碳酸鈉對牛肉嫩化效果及品質(zhì)的影響

郝婉名，祝超智，趙改名*，韓明山，孟子晴，王可，李苗云

1(河南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，河南 鄭州，450003)2(通遼綜合試驗站，內(nèi)蒙古 通遼，028000)

牛肉是世界第三消耗肉品，約占肉制品市場的25 %，僅落后于豬肉和家禽[1]。牛肉富含豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和B族維生素，且具有低脂肪、低膽固醇等特點[2]，中醫(yī)中也有“黃牛肉，補氣，與綿黃芪同功”的說法，意思是常吃牛肉可以補中益氣、滋養(yǎng)脾胃，有利健康。因此，隨著人們生活水平的提高，牛肉成為一種追求營養(yǎng)健康的消費者的理想選擇。但目前市場上售賣的牛肉產(chǎn)品普遍存在肉質(zhì)硬、嫩度差等缺點，嚴重影響肉制品品質(zhì)，為了改善這些缺點，牛肉在生產(chǎn)加工過程中需要經(jīng)過嫩化處理。

堿法嫩化是一種傳統(tǒng)的嫩化工藝，中國自古以來就有在燉煮牛肉中加入純堿來提高牛肉嫩度的做法。很多研究證實堿性物質(zhì)被用于肉類腌制中起到很好的嫩化作用，如磷酸鹽和Na2CO3質(zhì)量比1∶8復配而成的腌制劑對重組牛排有很好的嫩化效果[3]；NaCO3與菊粉共同作用能有效改善重組雞排嫩度和保水性[4]；李劼等[5-6]分別把NaCO3和NaHCO3溶液涂抹在牛肉上進行腌制來研究堿對醬牛肉的嫩化作用，證實了碳酸鈉和碳酸氫鈉在提高肌肉pH值和保水性的同時，還可以降低蒸煮損失，改善牛肉制品的色澤。楊洪基等[7]研究了CaCl2、木瓜蛋白酶和Na2HCO3復合體系對原切牦牛排的嫩化作用，結(jié)果顯示CaCl2質(zhì)量濃度 10.19 mg/mL、木瓜蛋白酶活力 14.94 U/g、NaHCO3質(zhì)量濃度 10.95 mg/mL、腌制時間 12 h時嫩化效果最佳。Na2CO3在豬肉中的應用表明，Na2CO3注射顯著提高肌肉的pH值，有效減低了PSE肉出現(xiàn)機率[8]。但是這些研究通常采用涂抹或浸泡的方式進行嫩化，且研究內(nèi)容僅僅局限于嫩化效果的研究，有關(guān)Na2CO3注射對牛肉嫩化效果的研究比較少，Na2CO3對牛肉肌纖維和結(jié)締組織特性的研究未見報道。本研究探討了Na2CO3注射對西門塔爾雜交牛肉的嫩化效果，篩選出合適的Na2CO3處理濃度，并探究Na2CO3注射對牛肉肌纖維及結(jié)締組織的部分影響，期望為新型牛肉嫩化技術(shù)的研究提供理論依據(jù)，改善牛肉產(chǎn)品普遍存在的嫩度上的缺點，提高牛肉產(chǎn)品品質(zhì)與價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇雄性西門塔爾雜交牛的臀肉作為研究對象。所有樣品肉均來自寧夏夏華食品有限公司，年齡為18個月。樣品經(jīng)分割后在-30 ℃以下冷凍24 h后裝入放有冰袋的保溫箱中在6 h內(nèi)帶回實驗室，于-30 ℃下冷凍保存。

1.2 儀器與試劑

儀器：Minolta CR-5型臺式色差儀，日本KONICA MINOLTA公司；HI8424 型酸度計，德國HANNA公司；CU-420(HZW21)型恒溫水浴槽，上海一恒科學儀器有限公司；PQ001MicroMR柜式NMR成像儀,上海紐邁電子科技有限公司；MM12B絞肉機,廣東省韶關(guān)市大金食品機械廠；MJ-BL25C3型攪拌機，廣東美的公司；MODEL 2000沃布剪切力儀，美國G-R公司;35172 BRUZ拍打均質(zhì)機，法國AES Chemunex公司；UV-2600型紫外分光光度計，日本島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

試劑：Na2CO3(食品級)；KCl；K2HPO4；KH2PO4；MgCl2；雙縮脲試劑；戊二醛；磷酸緩沖液；乙醇；氯仿；叔丁醇(以上試劑未特殊說明均為分析純)。

1.3 實驗步驟

工藝流程：

樣品解凍→去除筋膜→注射嫩化→低溫腌制→樣品檢測

1.4 樣品處理

冷凍的原料肉在0～4 ℃環(huán)境中解凍24 h至完全解凍，將解凍后肉樣剔去筋膜脂肪，順著肌纖維方向切成2 cm×5 cm×5 cm的小塊，肉樣稱重。用1mL注射器沿肌纖維的方向向不同肉樣分別均勻注射Na2CO3。固定注射量8 %(樣品質(zhì)量的百分比)、腌制時間12 h，調(diào)節(jié)Na2CO3濃度0、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L。處理后的樣品保鮮膜封口在0～4 ℃環(huán)境下放置12 h后，用吸水紙瀝干表面的水分進行檢測試驗。

1.5 測定指標

1.5.1 pH值測定

參照國標使用便攜式pH計進行測定。

1.5.2 剪切力測定

參考DESEFANI等[9]的方法進行適當?shù)男薷?，將已處理的肉樣切? cm×1 cm×2 cm大小，裝入蒸煮袋于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱至中心溫度75 ℃,取出，冷卻至室溫，然后用沃布剪切儀測定每個肉塊的剪切力值。

1.5.3 肌原纖維小片化指數(shù)(myofibrillar flake index,MFI)

參考李桂霞等[10]的方法，分別稱取1 g攪碎的肉樣，加入15 mL預冷后(4 ℃)的MFI(myofibrillar flake index)緩沖溶液(100 mmol/L KCl,11.2 mmol/L K2HPO4，0.8 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgCl2)冰浴勻漿(12 000 r/min，40 s)，每次10 s，中間間隔10 s；離心后(1 000 g，15 min，2 ℃)棄掉上清液；沉淀中加入2.5 mL的MFI緩沖溶液(已預冷)攪拌均勻，用紗布過濾去除結(jié)締組織，用2.5 mL MFI緩沖溶液洗滌管內(nèi)壁并過濾，合并濾液待用。采用BCA法測定濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度至0.5 mg/mL后，在562 mm處用紫外分光光度計測定吸光度值，將所得結(jié)果乘以200即可得MFI值。

1.5.4 膠原蛋白含量

羥脯胺酸含量的測定方法參考了KOLARL等[11]的方法，將原料肉在0 ℃溫度下切成小塊(0.5 cm3)，真空包裝后的樣品被放入70℃熱水中保溫30 min，攪碎待用；準確稱取4 g攪碎的樣品放入裝有30 mL 3 mol/L的H2SO4溶液的燒瓶中，于105 ℃鼓風干燥箱中水解16 h；把水解產(chǎn)物過濾至250 mL容量瓶中，加水定容待用；移取一定體積(V)的上述溶液于250 mL容量瓶中，稀釋至羥脯氨酸濃度在0.5～2 μg/mL；移取4 mL稀釋后的溶液于裝有2 mL氯胺T溶液的比色管中，混合后于室溫下放置20 min,向比色管中加入2 mL顯色劑，混合封口后放入60 ℃水浴鍋中，加熱20 min；取出比色管用流動水冷卻3 min，在室溫下放置30 min后于558 nm處用分光光度計測定吸收值。對照標準曲線計算溶液中羥脯胺酸濃度。樣品中羥脯胺酸濃度按公式(1)計算,樣品中膠原蛋白濃度根據(jù)公式(2)計算:

(1)

X2=9.75X1

(2)

式中：X1，試樣中羥脯胺酸的含量(質(zhì)量分數(shù))，%；ρ，由標準曲線得到的水解產(chǎn)物中羥脯胺酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；m，樣品質(zhì)量，g；V，從250 mL容量瓶中吸取的濾液的體積，mL；，X2，試樣中膠原蛋白的含量(質(zhì)量分數(shù))，%。計算結(jié)果保留小數(shù)點后兩位。

1.5.5 肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)

參考PALKA[12]的方法，取待測樣品，切成2 mm×5 mm的小條，先用2.5 %。pH 6.8的戊二醛溶液浸泡過夜固定，之后用0.1 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min。然后分別用體積分數(shù)50%、70%、80%、90%乙醇溶液進行脫水，每次10 min；再用100 %乙醇脫水3次，每次10 min，最后用氯仿脫脂1 h后依次用100 %乙醇-叔丁醇(體積比1∶1)溶液和叔丁醇各置換1次，每次15 min，用冷凍干燥儀對樣品進行干燥，用掃描電鏡對樣品進行觀察。

1.5.6 蒸煮損失測定

取2 cm×2 cm×2 cm大小的樣品稱的其質(zhì)量為m1(g)，將其在90℃水浴鍋中加熱至中心溫度達到75 ℃，取出后冷卻至室溫擦去表面水分稱量其質(zhì)量為m2(g)，蒸煮損失計算公式如式(3)：

(3)

1.5.7 色差測定

將冷凍保存的樣品在空氣中放置1 h后，選其新鮮面參考肖夏等[13]的方法，使用便攜式色差計進行測定。光源D65，直徑5 mm。其中L*表示亮度值，a*表示肉的紅度值，b*表示肉的黃度值。

1.5.8 低場核磁共振

使用配備有PQ001-18mm頭部的臺式SLK100TD-NMR光譜儀記錄CPMG衰減信號。TD參數(shù)使用CPMG序列的NMR弛豫譜與FANBOLA等[14]中先前優(yōu)化的相同，分別為0/2和0.0和3.0，S的回波時間為0.249 ms，總計為10 000 E，平均16次掃描，循環(huán)時間3.6 s。每個樣品測量前先進行修剪，去除外部脂肪。在室溫環(huán)境中，對3份牛肉樣品進行3次分析。

1.5.9 感官評定

選取10名經(jīng)培訓過的感官評定人員對不同處理的牛肉制成的牛排從色澤、香氣、滋味、嫩度、多汁性、整體接受度和是否異常等7個方面進行評價，評定標準見表1。

表1 感官評定標準Table 1 Sensory assessment criteria

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 13.0進行分析，用Origin 8.0進行作圖。每個實驗數(shù)據(jù)測3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Na2CO3對牛肉pH值的影響

pH值是牛肉重要的品質(zhì)指標，與保水性、嫩度、色澤等指標顯著相關(guān)[15]。牛肉pH值隨Na2CO3濃度變化的結(jié)果如表2所示。經(jīng)Na2CO3注射嫩化的牛肉pH值顯著高于未注射的空白樣品(P<0.05)，且隨著Na2CO3濃度的升高，牛肉pH值逐漸升高。這是因為Na2CO3是一種弱堿性的鈉鹽，它的水溶液可以顯著提高牛肉的pH值。當Na2CO3濃度升高到0.40 mol/L時，牛肉的pH值達到6.81近中性(7.0)。此結(jié)果與李劼等[5]研究結(jié)果一致。

表2 不同濃度Na2CO3對牛肉pH值及剪切力的影響結(jié)果Table 2 Effects of different concentrations of sodium carbonate on pH value and shear force of beef

注：上標字母表示不同注射濃度間差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同濃度Na2CO3對牛肉嫩度的影響

嫩度是牛肉重要的品質(zhì)指標，是影響消費者選擇最重要的指標之一，一般用剪切力值來表示。由表2數(shù)據(jù)可以看出，添加Na2CO3能顯著降低牛肉的剪切力(P<0.05)，提高牛肉嫩度；隨著Na2CO3濃度的提高，剪切力出現(xiàn)顯著的下降趨勢；當Na2CO3濃度從0.30 mol/L升高到0.35 mol/L時，剪切力下降幅度最大(27 %)，當Na2CO3濃度達到0.35 mol/L后，牛肉剪切力的下降趨勢趨于平緩。Na2CO3對牛肉嫩度的改善與提高牛肉pH值，增加肌肉保水性有關(guān)[16]，也有研究表明，Na2CO3提高牛肉嫩度可能與改變pH值，弱化結(jié)締組織有關(guān)[17]。

2.3 不同濃度Na2CO3對牛肉肌原纖維小片化指數(shù)的影響

肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)代表肌原纖維的分解程度[18]，是衡量肌肉嫩度的一個指標，MFI越大，說明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受到破壞的程度越大，肉的嫩度越好[19]。圖1結(jié)果顯示，牛肉的肌原纖維斷裂程度隨Na2CO3濃度的增大而增加，特別是當Na2CO3濃度達到0.35 mol/L后，肌原纖維小片化指數(shù)激增，這是Na2CO3嫩化的主要機制之一。

圖1 不同濃度Na2CO3溶液對牛肉肌原纖維小片化指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of sodiumcarbonate solution on the fragmentation index of beef myofibril注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.4 不同濃度Na2CO3對牛肉膠原蛋白含量的影響結(jié)果分析

結(jié)締組織是肌肉中的次要組成部分，主要由膠原纖維構(gòu)成，其主要成分是膠原蛋白。研究表明，肌肉的嫩度與肌束膜和肌內(nèi)膜中膠原蛋白含量顯著相關(guān)[20]。從圖2的數(shù)據(jù)可以看出，Na2CO3注射能顯著降低牛肉中膠原蛋白的含量(P<0.05)，當Na2CO3濃度達到0.35 mol/L后，牛肉中膠原蛋白含量雖然略有下降，但差異并不顯著。常海軍等[17]研究了3種若有機酸對肌束膜膠原蛋白含量的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)有機酸處理的樣品肌束膜膠原蛋白含量遠低于對照組。這可能與肌肉pH值與離子強度有關(guān)[21]。結(jié)合微觀結(jié)構(gòu)的觀察可推斷，牛肉膠原蛋白含量的降低與牛肉肌束膜的溶解也有關(guān)。肌肉的嫩度與膠原蛋白含量成反比，與可溶性膠原蛋白含量成正比[22]，由此可得到，Na2CO3能有效改善牛肉嫩度，且改善牛肉嫩度的機理與降低膠原蛋白含量，弱化結(jié)締組織有關(guān)。

圖2 不同濃度Na2CO3溶液對牛肉膠原蛋白含量的影響Fig.2 Effect of sodium carbonate solution with differentconcentrations on the content of beef collagen

2.5 不同濃度Na2CO3處理牛肉的肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)

圖3為經(jīng)Na2CO3注射前后牛肉的微觀結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖3-a、3-b、3-c、3-d、3-e為橫截面示意圖Na2CO3注射濃度依次為0、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L，由圖3-a、3-b、3-c、3-d、3-e可以看出，隨著Na2CO3濃度的增大，肌束明顯變粗，肌纖維間的間隙增大，且包裹肌束的肌束膜逐漸溶解；圖3-f、3-g、3-h、3-i、3-j為樣品縱截面在500倍下的電鏡圖，同樣可以明顯看出肌束變粗，肌束膜逐漸溶解，肌纖維部分外露。這與我們前面得出的膠原蛋白含量下降的結(jié)果相符，也與常海軍等[23]研究3種有機弱酸對肌束膜膠原蛋白和肌內(nèi)膜膠原蛋白影響的研究結(jié)果相符。肌束的大小與肌束膜的厚度是影響肌肉嫩度的主要因素之一，肌束越粗，肌束膜越薄，肌肉越嫩[24-25]。

a-空白對照組橫截面;b-0.25 mol/L Na2CO3處理組橫截面;c-0.30 mol/L Na2CO3處理組橫截面;d-0.35 mol/LNa2CO3處理組橫截面;e-0.40 mol/L Na2CO3處理組橫截面;f-空白對照組縱截面;g-0.25 mol/L Na2CO3處理組縱截面;h-0.30 mol/L Na2CO3處理組縱截面;i-0.35 mol/LNa2CO3處理組縱截面;j-0.40 mol/L Na2CO3處理組縱截面圖3 不同濃度NaCO3注射牛肉肌原纖維微觀結(jié)構(gòu)Fig.3 Microstructure of beef myofibrils injected with sodiumcarbonate at different concentrations

2.6 不同濃度Na2CO3對牛肉保水性的影響

蒸煮損失是體現(xiàn)肉類保水性的重要指標，可以體現(xiàn)肌肉保持水分的能力。不同濃度Na2CO3對牛肉蒸煮損失的影響結(jié)果如圖4所示，隨著Na2CO3濃度的增加，牛肉的蒸煮損失顯著下降(P<0.05)，保水性增強,肌肉的保水性與pH值密切相關(guān)[26]。肌原纖維蛋白質(zhì)的等電點約為5.2～5.4，未注射Na2CO3溶液的空白牛肉樣品pH為5.5，略高于蛋白質(zhì)等電點，隨著Na2CO3注射濃度的提高，牛肉pH值逐漸偏離等電點提高。隨著肌肉pH值升高且逐漸偏離肌原纖維蛋白質(zhì)等電點(5.0～5.2)，蛋白質(zhì)表面負電荷增加，形成了更多與水分子結(jié)合的氫鍵位點，肌原纖維蛋白吸水膨脹；同時隨著負電荷的增加，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力增加，引起肌絲的相互排斥，肌原纖維膨脹變粗，肌纖維間的間隙增大，更多的水被保留下來[27-28]。

圖4 不同濃度NaCO3溶液對牛肉保水性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of sodiumcarbonate solution on water-holding capacity of beef

2.7 不同濃度Na2CO3對牛肉色澤的影響

色澤是影響消費者選擇肉制品最直觀的指標，受到很多因素(如保水性、pH值等)的影響[29]。圖5為牛肉色澤隨Na2CO3濃度變化的關(guān)系。由圖5可以看出隨著Na2CO3濃度的增加，牛肉的亮度值(L*)逐漸升高，當Na2CO3濃度為0.40 mol/L時，L*值最高，濃度為0.35 mol/L時，L*值次之且兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)；牛肉的紅度值(a*)隨Na2CO3濃度的增加而降低，這說明高濃度Na2CO3在一定程度上會影響肉色；黃度值(b*)隨著Na2CO3濃度的增大而減小，但各個樣品b*值之間沒有顯著性差異(P>0.05)，因此不建議使用高濃度Na2CO3對牛肉進行處理。

圖5 不同濃度的Na2CO3溶液對牛肉色澤的影響Fig.5 Effect of sodium carbonate solution ofdifferent concentration on beef color

2.8 不同濃度Na2CO3對牛肉橫向馳豫時間的影響結(jié)果分析

低場核磁共振橫向馳豫時間是反應樣品中水分遷徙的一個重要指標，通常用結(jié)合水(T21)、不易流動水(T22)和自由水(T23)來表示[30]。由圖6可以看出，結(jié)合水的橫向弛豫時間T21與峰面積比例都沒有顯著變化；添加了Na2CO3的樣品的不易流動水的橫向弛豫時間T22顯著增大，且隨著Na2CO3濃度的增大而持續(xù)向右偏移，這說明添加Na2CO3后樣品中不易流動水的組織結(jié)合比較疏松，移動性增強；但從峰面積比例上看，隨著Na2CO3濃度的增加，樣品不易流動水的峰面積比例顯著增加，當Na2CO3濃度達到0.35 mol/L時峰面積比例最大，隨后，峰面積比例減小。這可能是因為膠原蛋白變型溶解形成凝膠，阻止了不易流動水從肌纖維中流出形成自由水；添加Na2CO3樣品的自由水橫向弛豫時間及比例同樣顯著增大，則可能是因為樣品pH值遠離蛋白質(zhì)等電點增大，蛋白質(zhì)表面負電荷增多，肌纖維間斥力增強，導致纖維間隙變大，可以容納更多的自由水[31]。

圖6 不同濃度Na2CO3溶液注射后牛肉的NMR結(jié)果Fig.6 NMR results of beef after injection of sodiumcarbonate solution of different concentrations

2.9 感官評價

感官分析是體現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)最直觀的指標，可以清楚地表明消費者對產(chǎn)品的接受程度。表3數(shù)據(jù)分析可得隨著注射濃度的增大，消費者對于產(chǎn)品的色澤接受度是持續(xù)下降的，這說明Na2CO3在一定程度上會影響牛肉的色澤。消費者對于牛肉香氣的評定沒有呈現(xiàn)出一種顯著的規(guī)律，這說明Na2CO3對于牛肉香氣幾乎沒有影響。滋味、嫩度和多汁性是影響牛肉品質(zhì)的重要指標，由表3數(shù)據(jù)可以看出，這3種指標都隨著Na2CO3濃度的增大而有顯著的提高(P<0.05)，當Na2CO3濃度達到0.35 mol/L后，滋味、嫩度和多汁性評分雖然略有提高，但與0.35 mol/L時沒有顯著變化(P>0.05)。添加Na2CO3后，消費者對牛肉的整體可接受度是顯著上升的(P<0.05)。

3 結(jié)論

Na2CO3注射能有效改善牛肉嫩度，提高牛肉保水性。濃度為0.35 mol/L的Na2CO3嫩化效果較好，且對牛肉品質(zhì)影響較小。Na2CO3可以使肌肉pH值偏離等電點提高從而提高保水性，加大肌纖維之間的空隙；破壞肌纖維結(jié)構(gòu)，使肌纖維小片化指數(shù)增加；改變結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，降低膠原蛋白膠聯(lián)，這是Na2CO3嫩化作用的主要機理。Na2CO3嫩化效果顯著、安全無害、成本低廉，是一種前景優(yōu)良的新型嫩化劑。研究Na2CO3注射對牛肉嫩化效果及對肌纖維與結(jié)締組織的影響，為新型牛肉嫩化技術(shù)的研究提供了參考和理論依據(jù)。

表3 不同濃度Na2CO3溶液注射后牛肉的感官分析結(jié)果Table 3 Sensory analysis of beef after injection of sodium carbonate solution of different concentrations

注：上標字母表示不同注射濃度間差異顯著(P<0.05)。