綠色熒光蛋白標(biāo)記植物乳桿菌及其生物學(xué)特性分析

陳彩玲，毛丙永，崔樹茂，趙建新

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

乳桿菌不僅能夠通過發(fā)酵提高食品的營養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味[1-2]，而且能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、保持微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫作用[3-4]。目前乳桿菌的研究大多關(guān)注宿主的生理、疾病以及菌群等的變化，對于其在胃腸道中的分布、數(shù)量、運(yùn)動(dòng)及它們的定植情況缺乏系統(tǒng)性、針對性的機(jī)理研究。王晶等[5]的研究表明,無法真正區(qū)分進(jìn)入腸道的菌屬于內(nèi)源菌還是外源菌，因此這在一定程度上限制了對作用機(jī)理的深入研究。

關(guān)于菌株定植能力的研究，一般選擇小鼠、人體、模擬反應(yīng)器等實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚6-8]，灌胃或飲食的方式攝入，收集糞便或腸道內(nèi)容物后通過平板培養(yǎng)[9]、熒光原位雜交[10]和實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11]，但這些技術(shù)存在著操作繁瑣、準(zhǔn)確度低或費(fèi)用高等缺陷。近年來，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為一種理想的活體熒光標(biāo)記分子，越來越多地被用于活細(xì)胞或微生物的定位、結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的研究[12]。GFP已經(jīng)在許多細(xì)菌中完成了轉(zhuǎn)化，王晶等[13]利用GFP追蹤了乳酸乳球菌WH-C1在小鼠腸道內(nèi)的定植情況；YU等[14]通過GFP標(biāo)記發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌D17嵌入在黏液層中，局部接近腸道的上皮細(xì)胞；GEOFFROY等[15]構(gòu)建了含有GFP的組成型和Nisin誘導(dǎo)型的質(zhì)粒并導(dǎo)入植物乳桿菌WCFS1中，用來研究WCFS1在腸道內(nèi)的定植與分布。

本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵食品中分離得到1株有明顯益生作用的植物乳桿菌CCFM8610，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CCFM8610處理可有效降低腸道鎘的吸收，減少組織中鎘的積累，減輕腎臟和肝臟的氧化應(yīng)激[16]。為進(jìn)一步研究該菌株在腸道內(nèi)的定植規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)室成功對包括CCFM8610在內(nèi)的4株植物乳桿菌進(jìn)行GFP熒光標(biāo)記。本研究對這4株植物乳桿菌的出發(fā)菌株和重組菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較研究，為植物乳桿菌在腸道中分布和定植規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗(yàn)用植物乳桿菌分離自發(fā)酵食品和健康人糞便，保藏于江南大學(xué)食品生物技術(shù)菌種保藏中心；所用菌株、質(zhì)粒及引物見表1。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉2 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.5 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂粉，在115℃滅菌20 min。培養(yǎng)重組菌株的培養(yǎng)基中，添加終質(zhì)量濃度為10 μg/mL的氯霉素，以0.22 μm無菌濾膜過濾。

TIAN prep Mini Plasmid kit聚合酶、TaqDNA聚合酶,上?？魄缟锟萍加邢薰荆凰锌股仡愒噭?、胃蛋白酶,生工生物工程(上海)股份有限公司；膽鹽,英國Oxoid公司；其他實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

表1 本研究所用菌株、質(zhì)粒及引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

PBS緩沖液：Na2HPO42.13 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，攪拌溶解后，調(diào)pH值到7.4，定容至1 L，在115℃ 滅菌20 min，配方參考文獻(xiàn)[18]。

乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和電轉(zhuǎn)化溶液：溶液I：136.7 g山梨醇，0.1 g甘氨酸，用MRS培養(yǎng)基定容至1 L，115℃滅菌20 min；溶液Ⅱ：342.3 g蔗糖，0.711 g MgCl2·6H2O，去離子水定容至1 L，115℃滅菌20 min；復(fù)蘇液(SMRS)：136.7 g山梨醇，1.11 g CaCl2，9.52 g MgCl2，用MRS培養(yǎng)基定容至1 L，115℃滅菌20 min，配方參考文獻(xiàn)[18]。

模擬胃液(simulated gastric fluid，SGF)和模擬腸液(simulated intestinal fluid,SIF)：SGF∶將胃蛋白酶(1∶10 000)溶于滅菌的生理鹽水(9 g/L，HCl調(diào)pH值至3.0)中，使終質(zhì)量濃度為3 g/L。以0.22 μm無菌濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用；SIF∶將胰蛋白酶(1∶250)溶于滅菌的生理鹽水(9 g/L，NaOH調(diào)pH值至8.0)中，使終質(zhì)量濃度為1 g/L，并加入膽鹽使終質(zhì)量濃度為3 g/L，以0.22 μm無菌濾膜過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用，配方參考文獻(xiàn)[19-20]。

1.3 儀器與設(shè)備

隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司； UV1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)，上海智誠分析儀器制造有限公司；DM 2000熒光顯微鏡，徠卡儀器(德國)有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀、Universal Hood 2凝膠成像儀，美國伯樂BIO-RAD；多功能微孔板讀數(shù)儀，美國賽默飛世爾科技公司；電轉(zhuǎn)化儀，德國Eppendorf。

1.4 植物乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

按照范璟等[21]先前描述的方法，將活化好的植物乳桿菌，按照1%的接種量接種到新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)過夜；按照2%的接種量接種到10 mL溶液I中，37℃ 培養(yǎng)3 h左右，至OD600≈0.5；5 000×g，4 ℃離心2 min，收集菌體細(xì)胞；用2 mL預(yù)冷的溶液Ⅱ洗滌細(xì)胞，5 000×g，4 ℃離心2 min，去除上清液，反復(fù)洗滌2次；最后用1 mL冰浴的溶液Ⅱ重懸菌體細(xì)胞，用于電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌。

1.5 植物乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法

方法參考文獻(xiàn)[22]，將無菌電轉(zhuǎn)化杯從-20 ℃的冰箱取出后，于冰上預(yù)冷；取50 μL冰浴的感受態(tài)細(xì)胞，加入5 μL質(zhì)粒溶液，輕輕吹吸混勻，于冰上靜置10 min；將上述混合液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)化杯，冰浴10 min；設(shè)置參數(shù)：電壓2 000 V，電容為25 μF，電阻為400 Ω。電轉(zhuǎn)化杯迅速擦干后，放入電擊槽中，進(jìn)行電擊；迅速向轉(zhuǎn)化后的電轉(zhuǎn)化杯中加入950 μL預(yù)冷的SMRS溶液，冰上靜置5 min；將上述液體轉(zhuǎn)移進(jìn)無菌的1.5 mL離心管中，37 ℃靜止培養(yǎng)3 h左右，將培養(yǎng)液涂布到含有10 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上，37℃ 培養(yǎng)48 h，長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。

1.6 PCR驗(yàn)證

菌株按照5 000×g1%的接種量，培養(yǎng)到穩(wěn)定期，取1 mL培養(yǎng)液5 000×g，離心2 min，去除上清，用無菌水洗2遍，再用500 μL無菌水重懸，作為模板。以重組菌株和陰性菌株的菌落為模板，利用引物GF、GR擴(kuò)增GFP基因片段，PCR體系20 μL：2×Taq Mix 10 μL；ddH2O 8 μL；上游引物(25 μmol/L) 0.5 μL；下游引物(25 μmol/L) 0.5 μL；模板DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s；48℃退火30 s；72℃延伸1 min；72℃延伸5 min，2～4步進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 倒置熒光顯微鏡觀察

按照曹春蕾等[23]描述的方法，挑取重組菌株接種于含10 μg/mL氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜；按照1%的接種量接種到新鮮的培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h；5 000×g離心2 min，收集菌體細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，重懸在PBS中；制片后，用熒光顯微鏡觀察。

1.8 熒光強(qiáng)度測定

方法參考文獻(xiàn)[18]，同樣按照1.7的方法收集菌體細(xì)胞，將菌體細(xì)胞重懸于PBS中，取200 μL重懸液加入96 孔酶標(biāo)板中，測定488 nm激發(fā)、535 nm發(fā)射下的熒光值。

1.9 生長曲線測定

將標(biāo)記前后的菌株，按照1%的接種量接種到新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)液按照1%的接種量接種到新的MRS液體培養(yǎng)中，混勻后分裝到提前滅過菌的試管中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，每隔1 h取出1根試管測定OD600的吸光值和熒光強(qiáng)度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D600值、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制曲線。

1.10 胃酸和膽鹽耐受性試驗(yàn)

按照RANADHEERA等[19]先前描述的方法對標(biāo)記前后的植物乳桿菌進(jìn)行模擬胃液(SGF)和模擬腸液(SIF)。將活化好的菌株按照1%的接種量接種到新鮮的培養(yǎng)基中，于37℃恒溫靜置培養(yǎng)至OD600≈2.5，8 000×g，離心5 min收集菌體細(xì)胞；將樣品暴露于模擬胃液2 h，取樣進(jìn)行一式兩份的連續(xù)稀釋和傾注計(jì)數(shù)，以確定總活菌數(shù)；然后將樣品暴露于模擬腸液4 h，同樣進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定總活菌數(shù)，以活菌數(shù)和存活率為縱坐標(biāo)，以不同處理方式為橫坐標(biāo)作圖。

1.11 -80℃凍存2周活菌計(jì)數(shù)

按照方法1.7收集菌體細(xì)胞，并將細(xì)胞重懸于300 g/L的蔗糖的溶液中，放置于-80℃；隔1周取1次樣，進(jìn)行一式兩份的連續(xù)稀釋和傾注計(jì)數(shù)，以確定總活菌數(shù)，以活菌數(shù)和熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。

1.12 低聚果糖利用能力的測定

按照方法1.7收集菌體細(xì)胞，重懸于PBS中。用滅菌后的牙簽蘸取少量的菌液，分別輕輕點(diǎn)在葡萄糖作為唯一碳源的MRS平板和低聚果糖(fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)作為唯一碳源的平板上，與于37℃恒溫靜置培養(yǎng)20 h后，觀察顏色變化。本次試驗(yàn)，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為5 g/L的溴甲酚紫溶液做為指示劑，添加量為15 mL/L。

1.13 抗生素對微生物生長的最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)

方法參考國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10932∶2010(IDF 223∶2010)。無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗生素溶液分別加到無菌的96孔聚苯乙烯板中，第2～11孔按照濃度由低到高加抗生素稀釋液，每孔100 μL，第12孔不加抗生素作為生長對照。按照規(guī)范將培養(yǎng)到穩(wěn)定期的菌液稀釋到105～106CFU/mL，吸取100 μL菌液加到96孔板中。37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，酶標(biāo)儀測定OD625，計(jì)算結(jié)果。

1.14 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0以及Origin 9處理完成；2組之間的顯著性差異通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行判斷(SPSS 19.0 軟件)，P<0.05 則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP標(biāo)記植物乳桿菌

通過電轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒PCD4033-GFP導(dǎo)入到植物乳桿菌感受態(tài)受體中，獲得GFP標(biāo)記的菌株，并進(jìn)一步對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選鑒定及熒光檢測。

2.1.1 質(zhì)粒PCD4033-GFP電轉(zhuǎn)化后重組菌株的篩選

將質(zhì)粒PCD4033-GFP通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入植物乳桿菌感受態(tài)受體細(xì)胞后，添加氯霉素的MRS中篩選轉(zhuǎn)化子。陰性對照在MRS平板上長出菌落,在氯霉素平板上沒有長出菌落，轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子在氯霉素的平板上長出菌落。初篩的結(jié)果表明,質(zhì)粒PCD4033-GFP已成功轉(zhuǎn)入4株植物乳桿菌中。

2.1.2 重組菌株驗(yàn)證

以重組菌株和陰性菌株的菌泥為模板，利用引物GF、GR擴(kuò)增GFP基因片段，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示,陰性對照均沒有條帶，所有重組菌株在700 bp附近有1條很明顯的條帶，GFP基因片段714 bp，條帶與目的片段大小吻合，所以驗(yàn)證結(jié)果表明GFP已成功標(biāo)記4株植物乳桿菌。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of PCR products注：M-marker；Y-無菌水陰性對照；1、2、3、4-P1、P2、P3、P4的標(biāo)記后的菌株；5、6、7、8-P1、P2、P3、P4陰性對照。

2.1.3 熒光顯微鏡觀察

將上述轉(zhuǎn)化菌株用熒光顯微鏡觀察，自然光下即可見微弱的綠色熒光，在紫外燈下轉(zhuǎn)化菌株菌體發(fā)出明亮的綠色熒光，細(xì)菌形狀成桿狀。表明質(zhì)粒PCD4033-GFP已成功轉(zhuǎn)入植物乳桿菌中，且GFP成功表達(dá)。

2.2 生物學(xué)特性比較研究

2.2.1 生長曲線及不同生長階段熒光強(qiáng)度的測定

標(biāo)記前后菌株的生長曲線如圖2所示。在相同的生長環(huán)境下，所有菌株標(biāo)記前后的生長曲線的變化趨勢基本相同。P1和P1G的生長曲線幾乎吻合，OD600最終均達(dá)到7.2左右；P3和P3G的生長曲線完全一致，OD600最終均達(dá)到4.2左右；P2G和P4G的生長速度比標(biāo)記前略有滯后，但P2和P2G的OD600最終穩(wěn)定在4.0左右，P4和P4G穩(wěn)定在7.4左右。在王晶等[24]的研究中也發(fā)現(xiàn)標(biāo)記后的菌株出現(xiàn)生長略微滯后的現(xiàn)象。綜上，GFP基因標(biāo)記對植物乳桿菌生長幾乎不影響。

對于熒光強(qiáng)度，轉(zhuǎn)化后的這4株植物乳桿菌的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間變化的趨勢基本一致(圖2)。指數(shù)期前期熒光強(qiáng)度隨著吸光度的增加而顯著增加，當(dāng)吸光度在2.5～3.0，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。隨后，熒光強(qiáng)度隨著吸光度的增加顯著降低至一個(gè)穩(wěn)定的水平；對于熒光強(qiáng)度的最高水平，不同的菌株之間存在一定的差異，其中熒光強(qiáng)度相對較高的是P4G，大約為25。

a-P1、P1G;b-P2、P2G;c-P3、P3G;d-P4、P4G圖2 標(biāo)記前后菌株的生長動(dòng)力學(xué)曲線及不同生長階段的熒光強(qiáng)度Fig.2 Growth curve of wild strains and labeled strains and fluorescence intensity at different growth stages

2.2.2 胃酸耐受性和膽鹽耐受性的測定

乳酸菌經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體后，只有能夠抵抗較強(qiáng)的胃酸和膽鹽，才能在腸道中存活繼而發(fā)揮其益生功效[25]。圖3可以看出, P1、P2、P4標(biāo)記前后的菌株在模擬胃液3 h后，依然保持85%～100%的高存活率，表現(xiàn)出良好的胃酸耐受性；P3標(biāo)記前后的菌株在模擬胃液3 h后存活率均顯著降低。但在模擬腸液4 h后，所有的菌株存活率顯著降低，其中存活率相對較高的P1、P2、P3標(biāo)記前后的菌株，存活率也只有5%～10%，所有菌株對膽鹽的耐受性都比較弱，但是，所有菌株標(biāo)記前后對胃酸和膽鹽的耐受性沒有顯著差別(P>0.05)。

a-P1;b-P2;c-P3;d-P4圖3 標(biāo)記前后菌株的酸耐受性和膽鹽耐受性的結(jié)果Fig.3 The tolerance to acid and bile salts of wild strains and labeled strains

2.2.3 凍存前后的活菌數(shù)及熒光強(qiáng)度的變化

由圖4可知，被GFP標(biāo)記前和標(biāo)記后的菌株在凍存的2周內(nèi)，活菌數(shù)和熒光強(qiáng)度均沒有顯著性變化(P>0.05)。對于活菌數(shù)，凍存期間所有菌株基本維持在10.5 lgCFU/mL左右。對于熒光強(qiáng)度，P2G、P3G、P4G均維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，凍存前后沒有明顯的變化；P1G的熒光強(qiáng)度在第2周時(shí)有輕微的上調(diào)，但與凍存前和凍存1周的結(jié)果比較并沒有顯著的差異(P>0.05)。所以-80℃凍存2周對于標(biāo)記前后植物乳桿菌的活菌數(shù)和熒光強(qiáng)度沒有影響。

a-P1；b-P2；c-P3；d-P4圖4 凍存期間活菌數(shù)及熒光強(qiáng)度的變化Fig.4 Results of viable cell count and fluorescence intensity after cryopreservation

2.2.4 對低聚果糖(FOS)利用能力的測定

標(biāo)記前后的菌株對FOS利用情況如表2所示。P1、P2、P4標(biāo)記前后的菌株接種到葡萄糖平板和FOS平板，培養(yǎng)20 h后，平板均由紫色變成了黃色，所以P1、P2、P4標(biāo)記前后均可以利用葡萄糖和FOS。P3標(biāo)記前后的菌株接種到葡萄糖平板上，培養(yǎng)20 h后紫色變成了黃色；接種到FOS平板上培養(yǎng)，沒有黃色產(chǎn)生，綜上可知，P3標(biāo)記前后都不具備利用FOS的能力。綜上可知，GFP基因標(biāo)記植物乳桿菌后不影響菌株對FOS的利用能力。

表2 標(biāo)記前后的菌株對FOS利用情況Table 2 The use of FOS by wild strains and labeled strains

注：+表示可以利用；-表示不能利用。

2.2.5 抗生素最低抑制濃度(MIC)測定

由表3可知除了氯霉素外，轉(zhuǎn)化前和轉(zhuǎn)化后菌株的各種抗生素的MIC基本相同，所以轉(zhuǎn)化幾乎不影響菌株對抗生素的耐受性。氯霉素存在顯著差異的原因是，表達(dá)載體里的選擇標(biāo)記基因是氯霉素的抗性基因，所以標(biāo)記后的菌株都具備氯霉素的抗性。結(jié)果表明，除氯霉素外，GFP基因標(biāo)記植物乳桿菌，不影響菌株對抗生素的敏感性。

3 結(jié)論

通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)4株菌在紫外燈下發(fā)出明亮的綠色熒光，表明用GFP基因成功標(biāo)記了4株植物乳桿菌，而且GFP的表達(dá)量在不同的植物乳桿菌中存在差異，在P4G中的表達(dá)量最高(≈25)。標(biāo)記前后，P1和P3的生長曲線幾乎吻合，P2和P4被GFP標(biāo)記后生長略有滯后，但趨勢基本相同，表明GFP標(biāo)記不影響植物乳桿菌的生長情況，GORY等[26]發(fā)現(xiàn)Lactobacillussake被GFP標(biāo)記后，生長略有滯后，正常生長不受影響。P1、P2、P4這3株植物乳桿菌標(biāo)記 前后的菌株，經(jīng)過3 h模擬胃液存活率均高于85%，P3和P3G的存活率分別是65%和61%，所有菌株經(jīng)過4 h的模擬腸液后存活率均低于11%，結(jié)果表明GFP標(biāo)記不影響植物乳桿菌對胃酸和膽鹽的耐受性(P>0.05)，此結(jié)果與王晶等[27]的研究結(jié)果一致。在-80℃凍存的2周內(nèi)，所有植物乳桿菌的活菌數(shù)均沒有顯著性變化(P>0.05)，表明GFP標(biāo)記不影響植物乳桿菌對低溫的耐受性，可以一次性制備菌體凍存于-80℃供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用。FOS利用能力的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P1、P2、P4標(biāo)記前后均可以利用FOS，但是P3和P3G均不具備FOS利用的能力，表明GFP標(biāo)記不影響植物乳桿菌對FOS的利用能力。從抗生素最低抑制濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，標(biāo)記后4株植物乳桿菌對氯霉素具有抗性，對其他抗生素的敏感性幾乎沒有變化，這是因?yàn)樵谥亟M過程中帶入了氯霉素抗性基因作為標(biāo)記基因[18-19]，所以GFP標(biāo)記不影響植物乳桿菌對抗生素的敏感性，王晶等[27]發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記不改變植物乳桿菌對除紅霉素外其他藥物的耐藥性，表達(dá)載體的標(biāo)記基因選擇的是紅霉素。

表3 抗生素對微生物生長的最低抑制濃度 單位：μg/mL

注：R表示耐受，數(shù)字表示最低耐受濃度。

綜上，植物乳桿菌被GFP標(biāo)記后的生物學(xué)特性具有穩(wěn)定性，為利用GFP基因標(biāo)記植物乳桿菌評(píng)價(jià)其定植能力和作用機(jī)理解析奠定了基礎(chǔ)。