根瘤菌多糖的發(fā)酵優(yōu)化及抗腫瘤活性

賈玉香，耿曉琦，黃正梅，杜鵬，鄭宇，宋佳*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津， 300457)2(德州昂立達(dá)生物技術(shù)有限公司，山東 德州，253000)

根瘤菌胞外多糖(extracellcer polysaccharides ofRhizobium，REPS)[1-3]是根瘤菌屬在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的胞外多糖，是由一定數(shù)目的重復(fù)單位聚合而成的不均一微生物多糖。微生物多糖具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能，如具有促進(jìn)S180荷瘤小鼠的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增生的作用[4]、抗氧化作用[5-7]和免疫活性[8-11]等。但是跟大多數(shù)微生物多糖一樣，產(chǎn)量低依然是根瘤菌多糖應(yīng)用受限的因素之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)微生物多糖的發(fā)酵優(yōu)化做了大量研究[12-16]，單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)是優(yōu)化發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)方法，適用于碳氮源和發(fā)酵條件的優(yōu)化，而對(duì)于多因素多水平的大批量實(shí)驗(yàn)，通常采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)優(yōu)化法[17]，如Plackett-Burman設(shè)計(jì)法、全因子實(shí)驗(yàn)法、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法、隨機(jī)平衡法、正交設(shè)計(jì)法、均勻設(shè)計(jì)法等和非數(shù)理統(tǒng)計(jì)優(yōu)化法，而眾多實(shí)驗(yàn)表明Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是最為準(zhǔn)確和有效的，實(shí)用性強(qiáng)[18-19]。Plackett-Burman法[20]是一種以不完全平衡塊為原理的部分析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)法，適用于從眾多的考察因素中篩選出最為重要的幾個(gè)因素，并且快速有效。本研究中，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，在眾多因素中篩選影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，進(jìn)而采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)[21]得到最優(yōu)添加量組合，得到根瘤菌多糖的最適發(fā)酵條件，并探究其抗腫瘤活性，為根瘤菌多糖的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

RhizobiumNG10 (中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC 10579)，保藏于天津科技大學(xué)微生物制藥研究室。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，瓊脂20。種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 5，pH 6.8～7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 10，K2HPO40.25， MgSO4·7H2O 0.2，酵母提取物 1，NaCl 0.1，pH 6.8～7.0。DMEM培養(yǎng)基：DMEM復(fù)合培養(yǎng)基粉末，青霉素100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL，胎牛血清10 %，PBS緩沖液配制，pH 7.4。

1.3 儀器與設(shè)備

TGL-16 G臺(tái)式高速離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；754 PC紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海菁花科技有限公司；Alpha 2-4 LD plus快速冷凍干燥機(jī)，德國(guó)chirst公司；HH.CP-T型01A CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SYNEK GY4多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek。

1.4 主要試劑

酵母提取物，英國(guó)DXOID公司；胰蛋白胨，英國(guó)DXOID公司；酵母膏、酵母浸粉、大豆蛋白胨、蛋白胨(均為分析純)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；H3PO4、乙醇、NaCl、KH2PO4、苯酚、濃H2SO4(均為分析純)：天津化學(xué)試劑二廠；葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、果糖、蔗糖、MgSO4·7H2O(均為分析純)，天津市耀華化工廠；三氯甲烷(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；正丁醇(分析純)，天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；人肝癌細(xì)胞株Hep G2，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(均為分析純)，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，美國(guó)GIBCO公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，去離子水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.1 g/L得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL,分別置于具塞試管中加水至1.0 mL，各加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，置冰水浴中加濃H2SO45 mL，搖勻，置30 ℃水浴中保溫30 min，取出后冷卻至室溫，于490 nm測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 多糖的提取及含量測(cè)定

將發(fā)酵培養(yǎng)至穩(wěn)定期的根瘤菌發(fā)酵液離心除去菌體，濃縮至一定體積后加入4倍體積無(wú)水乙醇于4℃過(guò)夜醇沉，取沉淀部分加水復(fù)溶，用Sevage法除蛋白，Sevage試劑與多糖溶液的體積比為1∶4，反復(fù)除蛋白數(shù)次后，分離Sevage試劑，再經(jīng)乙醇洗滌后，加水復(fù)溶，用去離子水透析48 h，然后將多糖溶液在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，經(jīng)鑒定260和280 nm處無(wú)吸收峰后表明蛋白已除凈，收集多糖溶液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中多糖含量。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別以麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇為碳源，質(zhì)量濃度為10 g/L，其他成分與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基相同，于100 mL/250 mL搖瓶中接種對(duì)數(shù)期根瘤菌菌液1 %，置于28 ℃ 180 r/min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72 h，按苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量，每種碳源做3組平行。

在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以大豆蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸銨、酵母提取物為氮源，質(zhì)量濃度為1 g/L，其余條件相同，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定多糖含量，每種氮源做3組平行。

1.6.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)碳氮源的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用SAS Version 8.0.2 軟件設(shè)計(jì)8因素2水平實(shí)驗(yàn)方案，采用該方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并采用SAS Version 8.0.2 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理，以篩選培養(yǎng)基各成分中對(duì)多糖產(chǎn)量影響最為顯著的若干因子。

1.6.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

在PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用SAS Version 8.0.2 軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案，獲得最優(yōu)組合，根據(jù)該方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，針對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析以獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

1.7 體外抗腫瘤[22]實(shí)驗(yàn)

將人肝癌細(xì)胞Hep G2于DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞Hep G2，稀釋細(xì)胞濃度至1.0×105個(gè)/mL，分別移取150 μL細(xì)胞懸液于96孔板中，貼壁培養(yǎng)4 h，加入50 μL不同濃度的多糖溶液(質(zhì)量濃度分別為20，50，100，200，500和1 000 μg/mL)，分別在培養(yǎng)24和48 h后，加入20 μL MTT試劑(5 g/L)，混勻，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，移除孔板中液體，每孔加入200 μL DMSO振蕩培養(yǎng)10 min，溶解結(jié)晶，于570 nm測(cè)吸光值?？瞻讓?duì)照組為DMEM培養(yǎng)基，每組實(shí)驗(yàn)組均有8個(gè)復(fù)孔。多糖對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制率計(jì)算公式(1)如下：

(1)

式中：A0為空白組在570 nm處的吸光值，A1為實(shí)驗(yàn)組在570 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取及含量測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的線性回歸方程為:y=0.077 3+5.67x(R2=0.995 6)。初始發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，發(fā)酵至穩(wěn)定期(48 h)時(shí)，根瘤菌胞外多糖產(chǎn)量為3.46 g/L。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

對(duì)于碳氮源篩選的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和圖2所示，不同碳源對(duì)多糖產(chǎn)量均有顯著性影響(P<0.05)，碳源為麥芽糖時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最高為3.62 g/L；大豆蛋白胨、酵母浸粉和酵母膏對(duì)多糖產(chǎn)量影響顯著(P<0.05)，以大豆蛋白胨作氮源時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量為4.23 g/L。顯然，麥芽糖和大豆蛋白胨為最優(yōu)碳氮源。

圖1 不同碳源條件下根瘤菌產(chǎn)胞外多糖含量Fig.1 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different carbon sources注：與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比，*代表P<0.05。下同。

圖2 不同氮源條件下根瘤菌產(chǎn)胞外多糖含量Fig.2 Content of extracellular polysaccharides producedby Rhizobium NG10 with different nitrogen sources

2.2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用PB實(shí)驗(yàn)(麥芽糖、大豆蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl和CaCl27個(gè)因素分別以X1～X7表示，及一個(gè)X8虛擬項(xiàng))，篩選出對(duì)根瘤菌發(fā)酵所得期望值(Y值)影響顯著的因素。其中，各個(gè)因素的水平設(shè)置及結(jié)果如表1所示，對(duì)所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行一元線性回歸分析得多元一次方程：Y=3.89+0.17×X1-0.38×X2+0.23×X3-0.03×X4+0.11×X5+0.14×X6-0.047×X7+0.095×X8。

評(píng)價(jià)模型的擬合度需要參考決定系數(shù)(R2)，R2值越接近1，模型就越能用來(lái)預(yù)測(cè)響應(yīng)值。該模型的相關(guān)系數(shù)R2= 0.973 5(表2)，說(shuō)明97.35 %的期望值變化可以用這一模型解釋，模型擬合度較好。采用常規(guī)的F檢驗(yàn)方法對(duì)模型再次進(jìn)行分析，可知其線性模型的P值為0.026 9<0.05，說(shuō)明模型顯著可靠，能很好地描述實(shí)驗(yàn)因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。軟件分析得到的回歸分析結(jié)果如表2所示。可見(jiàn)，各考察因素的重要性依次為X2>X3>X1>X6>X5>X8>X7>X4。其中最顯著的3個(gè)因素為大豆蛋白胨(X2)，K2HPO4(X3) 和麥芽糖(X1)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 1 The design matrix and the results of Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 2 Regression analysis results of Plackett-Burman design experiment

2.2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以PB實(shí)驗(yàn)設(shè)定值為中心點(diǎn)，采用SAS Version 8.0.2軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案如表3所示，進(jìn)一步優(yōu)化麥芽糖、大豆蛋白胨、KH2PO4添加量的水平，獲得最佳培養(yǎng)基配方。根據(jù)該方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，針對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析以獲得最優(yōu)培養(yǎng)基配方。采用SAS Version 8.0.2對(duì)實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到多元二次回歸方程：Y=4.98+0.13×U1-0.09×U2+0.08×U3-0.25×U1×U1+0.11×U1×U2-0.002×U1×U3-0.71×U2×U2-0.007×U2×U3-0.06×U3×U3。

采用t檢驗(yàn)對(duì)模型的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表4所示。模型決定系數(shù)R2為0.980 1，說(shuō)明98.01 %的期望值變化可以用這一多項(xiàng)式解釋。此外，該分析模型P<0.001證明了二次回歸模型高度顯著。模型的失擬項(xiàng)的F值和P值分別為7.23和0.123 8，證明失擬項(xiàng)不顯著。一次項(xiàng)(U1、U2)，二次項(xiàng)(U1U1、U2U2)對(duì)響應(yīng)值的影響高度顯著，P<0.05。軟件得出最大響應(yīng)值及其對(duì)應(yīng)U1、U2、U3的編碼值，可得根瘤菌(RhizobiumNG10, CICC 10579)最佳培養(yǎng)基配方(g/L)為：麥芽糖22.5，大豆蛋白胨9.5，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO40.41，NaCl 0.1，在此條件下，胞外多糖產(chǎn)量為5.05 g/L，比原始提高了45.95 %。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 3 The design matrix and the results of Box-Behnken design

2.3 體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，考察不同給藥劑量分別在24與48 h對(duì)Hep G2細(xì)胞增值抑制的效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同濃度根瘤菌多糖對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制作用Fig.3 Antitumor activity(Hep G2) of Rhizobiumpolysaccharide with different concentrations注：與對(duì)照組相比，**代表P<0.01；***代表P<0.001。

由圖3可知，REPS顯示出良好的抗腫瘤活性，在給藥濃度≥50 μg/mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，多糖對(duì)肝癌細(xì)胞有顯著的抑制作用。在一定范圍內(nèi)，REPS對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2的抑制作用隨著多糖濃度的升高而增大，隨著劑量、給藥時(shí)間的增加，細(xì)胞增殖能力逐漸降低；在多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1 000 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到56.74 %。采用MTT法計(jì)算IC50值，結(jié)果顯示給藥24 h，REPS對(duì)Hep G2的IC50值為624.2 μg/mL，給藥48 h，REPS對(duì)Hep G2的IC50值為393.3 μg/mL，發(fā)現(xiàn)REPS具有良好的抗腫瘤活性。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of Box-Behnken design

3 結(jié)論

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，得到優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為麥芽糖22.5 g/L，大豆蛋白胨9.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO40.41 g/L，NaCl 0.1g/L，在此條件下，最高胞外多糖產(chǎn)量5.05 g/L；在此基礎(chǔ)上進(jìn)行根瘤菌胞外多糖的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，從體外實(shí)驗(yàn)可以看出，根瘤菌胞外多糖REPS對(duì)肝癌細(xì)胞Hep G2有良好的抑制作用，并且一定范圍內(nèi)存在量效關(guān)系。

本文雖然較大程度上提高了根瘤菌NG 10(CICC 10579)的胞外多糖產(chǎn)量，但影響其產(chǎn)量的因素還有很多，對(duì)其產(chǎn)糖能力還有待進(jìn)一步挖掘。近20年來(lái)，人們對(duì)植物與真菌活性多糖進(jìn)行了大量研究，并取得較大進(jìn)展，然而對(duì)于細(xì)菌活性多糖的研究卻較少。根瘤菌胞外多糖的研究前景十分廣闊，包括其信號(hào)功能，免疫調(diào)節(jié)功能以及抗腫瘤功能，可以說(shuō)根瘤菌多糖的價(jià)值很高。希望未來(lái)對(duì)根瘤菌胞外多糖的研究能更進(jìn)一步，發(fā)揮出它在生產(chǎn)及生活中的價(jià)值。