ERa基因多態(tài)性與女性膝骨性關(guān)節(jié)炎經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的相關(guān)性研究

易志勇， 韓清民， 郭斯印

（廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東廣州510375）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種由于關(guān)節(jié)軟骨損傷而引起的韌帶、肌腱、膝周關(guān)節(jié)囊等諸多組織發(fā)生病變的一種骨科常見病，其確切發(fā)病機制尚未清楚，多發(fā)生于老年人群，該病嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，甚至成為老年人致殘的疾患之一[1，2]。目前，隨著我國人口老齡化問題的日益嚴重，KOA發(fā)病率逐年上升，這不僅給患者自身帶來巨大的痛苦，也給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔[3]。研究[4]表明，引起KOA發(fā)生的主要危險因素有年齡（＞45歲）、性別（女性發(fā)病率明顯高于男性）、肥胖、遺傳因素以及膝關(guān)節(jié)外傷史或手術(shù)史等。近年來，KOA由于其高發(fā)病率和高致殘率，已引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，同時也進行了大量的臨床研究，但由于KOA復(fù)雜的發(fā)病機制，目前并沒有找到更有效的治療方法。目前，臨床上主要采取生物制劑、外科手術(shù)治療和基因治療3種治療手段[5，6]?；蛑委熓且环N新型的KOA治療手段[7]，該方法可以將生物制品釋放到特定靶點進而達到治療目的，但是由于基因治療的費用比較昂貴，目前并沒有廣泛應(yīng)用于臨床治療中。雌激素受體（estrogen receptor，ER）包括核受體和膜受體，ERa是一種核受體，位于胞漿或胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的作用，可以介導(dǎo)雌激素的基因型效應(yīng)[8]。ERa可通過與靶基因中的雌激素特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞增殖和分化，研究表明，ERa基因單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）可能導(dǎo)致基因在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平失調(diào)，導(dǎo)致ER表達、功能異常，從而引起一系列疾病發(fā)生。已有研究報道，ERa基因多態(tài)性與女性月經(jīng)過少、乳腺癌以及胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[9，10]。本研究旨在探討ERa基因多態(tài)性與女性KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的相關(guān)性，以期從基因?qū)用骊U述KOA的發(fā)病機制，為KOA的臨床治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月至2017年12月在廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院骨科門診及住院部就診且明確診斷為KOA的180例患者作為病例組?；颊叩钠骄挲g為55.2歲（45.8～73.7歲），病程最短2年，最長28年，平均11.8年；同時，選取180例同時期在本院體檢部門進行體檢的正常人群作為健康對照組（簡稱對照組），所有研究對象均為女性。本研究已獲得所有研究對象的知情同意，并符合醫(yī)學倫理學的各項規(guī)定。

1.2 病例選擇標準

1.2.1 診斷標準 參照1995年美國風濕病協(xié)會修訂的KOA診斷分類標準[11]。

1.2.2 納入標準 ①均經(jīng)臨床確診為KOA；②年齡在45～75歲之間；③知情并同意參加本研究的患者。

1.2.3 排除標準 ①年齡在45歲以下及75歲以上的患者；②不符合上述KOA診斷標準的患者；③精神病患者；④患有心血管、肝腎等嚴重疾病的患者；⑤局部有軟組織感染的患者；⑥患有骨腫瘤、結(jié)核、類風濕性和創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的患者。

1.3 試劑與儀器 全血基因組純化試劑盒（美國Thermo Fisher公司），iPLEX Gold試劑盒（美國Sequenom公司）；MassArray質(zhì)譜儀（美國Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR儀（美國ABI公司）。

1.4 血樣采集及DNA提取 采集每位研究對象外周靜脈血5mL，置于EDTA抗凝管中，現(xiàn)場編號并登記姓名，所有標本采集當天送回實驗室，置于-70℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進行DNA提取，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.5 基因分型 從NCBI和HapMap數(shù)據(jù)庫中查詢ERa基因的多態(tài)性位點，選擇在中國人群（CHB）最小等位基因頻率≥5%的位點，最終確定了ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ兩個多態(tài)性位點作為本研究中的位點。采用Sequenom MassArray SNP基因分型技術(shù)對所選擇的SNP位點進行分型。qPCR單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進行設(shè)計和合成，ERa受體序列為P1：5’-CTGCCACC CTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’；P2：5’-T CTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3’。反應(yīng)在MassArray質(zhì)譜儀中進行，基因分型使用Sequenom MassArray RS1000軟件進行。

1.6 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用方差分析，計數(shù)資料用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析法。采用精確檢驗對對照組進行Hardy-Weinberg平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗，評估對照組的可靠性。計算各位點的等位基因及基因型頻數(shù)，采用χ2檢驗比較兩組間各位點的等位基因頻率分布差異是否有統(tǒng)計學意義，初步確定檢測的位點是否與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型有相關(guān)性。應(yīng)用SNPStats在線軟件（http：//bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）測定ERa基因的PvuⅡ和XbaⅠ兩個多態(tài)性位點與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的關(guān)系。以相對優(yōu)勢比（odds ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）來評估ERa基因的多態(tài)性位點與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，ERa基因上的PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性位點在病例組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），說明本研究所選擇的樣本具有群體代表性。

2.2 ERa基因多態(tài)性分布特點 本研究對ERa基因上的兩個多態(tài)性位點PvuⅡ和XbaⅠ進行基因分型，利用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行卡方檢驗并分析比較各個位點的等位基因頻率分布在病例組和對照組中是否具有統(tǒng)計學差異，并對年齡和性別進行校正。結(jié)果顯示ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性位點的基因型及等位基因頻率在病例組與對照組存在明顯不同，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 病例組與對照組ERa基因多態(tài)性分布比較Table 1 Com parison of the distribution of ERa genetic polymorphisms between the case group and controlgroup n（p/%）

2.3 ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)分析ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風險的相關(guān)性分析結(jié)果顯示：在等位基因模型下，PvuⅡ多態(tài)性與KOA的患病風險不存在相關(guān)性[P等位基因（OR=2.53；95%CI，0.73-1.38；P=0.54），p等位基因（OR=1.36；95%CI，0.35-1.25；P=0.15）]；在等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點的x等位基因（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035）與KOA的患病風險存在相關(guān)性，X等位基因（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.36）與KOA患病風險不存在相關(guān)性。此外，本研究還通過卡方檢驗，比較了基因型頻率分布在病例組和對照組中是否具有統(tǒng)計學差異，并對年齡和性別進行校正。結(jié)果顯示：與參考基因型PP相比，PvuⅡ多態(tài)性位點與KOA的患病風險不存在相關(guān)性（P＞0.05）；XbaⅠ多態(tài)性位點的Xx基因型頻率在病例組和對照組中存在顯著性差異（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045），說明其能顯著增加KOA的患病風險。結(jié)果見表2。

表2 ERa基因多態(tài)性與KOA發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)分析Table 2 Correlation analysis of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA n（p/%）

2.4 ERa基因多態(tài)性在不同遺傳模型下與KOA相關(guān)性分析 通過無條件邏輯回歸模型，引入3種遺傳模型（顯性、隱性和加性），分別計算各位點等位基因的OR和95%CI，衡量各位點風險等位基因?qū)OA風險的效應(yīng)大小，并按照性別、年齡修正。結(jié)果顯示：在顯性模型下，XbaⅠ多態(tài)性位點的最小等位基因X與增加KOA患病風險具有相關(guān)性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多態(tài)性位點在3種遺傳模型下均與KOA的患病風險無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

2.5 ERa基因多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析 根據(jù)KOA的中醫(yī)證型，本研究將180例患者分為寒濕阻絡(luò)型、濕熱阻絡(luò)型、瘀血阻絡(luò)型、肝腎兩虛型以及混合型5組進行分層，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的基因型及等位基因均與KOA的濕熱阻絡(luò)型和混合型這兩個證型具有相關(guān)性（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表4、表5。

表3 ERa基因多態(tài)性在不同遺傳模型下與KOA相關(guān)性分析Table 3 Correlation of ERa genetic polymorphism s w ith the risk of KOA in various geneticmodels

表4 ERa基因PvuⅡ多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析Table 4 Stratified analysis for the correlation of ERa PvuⅡpolymorphism s w ith TCM syndrome types

表5 ERa基因XbaⅠ多態(tài)性與KOA中醫(yī)證型的分層分析Table 5 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ith TCM syndrome types

2.6 ERa基因多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析 根據(jù)KOA的經(jīng)筋分型，可以將KOA患者分為足太陽經(jīng)筋型、足少陽經(jīng)筋型、足陽明經(jīng)筋型、足三陰經(jīng)筋型（足太陰經(jīng)筋型、足少陰經(jīng)筋型以及足厥陰經(jīng)筋型）4種類型。根據(jù)KOA的經(jīng)筋分型對其進行分層，并分析ERa基因多態(tài)性與經(jīng)筋分型的相關(guān)性，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ多態(tài)性基因型和等位基因與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多態(tài)性基因型與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05），等位基因x與足陽明經(jīng)筋型和足三陰經(jīng)筋型具有相關(guān)性（P＜0.01）。結(jié)果見表6、表7。

表6 ERa基因PvuⅡ多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析Table 6 Stratified analysis for the correlation of ERa PvaⅡpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

表7 ERa基因XbaⅠ多態(tài)性與KOA經(jīng)筋分型的分層分析Table 7 Stratified analysis for the correlation of ERa XbaⅠpolymorphism s w ithmuscle-along-meridian classification

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是引起老年人疼痛和傷殘的主要原因之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔[12]。中老年女性為KOA的多發(fā)人群，這可能與女性患者的鈣流失嚴重以及激素水平的變化有一定的關(guān)系[13]。ERa基因為一種雌激素受體，可通過與雌激素的結(jié)合而引起下游基因的轉(zhuǎn)錄。本研究通過病例—對照的研究設(shè)計，利用MassArray技術(shù)檢測了ERa基因的PvuⅡ與XbaⅠ多態(tài)性位點，并分析該基因的多態(tài)性位點與KOA經(jīng)筋分型及中醫(yī)證型的相關(guān)性，探討KOA發(fā)病的分子生物學機制，以期為KOA的臨床治療提供科學依據(jù)。本次研究中我們所納入的患者均為女性，這樣能更好地解釋雌激素水平與KOA發(fā)病的相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示：ERa基因XbaⅠ多態(tài)性位點的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對照組有顯著性差異，病例組人群等位基因x頻率分布明顯高于對照組人群，可以顯著增加KOA的患病風險（OR=1.45；95%CI，1.05-2.45；P=0.035），X等位基因與KOA患病風險不存在相關(guān)性（OR=1.35；95%CI，0.31-1.49；P=0.360）。通過各位點的基因型頻率比較發(fā)現(xiàn)，與參考基因型PP相比，PvuⅡ多態(tài)性位點與KOA的患病風險不存在相關(guān)性（P＞0.05）；XbaⅠ多態(tài)性位點的Xx基因型頻率在病例組和對照組中存在顯著性差異，能顯著增加KOA的患病風險（OR=1.86；95%CI，1.06-3.13；P=0.045）。通過無條件邏輯回歸模型，我們發(fā)現(xiàn)在顯性模型下，XbaⅠ多態(tài)性位點的最小等位基因X與增加KOA患病風險具有相關(guān)性（OR=1.51；95%CI，1.15-2.23；P=0.035）；PvuⅡ多態(tài)性位點在3種遺傳模型下均與KOA的患病風險無相關(guān)性（P＞0.05）。

此外，我們還根據(jù)KOA的中醫(yī)證型，對所有女性KOA患者進行了分層分析，結(jié)果顯示：ERa基因PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性的基因型及等位基因均與KOA的濕熱阻絡(luò)型和混合型這2個證型具有相關(guān)性（P＜0.05或P＜0.01）。KOA經(jīng)筋分型的分層分析結(jié)果表明，ERa基因PvuⅡ多態(tài)性基因型和等位基因與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05）；ERa基因XbaⅠ多態(tài)性基因型與KOA經(jīng)筋分型無相關(guān)性（P＞0.05），而等位基因x與足陽明經(jīng)筋型和足三陰經(jīng)筋型具有相關(guān)性（P＜0.01）。雖然目前還沒有研究表明ERa基因多態(tài)性與KOA易感性之間的關(guān)系，但是我們已從現(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)ERa基因多態(tài)性與女性的雌激素水平之間的關(guān)系，此外，亦有研究證明ERa基因多態(tài)性與乳腺癌之間的關(guān)系。因此，在后續(xù)的功能試驗中我們還會繼續(xù)增大樣本量來進一步驗證ERa基因多態(tài)性與KOA患病風險之間的關(guān)系，以及從功能學方面去研究這些多態(tài)性位點與KOA易感性之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究結(jié)果表明ERa基因多態(tài)性與KOA患病風險之間存在相關(guān)性，尤其是ERa基因XbaⅠ多態(tài)性位點，表明ERa基因多態(tài)性在KOA的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用，這就為KOA的早期診斷與預(yù)防提供了新的候選基因位點，也為該疾病發(fā)生機制的研究奠定了基礎(chǔ)?；蚨鄳B(tài)性與疾病發(fā)病風險之間的關(guān)系是目前國內(nèi)外關(guān)于疾病發(fā)病的遺傳機制研究比較多的一個方向，也是最能從基因?qū)用嫔辖忉尲膊“l(fā)病機制的一種研究方法，該方法可以為疾病的早期預(yù)防及臨床治療提供依據(jù)[14，15]。但是該研究方法得出的結(jié)果往往不是很明確，而且實驗結(jié)果可能會受到遺傳因素和種族差異的影響。此外，研究樣本的選擇偏倚、不同實驗室所用方法的差異等均會造成實驗結(jié)果的誤差，因此，也給該研究方法的使用帶來了很多的局限性。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了ERa基因上與KOA患病風險相關(guān)的多態(tài)性位點，但是本研究也存在一些缺點，比如樣本量相對較少等，因此，在后續(xù)的研究中，我們?nèi)匀恍枰M一步在大量人群中去驗證這些多態(tài)性位點及其與KOA患病風險的相關(guān)性；其次，我們沒有進行候選SNP位點的功能學研究，所以在后續(xù)的研究中我們還需用功能實驗來驗證候選基因與KOA的相關(guān)性；最后，我們?nèi)孕枰诓煌娜巳褐腥ヲ炞C這些多態(tài)性位點，以期為其臨床診斷及治療提供依據(jù)。