三黃清胃丸治療幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎主要活性成分及潛在靶點的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

林道斌， 楊華， 程亞偉， 張達(dá)坤， 楊永和， 蔡媛媛， 舒盼， 謝紅丹

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬海南省中醫(yī)院脾胃肝病科，海南?？?70000）

自20世紀(jì)80年代Marshall和Warren成功從胃黏膜中分離出幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）以來，因HP引起的慢性胃炎受到了越來越多學(xué)者們的關(guān)注，針對HP的抗菌方案也不斷發(fā)生變化。目前，根據(jù)美國胃腸病學(xué)院（American College of Gastroenterology，ACG）發(fā)布的最新臨床指南[1]，西藥抗菌的一線方案電抗生素及質(zhì)子泵抑制劑（PPI）組成。但藥物的副作用和細(xì)菌耐藥性日益凸顯，因此，尋找安全、副作用少的新的治療方法十分必要。

海南省中醫(yī)院脾胃肝病科楊永和主任醫(yī)師根據(jù)自身數(shù)十年臨床經(jīng)驗，并結(jié)合全國名老中醫(yī)羅凌介的學(xué)術(shù)思想研制的三黃清胃丸[2]對幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎（helicobacter pylori-associated gastritis，HAG）的治療表現(xiàn)了良好的效果，其治療后復(fù)發(fā)率和副作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于西藥治療方案。雖然通過臨床觀察試驗已經(jīng)明確了三黃清胃丸的臨床療效，但關(guān)于其藥物的主要成分及作用機(jī)制仍不明確，而通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[3]方法對三黃清胃丸進(jìn)行整體研究，不但有利于下一步深入進(jìn)行實驗研究，也有利于該藥的推廣和應(yīng)用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 三黃清胃丸有效成分的篩選 本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索三黃清胃丸組成藥物半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大黃的所有活性成分。再根據(jù)口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18進(jìn)一步篩選藥物的主要活性成分。OB和DL是評判藥物有效利用度的關(guān)鍵指標(biāo)，一般而言O(shè)B≥30%、DL≥0.18的活性成分可視為藥物的主要活性成分[4]。

1.2 藥物作用靶點的篩選 將“1.1”項獲得的藥物成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的mol2格式文件反向分子對接服務(wù)器（DRAR-CPI）（http：//cpi.bio-x.cn/drar/）數(shù)據(jù)庫[5]，根據(jù)對接分?jǐn)?shù)（Z-score）＜-1篩選靶點蛋白PDB ID，并導(dǎo)入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫[6]獲取靶點基因。

1.3 疾病相關(guān)靶點的獲取和三黃清胃丸治療HAG潛在靶點篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）[7]中以幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎的英文關(guān)鍵詞“helicobacterpylori associated gastritis”或“helicobacterpylori related gastritis”作為關(guān)鍵詞，搜索HAG的疾病相關(guān)靶點并建立數(shù)據(jù)集，再與“1.2”項所得的藥物作用靶點進(jìn)行Venn分析，將兩者交集靶點作為三黃清胃丸治療HAG的直接作用靶點。為了更加直觀地分析藥物的作用機(jī)制，將藥物活性成分與核心靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建活性成分—潛在靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的相關(guān)拓?fù)鋮?shù)作進(jìn)一步分析。

1.4 基因本體論（GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 最后再將篩選出的三黃清胃丸治療HAG的潛在靶點導(dǎo)入DAVID在線工具（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO、KEGG功能注釋和富集分析。

2 結(jié)果

2.1 三黃清胃丸有效成分及藥物靶點的篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫分別檢索相關(guān)藥物，并按OB≥30%和DL≥0.18作為條件共獲得174種活性成分，研究過程中我們發(fā)現(xiàn)有9種活性成分為多個藥物共有成分，為使統(tǒng)計結(jié)果準(zhǔn)確，我們將其單獨歸為一類，分別是黃芩、半夏共有的黃芩素（baicalein），半夏、人參、黃芩、干姜、大黃共有的β-谷甾醇（beta-sitosterol），黃芩、黃連共有的黃連堿（coptisine），人參、黃芩共有的Diop，黃連、黃芩共有的表小檗堿（epiberberine），人參、甘草共有的山柰酚（kaempferol），黃連、甘草共有的槲皮素（quercetin），黃芩、干姜、甘草共有的谷甾醇（sitosterol），半夏、人參、黃芩共有的豆甾醇（stigmasterol）。其余藥物活性成分篩選結(jié)果為甘草85種、黃芩24種、人參13種、半夏9種、大黃9種、黃連8種、干姜3種。藥物靶點通過DRARCPI平臺共檢索到2 499個，去重保留唯一值后有341個。

2.2 疾病相關(guān)靶點及三黃清胃丸治療HAG潛在靶點篩選結(jié)果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到707個HAG疾病相關(guān)靶點，與“1.2”項獲取的藥物作用靶點進(jìn)行Venn分析后，得到交集靶點94個，這94個靶點可視為三黃清胃丸治療HAG潛在靶點。見圖1。

圖1 藥物靶點與HAG疾病靶點韋恩分析圖Figure 1 The Venn diagram ofdrug targets and HAG disease-related targets

2.3 活性成分—潛在靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 將藥物活性成分與潛在靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件后，建立了一個各個節(jié)點聯(lián)系密切的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。在該圖中活性成分節(jié)點有140個，靶點節(jié)點94個。圖中，紅色節(jié)點代表靶點，紫色節(jié)點代表甘草活性成分，淡藍(lán)色節(jié)點代表黃芩活性成分，淺綠色代表共有活性成分，深綠色代表人參活性成分，紫紅色代表半夏活性成分，淡紅色代表黃連活性成分，黃色代表大黃活性成分，深藍(lán)色節(jié)點代表干姜活性成分。本研究還運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件中的Network Analysis-Analyze Network插件對該網(wǎng)絡(luò)圖中的每個節(jié)點進(jìn)行分析，得到網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的度值（Degree）。Degree在活性成分節(jié)點表示該活性成分所對應(yīng)的靶點個數(shù)，在靶點節(jié)點表示能與該靶點發(fā)生作用的活性成分個數(shù)，這意味著Degree值越大，在三黃清胃丸治療HAG的過程中所發(fā)揮的作用也越大。

圖2 活性成分—靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（節(jié)點大小與Degree成正比）Figure 2 Active component-target interaction networks（Node size is in directproportion to Degree）

通過分析結(jié)果我們得出，平均每個活性成分能作用于5個靶點，有30%的活性成分作用靶點高于均值，可視為三黃清胃丸治療HAG的關(guān)鍵活性成分，而Degree最高的前5種活性成分分別為槲皮素68個、山柰酚22個、漢黃芩素（wogonin）20個、黃芩素14個、蘆薈瀉素（aloe-emodin）12個。在靶點方面，平均每個靶點能與8種活性成分聯(lián)系，有12%的靶點高于均值，這也意味者這些靶點可能是三黃清胃丸治療HAG的關(guān)鍵靶點，其中前5個靶點前列腺素G/H合酶2（PTGS2）對應(yīng)了133種活性成分，前列腺素G/H合酶1（PTGS1）和一氧化氮合酶2（NOS2）都對應(yīng)了87種，過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPARG）對應(yīng)了70種，糖原合成酶激酶3β（GSK3B）對應(yīng)了59種。表1、2分別列舉了高于Degree均值的靶點、活性成分。

表1 在活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中高于靶點均值的基因Table 1 Genes above the targetmean value in active com ponent-targetnetworks

表2 活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中的活性成分關(guān)鍵節(jié)點拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)及其來源Table 2 Topologicalproperties and origin of key nodes ofactive com ponents in com ponent-targetnetworks

2.4 GO功能注釋及KEGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID平臺的GO和KEGG通路富集分析功能對94個靶點進(jìn)行研究，GO富集分析中根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.01確定了350個條目，其中涉及生物過程的有288條，如凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對藥物反應(yīng)、對乙醇反應(yīng)等。涉及細(xì)胞組成的有26條，如細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體。涉及分子功能的有36條，如酶結(jié)合、蛋白結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合等。同時根據(jù)FDR＜0.01還找到了89條信號通路，根據(jù)FDR由小到大排名前10的有癌癥通路、乙型肝炎通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、膀胱癌通路、弓形體病通路、南美錐蟲病通路、直腸癌通路、胰腺癌通路、前列腺癌通路、Nod樣受體（NOD）受體信號通路。表3、4，圖3、4根據(jù)FDR＜0.01分別列出了前20條GO條目、KEGG通路。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對海南省中醫(yī)院院內(nèi)制劑三黃清胃丸治療HAG的主要活性成分及潛在靶點進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，前5種作用靶點最多的活性成分中，共有化合物槲皮素的作用靶點最多，能通過抗炎[8]、抑制HP[8]、抗細(xì)胞氧化[9]等途徑發(fā)揮治療作用。另一共有成分山柰酚，也具有類似的抗炎[10]及抑制HP[11]作用。漢黃芩素能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝，減少細(xì)胞凋亡，減輕胃黏膜炎癥反應(yīng)[12]。黃芩素是黃芩的主要活性成分之一，不但具有較強(qiáng)的清除氧自由基，抗氧化、減少促炎因子釋放，降低炎癥反應(yīng)的作用[13]，而且是目前最為人所熟知的抗HP的中藥活性成分之一，其抗HP的機(jī)理可能與減輕細(xì)菌毒力和抑制細(xì)菌繁殖有關(guān)[14]。有研究[15]表明蘆薈瀉素可以通過抑制HP中的乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而抑制HP的生長。

除此之外，我們通過三黃清胃丸的活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中還發(fā)現(xiàn)了94個三黃清胃丸治療HAG的直接作用靶點，其中有12個靶點的Degree高于均值，包括PTGS2、PTGS1和NOS2等。前列腺素G/H合酶又稱環(huán)氧化酶（COX），PTGS2和PTGS1屬于環(huán)氧化酶的2種同工酶，兩者在功能上既有差別又有聯(lián)系，共同參與機(jī)體穩(wěn)態(tài)和炎癥的前列腺素合成[16]。其中COX1是固有型酶，廣泛存在于胃腸道和腎臟，促進(jìn)生理性前列腺素（PG）的生成[17]，對消化道黏膜起著保護(hù)作用。COX2是誘導(dǎo)型酶，在正常組織中活性極低，但在炎癥的刺激下其表達(dá)水平可上調(diào)，并依賴其環(huán)氧化活性和過氧化活性，將花生四烯酸在各種刺激因子的作用下釋放的磷脂酶A2轉(zhuǎn)化為前列腺素的中間代謝產(chǎn)物前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2），再在其他前列腺素合成酶的作用下產(chǎn)生具有生物活性的前列腺素[18]，導(dǎo)致疼痛和炎癥反應(yīng)。因此，多種成分對環(huán)氧化酶的共同調(diào)控對整個HAG治療過程有著重要意義。

表3 94個潛在靶點的GO分析結(jié)果（FDR＜0.01）Table 3 GO enrichment results for 94 Drug targets（FDR＜0.01）

表4 94個潛在靶點的KEGG分析結(jié)果（FDR＜0.01）Table 4 KEGG pathways enrichment results for 94 potentialDrug targets（FDR＜0.01）

圖3 94個潛在靶點的GO分析結(jié)果條形圖（FDR＜0.01）Figure 3 Bar chartofGO enrichment results for 94 potentialDrug targets（FDR＜0.01）

圖4 94個潛在靶點的KEGG分析結(jié)果氣泡圖（FDR＜0.01）Figure 4 Bubble chartofpathways enrichment results for 94 potentialdrug targetgenes（FDR＜0.01）

NOS2和一氧化氮合酶3（NOS3）分別是一氧化氮合酶（NOS）的誘導(dǎo)型和內(nèi)皮型酶。正常生理情況下，低濃度的NOS對胃黏膜的黏液分泌和血液循環(huán)有著積極作用[19]，但在病理狀況下如HP的刺激會使NOS的表達(dá)水平升高[20]，使一氧化氮（NO）與氧產(chǎn)生大量氧代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物與蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)合后會對機(jī)體的組織細(xì)胞產(chǎn)生毒性，降低胃黏膜屏障功能[21]。特別是在HP感染的條件下，胃黏膜中的氧化和硝酸基程度較高，與過量NO結(jié)合后會產(chǎn)生強(qiáng)致癌物質(zhì)亞硝胺，對HAG的演變造成不良影響[22]。因此，對NOS3和NOS2的調(diào)控可能是三黃清胃丸治療HAG的一個重要途徑。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）是一類由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，目前已發(fā)現(xiàn)有3種亞型PPARα、PPARβ、PPARγ等[23]。其中由PPARG編碼的PPARγ不但對HP感染的胃黏膜表現(xiàn)出抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用[24]，而且因為能夠抑制細(xì)胞異常增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用成為了目前腫瘤研究的熱點[25]。而其抗腫瘤的一項重要機(jī)制與B淋巴細(xì)胞瘤2（BDL2）密切相關(guān)，有報道[26]稱，PPARγ能抑制BCL2的過度表達(dá)誘導(dǎo)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡。另一靶點GSK3B在HP感染時，HP的主要毒性因子CagA與GSK3B基因結(jié)合使不可溶部分增加，降低其活性，并且可通過消耗GSK3B誘導(dǎo)上皮細(xì)胞—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），整個過程不僅會產(chǎn)生急慢性炎癥，還會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[27]。而根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，癌癥通路富集基因最多，據(jù)此可以推測三黃清胃丸可在一定程度上對HAG的癌變有干預(yù)作用。

MAPK14是絲裂原蛋白激酶14，又稱為P38α。HP的類脂多糖可誘導(dǎo)P38α的活化[28]，從而介導(dǎo)炎癥因子的釋放產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。所以抑制P38α的活化可能是三黃清胃丸對HAG治療的一個重要方面，而且已有研究[29]表明，P38是人參皂苷降低炎癥反應(yīng)的一個重要靶點，通過抑制P38α及其他炎癥因子的活性發(fā)揮作用。

毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3（CHRM3）廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，控制著平滑肌收縮及腺體組織的分泌功能[30]，在刺激狀態(tài)下特別是膽汁酸等因素的作用下，會促進(jìn)胃蛋白酶原和胃酸的分泌，進(jìn)一步加劇胃黏膜的損害[31，32]。5-羥色胺（5-HT）轉(zhuǎn)移蛋白基因（SLC6A4）蛋白是一種膜傳遞蛋白，其對胃腸道的作用主要通過該基因編碼的5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體（SERT）實現(xiàn)，SERT的生理作用是將發(fā)揮功效后的5-HT再攝取進(jìn)行滅活[33]，若SERT的表達(dá)量及活性降低，則會引起胃腸道內(nèi)游離5-HT增多，5-HT及其亞型可增強(qiáng)胃腸道的功能運(yùn)動[34]。而胃腸活動對消化道慢性炎癥有一定的改善。所以可以推測三黃清胃丸主要成分對于SLC6A4的調(diào)節(jié)作用可能類似于5-HT再攝取抑制劑的作用。半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的一種亞族，起著細(xì)胞凋亡執(zhí)行者的作用[35]。在HAG疾病過程中胃上皮細(xì)胞凋亡是胃黏膜損傷的一個重要標(biāo)志[36，37]，其方式之一便是HP上調(diào)CASP3的表達(dá)，下調(diào)粘鈣蛋白E的表達(dá)通過線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡[38]。所以作用于CASP3靶點暗示著抗細(xì)胞凋亡也是三黃清胃丸療效的一個重要方面。CA2是碳酸酐酶（CA）的14種形式之一，CA是一種含鋅金屬酶，在機(jī)體內(nèi)對二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽起著催化作用，并對胃中鹽酸的分泌起作用[39]。而提高胃內(nèi)pH值可提高根除HP的效果[40]，所以相關(guān)成分作用于CA2靶點可能是通過調(diào)節(jié)胃內(nèi)酸堿環(huán)境配合其他成分對HP的滅活。

另外，本研究還對94個治療靶點做了KEGG通路富集分析。根據(jù)FDR＜0.01確定了89條作用通路，F(xiàn)DR最小的前10條通路中有3條與HAG相關(guān)，除了文中的癌癥通路，還有TNF信號通路以及NOD樣受體信號通路。TNF是一種細(xì)胞信號因子，介導(dǎo)著多個系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，是炎癥急性期的主要細(xì)胞因子[41]，可在HP脂多糖的刺激下[42]觸發(fā)多項級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[43]。而NOD屬于胞內(nèi)識別受體，可在危險相關(guān)分子模式和病原相關(guān)分子模式的激活下[44]，與其適配器蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和半胱天冬氨酸蛋白酶原結(jié)合形成炎癥小體，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[45]。所以，三黃清胃丸可能通過作用于上述信號通路及其他通路對HP誘發(fā)的慢性胃炎進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對三黃清胃丸治療HAG的作用機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了140種可直接作用于HAG靶點的活性成分以及94個潛在靶點，并通過KEGG通路富集分析確定了89條作用通路，結(jié)果與目前文獻(xiàn)報道基本吻合，證明了其科學(xué)性。同時上述研究成果也給我們下一步研究指明了方向，為在動物實驗中深入探討三黃清胃丸治療HAG的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。