酶法制備鱘魚皮膠原蛋白多肽及其抗氧化活性研究

李露園，王升帆，朱有貴，章銀軍，汪釗，鄭建永*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州，310032)2(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興，312500)

膠原蛋白是一種重要的功能性多糖蛋白質(zhì)，與細(xì)胞再生分化等有密切關(guān)系[1]。膠原蛋白肽是膠原蛋白的降解產(chǎn)物，由3～20個(gè)氨基酸組成[2]，具有抗菌、抗氧化、降血壓血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[3-5]。與膠原蛋白相比，膠原蛋白肽分子質(zhì)量小、水溶性強(qiáng)、易消化吸收。因其顯著的生理活性，廣泛應(yīng)用于食品，醫(yī)藥，化妝品等領(lǐng)域。與哺乳動(dòng)物相比，魚類膠原蛋白在來(lái)源的廣泛性、生物安全性和產(chǎn)品成本等方面均具有更大的優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外研究者已成功從魚皮[6]、魚骨[7]、魚鱗[8]等副產(chǎn)物中制備膠原蛋白肽。

中國(guó)是世界上鱘魚種類較多的國(guó)家，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%以上[9]。鱘魚目前主要用于魚子醬的生產(chǎn)，在生產(chǎn)加工過(guò)程中魚皮、魚鱗和內(nèi)臟等副產(chǎn)物利用率低，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題[10]。因此利用酶法將鱘魚皮膠原蛋白轉(zhuǎn)化為生物活性肽具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。本文采用堿性蛋白酶水解鱘魚皮，通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化鱘魚皮制備膠原蛋白肽的制備工藝，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，旨在為鱘魚皮的高值化加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西伯利亞鱘魚皮，由浙江新昌來(lái)益生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，除去魚肉及非膠原組織后剪成約 2 cm×2 cm的塊狀，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；堿性蛋白酶(1.69×105U/g)，丹麥諾維信公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AE323型電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK8S型消化爐、UDK152型定氮儀，意大利VELP公司； DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠；SX2-4-10型馬沸爐，江蘇駿輝電器源頭廠；索氏抽提器，上海壘固儀器有限公司；Ultrospec 2100 pro型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)GE公司；SYKAM S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam公司；Waters 1525型液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Zenix-c SEC-80型色譜柱，蘇州賽分科技有限公司；10000/5000/1000 Da超濾膜，美國(guó)密理博公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本成分分析

采用直接干燥法[12]測(cè)定水分含量；采用凱氏定氮法[13]測(cè)定粗蛋白含量,氮換算系數(shù)為6.25; 采用羥脯氨酸測(cè)定法[14]測(cè)定膠原蛋白含量，膠原蛋白與羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化系數(shù)為14.113; 采用索氏抽提法[15]測(cè)定粗脂肪含量;采用高溫馬沸爐灼燒法[16]測(cè)定灰分含量。采用石油醚回流提取法除去魚皮中的脂肪，于70℃下?lián)]發(fā)除去石油醚。取0.2 g試樣于水解管中，向其中加入12 mL 6 mol/L的HCl擰緊水解管螺絲蓋，放入110℃烘箱中水解24 h。取出待其冷卻至室溫，將水解液經(jīng)濾紙過(guò)濾至50 mL容量瓶中，用水進(jìn)行多次潤(rùn)洗水解管一并過(guò)濾至容量瓶中，最后定容、混勻，水解液分析前稀釋5～10倍。經(jīng)氨基酸分析儀進(jìn)行魚皮中蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析。

1.3.2 鱘魚皮預(yù)處理

將魚皮經(jīng)絞肉機(jī)攪碎,自來(lái)水清洗，紗布過(guò)濾洗去游離的脂肪。采用英國(guó)丹尼悅公司DENIE-DEG NL-L脂肪酶對(duì)鱘魚皮進(jìn)行脫脂處理，脂肪酶添加量為0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，在pH 8，溫度35℃，攪拌速度200 r/min的條件下處理3 h。利用1 mol/L NaCl溶液，在料液比1∶5(g∶mL)，低溫條件下攪拌12 h，以去除鱘魚皮中雜蛋白。

1.3.3 酶解工藝研究

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

以水解度(degree of hydrolysis，DH)為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別研究料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)(g∶mL)、酶解溫度(40、45、50、55、60℃)、pH(7、8、9、10、11)、反應(yīng)時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)、酶添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%)對(duì)水解度的影響。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)水解度影響較強(qiáng)的4個(gè)因素(溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、酶添加量)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.4 鱘魚皮膠原蛋白肽分子質(zhì)量分析

基于多肽分子質(zhì)量與自身的體積具有正相關(guān)性，利用高效凝膠排阻色譜法對(duì)酶解制備的多肽進(jìn)行凝膠排阻分離測(cè)定其分子質(zhì)量分布情況。色譜條件如下，凝膠色譜柱：Zenix-c SEC-80(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60∶0.05；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

標(biāo)準(zhǔn)品分別為抑肽酶(6 512 Da)、VB12(1 355 Da)、醋酸血管緊張素(1 091 Da)、谷胱甘肽(307 Da)、甲硫氨酸(149 Da)。在液相色譜條件相同的條件下，以相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)對(duì)色譜保留時(shí)間作線性回歸曲線，并對(duì)該曲線進(jìn)行校正計(jì)算出線性回歸方程。將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正后的線性回歸方程計(jì)算出樣品中多肽的分子質(zhì)量大小及分布情況。

1.3.5 超濾分離

酶解液通過(guò)截留分子質(zhì)量分別10 000、5 000、1 000 Da的超濾膜進(jìn)行超濾分離?？刂莆锪线M(jìn)口壓力<0.4 MPa,收集各截留組分，分別命名為酶解分子質(zhì)量組分(分子質(zhì)量>10 000 Da) SSCP-I、(分子質(zhì)量=5 000～10 000 Da) SSCP-II、(分子質(zhì)量=1～5 000 Da) SSCP-III、(分子質(zhì)量<1 000 Da) SSCP-Ⅳ，將4個(gè)不同分子質(zhì)量的組分進(jìn)行冷凍干燥制備。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

將上述4個(gè)組分的鱘魚皮膠原蛋白肽凍干粉分別配制成質(zhì)量濃度為1、3、5、10、15、20、25 g/L的溶液。采用鄰苯三酚法[17]，取上述樣品溶液0.1 mL(對(duì)照組用水代替)置于2.0 mL的EP管中,加入1.3 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.20)振蕩混合，于 25℃水浴保溫 10 min；加入0.1 mL已預(yù)熱10 min的3 mmol/L鄰苯三酚溶液(鄰苯三酚用10 mmmol/L HCl配制)快速搖勻后于320 nm處每隔30 s測(cè)定1次OD值，總時(shí)間為3 min，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算如公式(1):

(1)

式中：S，超氧陰離子自由基清除率；V0，對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率；V1，樣品組鄰苯三酚自氧化速率。

1.3.6.2 DPPH自由基的清除試驗(yàn)

將4個(gè)組分的鱘魚皮膠原蛋白肽凍干粉用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為1、3、5、10、15、20 g/L的樣品溶液。另外用50%的乙醇溶液配制質(zhì)量濃度為1、3、5、10、15、20、25、30 μg/mL的BHT溶液。按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行DPPH自由基清除試驗(yàn)[18]。試驗(yàn)結(jié)果用清除率CR來(lái)表示,如公式(2)：

(2)

式中：A1，樣品組；A0，對(duì)照組。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0軟件，圖形數(shù)據(jù)采用Origin Pro 8.5軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘魚皮的基本成分分析

鱘魚皮的主要組成成分(濕重計(jì))如表1所示。鱘魚皮中水分含量較高，為 56.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右。其粗蛋白含量較高，為36.3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右。膠原蛋白含量高達(dá)29.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，占總蛋白含量約81%，因此可以作為膠原蛋白肽的制備原料。而鱘魚皮脂肪含量較高，約為4.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))左右。另外魚皮中含灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.4%。

表1 鱘魚皮的基本成分Table 1 The basic components of sturgeon skin

鱘魚皮經(jīng)6 mol/L HCl徹底水解后，產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析儀分析，結(jié)果如表2所示。由表2可知，鱘魚皮蛋白被檢測(cè)出19種氨基酸，其中含量最多的氨基酸按順序依次為Gly、Ala、Pro，而Gly含量最高為34.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，占膠原蛋白含量約1/3。這完全符合膠原蛋白Gly-x-y的結(jié)構(gòu)組成特點(diǎn)[19]。

表2 鱘魚皮蛋白氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of sturgeon skin protein

注：Asx表示天冬酰胺(Asu)、天冬氨酸(Asn)；Glx表示谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)。

從氨基酸種類分析，由表3可知，鱘魚皮蛋白中疏水氨基酸含量較高，約31.7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，CHEN等[20]與MENDIS等[21]研究表明疏水性氨基酸對(duì)抗氧化活性起著重要作用。此外，魚皮中8種必須氨基酸總(質(zhì)量分?jǐn)?shù))達(dá)15.7%，這可為人體提供豐富的營(yíng)養(yǎng)，也進(jìn)一步說(shuō)明鱘魚皮膠原蛋白具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

表3 鱘魚皮氨基酸組成分類Table 3 Classification amino acid composition in sturgeon skin protein

2.2 堿性蛋白酶酶解鱘魚皮制備膠原蛋白肽單因素試驗(yàn)

在1∶2至1∶7考察料液比對(duì)水解度的影響，結(jié)果如圖1-a所示。隨著料液比的變化，水解度在18%左右，基本沒(méi)有變化。這表明料液比在一定的比例范圍內(nèi)對(duì)水解度的影響不大。圖1-b表明，pH值為 9.0時(shí)，水解度最大。這與SUTTIWICHAIPORN等[22]的試驗(yàn)結(jié)果一致，當(dāng)使用堿性蛋白酶水解鱘魚的pH為9.0時(shí)，水解度最大。這可能是由于酶具有最適pH，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性，降低酶的活力。如圖1-c所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，水解度呈先上升后下降的趨勢(shì)。過(guò)高的溫度會(huì)引起酶的變性失活，因此最佳反應(yīng)溫度為55℃。這與MAHMOUDREZA[23]研究結(jié)果一致，堿性蛋白酶的最適溫度為55℃。較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間有利于酶對(duì)魚皮起更廣泛的作用。由圖1-d可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度越來(lái)越高。然而，超過(guò)4 h后水解度沒(méi)有顯著增加。基于所得結(jié)果，最佳反應(yīng)時(shí)間為4h。蛋白酶添加量對(duì)水解度的影響如圖1-e所示。水解度隨酶添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。這可能是由于酶量的增加抑制了底物擴(kuò)散，反而使反應(yīng)速率降低。因此，該堿性蛋白酶酶解鱘魚皮的最佳添加量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

2.3 堿性蛋白酶酶解鱘魚皮制備膠原蛋白肽正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)分析各個(gè)因素之間的相互關(guān)系，最終確立堿性蛋白酶水解鱘魚皮的最佳酶解條件。由于在單因素試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，料液比在一定的比值范圍內(nèi)使堿性蛋白酶對(duì)鱘魚皮的水解程度并沒(méi)有產(chǎn)生明顯的影響，所以在設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)時(shí)只考慮酶解pH、溫度、時(shí)間、酶添加量這4個(gè)因素。以水解度為分析指標(biāo)，正交試驗(yàn)的結(jié)果如表4所示。由極差R得知，各因素對(duì)魚皮水解度的影響程度順序依次為：pH>溫度>酶添加量>時(shí)間，所選的因素中pH對(duì)水解度的影響較為顯著。由正交試驗(yàn)得出最佳酶解條件：pH 9，溫度55℃，時(shí)間5 h，酶添加量3%。根據(jù)正交試驗(yàn)得到的最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3組平行試驗(yàn)3次計(jì)算出水解度為22.0%。

2.4 鱘魚皮膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布

酶解反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行高效凝膠排阻色譜檢測(cè)鱘魚皮膠原蛋白肽分子質(zhì)分布情況。由圖2可知，在最佳酶解工藝條件下，水解液中多肽的分子質(zhì)量基本在5 000 Da以下，分子質(zhì)量分布在500～3 000 Da的多肽含量高，并且分子質(zhì)量在1 000 Da以下的含量高達(dá)67%。研究表明分子質(zhì)量越小的短肽具有更好的水溶性，易于被人體腸胃吸收并直接利用，分子質(zhì)量越小的多肽尤其是二肽、三肽等寡肽根據(jù)氨基酸組成以及排列順序的不同，具有非常重要的生物活性[24]。

a-料液比對(duì)水解度的影響;b-pH對(duì)水解度的影響;c-溫度對(duì)水解度的影響;d-反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響;e-酶添加量對(duì)水解度的影響圖1 料液比、pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間和酶添加量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio, pH, temperature, reaction time and enzyme concentration on the degree of hydrolysis

表4 鱘魚皮膠原蛋白肽制備工藝的L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of L9 (34) orthogonal experiment for preparation of collagen polypeptide from sturgeon skin

圖2 鱘魚皮膠原蛋白肽的分子質(zhì)量分布Fig.2 Molecular weight distribution of collagenpeptide in the skin of sturgeon

2.5 鱘魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性試驗(yàn)

2.5.1 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

超氧陰離子是由人體內(nèi)線粒體的電子傳遞而產(chǎn)生的人體第一個(gè)氧化自由基，過(guò)量的超氧陰離子將導(dǎo)致細(xì)胞的損傷[25]。本文對(duì)超濾分離得到的4種組分在不同濃度下，通過(guò)鄰苯三酚自氧化進(jìn)行超氧陰離子自由基的清除試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 不同分子質(zhì)量SSCP對(duì)超氧陰離子自由基清除效果Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activityof different molecular weight of SSCP

由圖3可知，4種不同分子質(zhì)量范圍的魚皮膠原蛋白肽都具有一定的超氧陰離子自由基的清除能力，并且隨著各自濃度的升高，清除超氧陰離子的能力也隨之增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)20 g/L時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力增強(qiáng)趨勢(shì)開始趨緩；通過(guò)OriginPro8.5軟件數(shù)據(jù)擬合4種組分的半抑制濃度(IC50)分別為8.918 g/L(SSCP-Ⅰ)、7.051 g/L(SSCP-Ⅱ)、5.938 g/L(SSCP-Ⅲ)、7.050 g/L (SSCP-Ⅳ)。所以SSCP-Ⅲ(分子質(zhì)量=1 000～5 000 Da)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng)。這與KIM等[26]對(duì)阿拉斯加鱈魚皮明膠酶解液進(jìn)行超濾膜反應(yīng)器分離,最終與確定相對(duì)分子質(zhì)量分布在1 500～4 500 Da的多肽具有較高的超氧陰離子自由基清除活性的結(jié)論相符合。

2.5.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

由于DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，能與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失。DPPH醇溶液的褪色程度與自由基清除劑自身提供的電子數(shù)量成定量關(guān)系。經(jīng)超濾分離的4種鱘魚皮膠原蛋白肽組分分別在不同濃度下對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖4所示。

圖4 不同分子質(zhì)量SSCP對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.4 DPPH radical scavenging activity of differentmolecular weight of SSCP

由圖4可知，4種不同分子質(zhì)量的酶解液SSCP對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著各自濃度的升高而增強(qiáng)。在質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，4種不同分子質(zhì)量的SSCP對(duì)DPPH的清除能力大小順序?yàn)镾SCP-Ⅳ(分子質(zhì)量<1 000 Da)>SSCP-Ⅲ(分子質(zhì)量=1 000～5 000 Da)>SSCP-Ⅱ(分子質(zhì)量=5 000～10 000 Da)>SSCP-Ⅰ(分子質(zhì)量>10 000 Da)。這表明分子質(zhì)量越小的多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果越好[27]。此外，由圖5可知，BHT在質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)65.1%，而對(duì)DPPH自由基清除活性最佳的SSCP-Ⅳ(分子質(zhì)量<1 000 Da)在濃度為20 g/L時(shí)清除率只有32.8%，明顯低于BHT陽(yáng)性對(duì)照。

圖5 BHT對(duì)DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH radical scavenging activity of BHT

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)得到堿性蛋白酶酶解鱘魚皮膠原蛋白的最佳酶解工藝：酶解溫度55℃，pH 9，酶添加量3%，酶解時(shí)間5 h。對(duì)最佳酶解工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，該酶解條件下水解度為22.0%。酶解液的不同分子質(zhì)量組分抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，SSCP-Ⅲ(分子質(zhì)量=1 000～5 000 Da)組分對(duì)超氧陰離子具有最強(qiáng)的清除能力，半抑制清除濃度IC50為5.938 g/L。本研究為鱘魚皮及其相關(guān)資源的加工和高值化利用提供了理論依據(jù)，對(duì)膠原蛋白肽的抗氧化活性進(jìn)行初步分析，其抗菌、改善皮膚、增強(qiáng)免疫力和降血壓等生物活性有待進(jìn)一步研究。