白質(zhì)的物質(zhì)[11，12]。甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖都是黃精多糖的主要單糖組成成分，經(jīng)過(guò)分離純化，可得P1、PSP2、PSP3、PSP4這4種糖，此外黃精多糖的濃度對(duì)細(xì)胞的存活率、細(xì)胞的受損程度、細(xì)胞吞噬能力都有作用。