一種無(wú)煙氣煙草制品秀爽的吸入毒理學(xué)評(píng)價(jià)

黃玉川，梁坤，趙巍，劉鍇，鄭怡，包毅，鄧永*

1 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，新型煙草制品中心，成都市錦江區(qū)成龍大道一段56號(hào) 610066；2 國(guó)家成都新藥安全性評(píng)價(jià)中心，成都市高新區(qū)高朋大道28號(hào) 610041

吸煙有害健康是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)，隨著各國(guó)公共場(chǎng)所禁煙令的出臺(tái)和實(shí)施，煙草行業(yè)尋求風(fēng)險(xiǎn)更低、環(huán)境煙氣少的新型煙草制品。鼻煙具備的健康、環(huán)保屬性吸引了越來(lái)越多的傳統(tǒng)卷煙消費(fèi)者的關(guān)注。

傳統(tǒng)鼻煙是用發(fā)酵煙葉粉末加香料調(diào)制而成，以鼻吸用的無(wú)煙氣煙草制品。益德成鼻煙是在研磨極細(xì)的優(yōu)質(zhì)煙草粉末中，摻入麝香、冰片等名貴藥材或香草類(lèi)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)精細(xì)加工，并在封閉容器中陳化數(shù)年乃至數(shù)十年后才完成的一種深加工煙制物。寬窄?益德成秀爽（簡(jiǎn)稱(chēng)秀爽）是將傳統(tǒng)鼻煙與特種濾棒技術(shù)融合，打造的一款提神的無(wú)煙氣煙草制品，是通過(guò)口腔空吸、鼻腔嗅吸，達(dá)到清新口氣、醒腦、提神、通竅、緩解焦慮和疲勞之功效。本研究按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》（2017年9月生效）[1]，經(jīng)濟(jì)合作組織 OECD Principles of Good Laboratory Practice（as revised in 1997）ENV/MC.CHEM（98）17[2]要 求，對(duì)秀爽進(jìn)行大鼠經(jīng)口鼻吸入毒理學(xué)評(píng)價(jià)，觀察秀爽對(duì)大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝的影響，為評(píng)價(jià)日常使用的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

SPF級(jí)SD大鼠120只，體重120～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；寬窄?益德成秀爽（正紅）（W0545，中國(guó)）；戊巴比妥鈉（Sigma，美國(guó)）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（美多麗，日本）；HRH-MNE3026小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系（北京慧榮，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：120只健康SD大鼠，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，采用PRISTIMA 7.2.0 版數(shù)據(jù)系統(tǒng)根據(jù)大鼠體重分性別隨機(jī)分4組：對(duì)照組，W0545低、中、高劑量組，每組30只。

1.2.2 劑量設(shè)計(jì)：成人每日推薦經(jīng)鼻吸入暴露5次，每次使用W0545約20 mg，每日合計(jì)使用約100 mg；每次吸入暴露時(shí)間約為1 min，每日合計(jì)暴露時(shí)間約為5 min。成人平均體重以60 kg計(jì)算，成人每日用以吸入暴露劑量為1.67 mg/kg（以W0545量計(jì)），大鼠等效吸入暴露劑量為10.35 mg/kg（以W0545 量計(jì)）。高、中、低劑量組：（1）吸入暴露劑量為103.5 mg/kg（以W0545量計(jì)），為人用劑量的62倍、大鼠等效吸入暴露劑量的10倍；（2）大鼠吸入暴露低、中、高劑量組的吸入暴露時(shí)間分別設(shè)為5 min、15 min、50 min，分別為人吸入暴露時(shí)間的1倍、3倍、10倍；（3）對(duì)照組動(dòng)物放置在小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)中吸入暴露環(huán)境空氣50 min。

圖1 小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)工作原理圖Fig.1 Working principle of single concentration oral and nasal exposure system for small animals

1.2.3 吸入裝置工作原理及暴露方法：小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)（HRH-MNE3026型組合式單濃度動(dòng)等線(xiàn)物口鼻吸入暴露系統(tǒng)）主要包括發(fā)生系統(tǒng)、稀釋系統(tǒng)、采樣系統(tǒng)、監(jiān)控系統(tǒng)、測(cè)量系統(tǒng)等部分。其工作原理圖1如下所示。潔凈的壓縮空氣經(jīng)過(guò)質(zhì)量流量控制器（MFC1）產(chǎn)生穩(wěn)定流量的空氣進(jìn)入collison型氣溶膠發(fā)生器，collison型氣溶膠發(fā)生器內(nèi)放置秀爽逸散氣體發(fā)生瓶，瓶?jī)?nèi)裝有一次染毒所需秀爽，通過(guò)一定流速的氣體將秀爽揮發(fā)性成分帶出用于染毒給藥的氣溶膠。該氣溶膠進(jìn)入上方的稀釋器，經(jīng)過(guò)由質(zhì)量流量控制器（MFC2）控制的稀釋空氣稀釋?zhuān)a(chǎn)生穩(wěn)定濃度的氣溶膠，以滿(mǎn)足總給藥氣體體積為500 mL/只/分鐘的給藥。進(jìn)入高劑量組的氣溶膠輸送管供高劑量組的動(dòng)物口鼻暴露吸入。未被動(dòng)物吸入的氣體被系統(tǒng)以一定流量的速度抽走，同時(shí)暴露氣流持續(xù)產(chǎn)生，保證本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)動(dòng)態(tài)的染毒系統(tǒng)。通過(guò)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)對(duì)整個(gè)吸入暴露實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度、濕度、染毒腔壓差、屏蔽柜壓差、氧氣濃度、二氧化碳濃度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

將大鼠按組別放置在小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)的裝置中，經(jīng)口鼻吸入W0545揮發(fā)氣體，每天吸入1次，連續(xù)吸入14天[3]，停止吸入恢復(fù)4周。首次吸入當(dāng)天定義為暴露期第1天，末次吸入后1天定義為恢復(fù)期第1天。給藥過(guò)程中，小動(dòng)物單濃度口鼻暴露系統(tǒng)的環(huán)境參數(shù)要求：平均氧氣濃度不低于20.63%，平均二氧化碳濃度不高于0.19%，平均溫度21.5～23.8℃，平均相對(duì)濕度26.8～40.0%，平均暴露腔內(nèi)壓差-228.15～0.96pa。

1.2.4 動(dòng)物觀察及檢測(cè)檢查：暴露期及恢復(fù)期每天觀察各組大鼠一般狀況；暴露期每周測(cè)定2次體重及攝食量，恢復(fù)期每周測(cè)定1次。觀察動(dòng)物各組所有存活大鼠，包括但不限于大鼠存活率，攝食與飲水量，口鼻、外觀體征，被毛，一般行為活動(dòng)，精神狀態(tài)，腺體分泌，皮膚和粘膜顏色，呼吸狀態(tài)，糞便性狀，生殖器等情況及其它非常態(tài)癥狀。檢測(cè)檢查指標(biāo)包括眼科檢查、血液學(xué)檢查、血液生化檢查、尿液檢查、骨髓涂片、大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)由SPSS22.0 進(jìn)行分析，體重、攝食量等定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± SD）描述。采用Dunnett’s t檢驗(yàn)（Dunnett法）對(duì)組間差異進(jìn)行比較；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 一般狀況

給藥期及恢復(fù)期，各組大鼠一般狀況良好、自主活動(dòng)正常、皮膚被毛清潔，亦未見(jiàn)其它毒性反應(yīng)。

2.2 體重

給藥期間及恢復(fù)期間，經(jīng)口鼻吸入秀爽后，各組雌、雄鼠體重與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2與圖3。

圖2 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)雄性SD大鼠體重的影響Fig.2 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

圖3 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)雌性SD大鼠體重的影響Fig.3 Effects of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on body weight of female SD rats

圖4 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)雄性SD大鼠攝食量的影響Fig.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of male SD rats

圖5 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)雌性SD大鼠攝食量的影響Fig.5 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on food ration of female SD rats

2.3 攝食量

給藥期第11～12天，高劑量組雌鼠攝食量與對(duì)照組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05），無(wú)毒理學(xué)意義。

除此之外，給藥期間及恢復(fù)期間，經(jīng)口鼻吸入秀爽后，各組雌、雄鼠攝食量與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖4與圖5。

2.4 眼科檢查

暴露結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，對(duì)照組和高劑量組大鼠雙眼屈光介質(zhì)、視盤(pán)清晰，視網(wǎng)膜動(dòng)脈管徑粗細(xì)均勻，靜脈無(wú)明顯擴(kuò)張，亦未見(jiàn)視網(wǎng)膜、視盤(pán)以及角膜、虹膜、晶狀體、前房、后房等其它異常改變。

2.5 血液學(xué)

給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組大鼠白細(xì)胞（WBC）及各分類(lèi)計(jì)數(shù)及百分比、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞容積（HCT）、平均紅細(xì)胞容積（MCV）、平均紅細(xì)胞容積（MVC）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）、網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（RET%）、活化部分凝血酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間PT等血液生化指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差異改變（見(jiàn)表1）。

2.6 血液生化

給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組大鼠天門(mén)冬氨基酸基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、尿素（Urea）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、白球比（A/G）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯TG、Na+、K+、Cl-、Ca、P、胰淀粉酶（AMY-P）、脂肪酶（LIPC）等血液生化指標(biāo)均未見(jiàn)明顯差異變化（見(jiàn)表2）。

表1 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)SD大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab.1 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on hematological parameters in SD rats

續(xù)表1

表2 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)雄性SD大鼠血液生化指標(biāo)的影響Tab.2 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on blood biochemical indicators in male SD rats

續(xù)表2

續(xù)表2

2.7 尿液檢查

給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組雌、雄鼠尿液顏色、清澈度、葡萄糖、膽紅素、酮體、潛血、酸堿值、蛋白、尿膽原、亞硝酸鹽、白細(xì)胞、比重均未見(jiàn)明顯異常改變（見(jiàn)表3）。

表3 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)SD大鼠尿液檢查指標(biāo)的影響Tab.3 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuang on urine examination indicators in SD rats

續(xù)表3

2.8 臟器重量及系數(shù)

給藥結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組雌、雄鼠腦、心臟、肝臟、腎臟、腎上腺、胸腺、脾臟、睪丸、附睪、卵巢、子宮的臟器重量、臟體/臟腦系數(shù)未見(jiàn)明顯異常改變（見(jiàn)表4）。

表4 經(jīng)口鼻吸入暴露秀爽對(duì)SD大鼠臟器系數(shù)的影響Tab.4 Effect of oral and nasal inhalation exposure to Xiushuangon organ coefficient in SD rats %

續(xù)表4

2.9 大體解剖觀察

暴露結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組所解剖大鼠大體肉眼觀察腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、胃腸道、生殖臟器等主要臟器，其大小、形態(tài)、顏色或質(zhì)地均未見(jiàn)異常改變。

圖6 對(duì)照組大鼠重要臟器組織病理學(xué)檢查結(jié)果Fig.6 Histopathological examination of important organs in rats of control group

2.10 組織病理學(xué)檢查

暴露結(jié)束及恢復(fù)期結(jié)束，對(duì)照組和高劑量組大鼠腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腎上腺、胸腺、胃腸道、生殖臟器等主要臟器或組織均未見(jiàn)與供試樣品相關(guān)的異常組織病理學(xué)改變，見(jiàn)圖6、圖7。

圖7 暴露結(jié)束高劑量組大鼠重要臟器組織病理學(xué)檢查結(jié)果Fig.7 Histopathological examination of important organs in rats of high dose group

3 分析與討論

隨著各國(guó)反吸煙運(yùn)動(dòng)的日益增強(qiáng)，降低傳統(tǒng)煙草制品對(duì)消費(fèi)者健康風(fēng)險(xiǎn)，開(kāi)發(fā)新型煙草制品成為煙草行業(yè)追逐的熱點(diǎn)[4]。2011年，美國(guó)FDA授權(quán)IOM制訂了“MRTP研究的科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)”[5]，為新型煙草制品的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了一個(gè)指導(dǎo)性框架。根據(jù)該框架，MRTP健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估主要包括煙草制品成分的化學(xué)分析、臨床前毒理學(xué)研究、臨床研究和長(zhǎng)期隨訪研究。臨床前毒理學(xué)研究是評(píng)估程序中一個(gè)重要組成部分，通過(guò)毒理學(xué)評(píng)價(jià)的新型煙草制品方可進(jìn)入臨床評(píng)估階段，以確保進(jìn)入臨床評(píng)估階段的產(chǎn)品對(duì)人體風(fēng)險(xiǎn)較低，同時(shí)具有較高的“安全性”可能[6-13]。

按照產(chǎn)品的類(lèi)型，無(wú)煙氣煙草制品分為美國(guó)濕含煙（Moist snuff）、瑞典含煙 Snus、含化型煙草制品（Dissolvable tobacco products，DTPs）、膠基型煙草制品、嚼煙、干含煙（Dry snuff）、西歐鼻煙、亞洲鼻煙等多種產(chǎn)品形式[14]，鼻煙主要通過(guò)鼻粘膜吸收其中的香味物質(zhì)和/或生理強(qiáng)度物質(zhì)，嚼煙和口含煙主要通過(guò)口腔黏膜吸收其中香味物質(zhì)和生理強(qiáng)度物質(zhì)。目前對(duì)無(wú)煙氣煙草制品安全性評(píng)價(jià)主要集中在有害化學(xué)成分分析，秦亞瓊等人[15]對(duì)國(guó)內(nèi)外近30年關(guān)于無(wú)煙氣煙草制品化學(xué)成分分析的文獻(xiàn)進(jìn)行了全面概述。①大部分文獻(xiàn)聚焦在無(wú)煙氣煙草制品中水分、pH、煙堿總含量、游離態(tài)煙堿含量、TSNAs的分析測(cè)定方面；對(duì)其他常規(guī)化學(xué)成分、添加劑、有害成分（除TSNAs）關(guān)注較少，但近年來(lái)呈逐漸增加趨勢(shì)。②在含量水平上，不同品牌、類(lèi)型產(chǎn)品的常規(guī)化學(xué)成分及指標(biāo)、添加劑、有害成分含量存在明顯差異。③在分析方法上，常規(guī)化學(xué)成分及添加劑的分析方法以GC和GC-MS為主；對(duì)于有害成分，大多采用GC-MS/MS或LC-MS/MS 進(jìn)行檢測(cè)；目前對(duì)體內(nèi)毒理學(xué)研究較少。

本文使用的寬窄?益德成秀爽（正紅）為一種新型封閉場(chǎng)所醒腦提神的無(wú)煙氣煙草制品，基礎(chǔ)原料來(lái)自非物質(zhì)文化遺產(chǎn)傳承單位天津益德成的鼻煙粉“人參益氣散”。主要成分包括人參、石菖蒲、白寇、白芷、薄荷等，人參大補(bǔ)元?dú)猓a(bǔ)脾安神為君藥；菖蒲開(kāi)竅豁痰，醒神益智為臣藥；白芷、白寇上行頭目而清竅，兼能燥濕升陽(yáng)，為佐藥，薄荷清涼走竄為史藥。寬窄益德成秀爽（正紅）采用玻態(tài)干燥技術(shù)制備秀爽專(zhuān)用鎖香和釋香顆粒，解決鼻煙粉香味容易散失和加工過(guò)程中流動(dòng)性差的問(wèn)題，通過(guò)MCT溶劑萃取法提取天然香料制備爆珠，借助三元復(fù)合空腔濾棒模擬鼻煙壺盛裝鼻煙粉（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖8）。消費(fèi)者通過(guò)一嗅、二捏、三分、四擠、五吸的方式消費(fèi)秀爽；可鼻吸，達(dá)到醒腦提神、緩解焦慮疲勞；可口腔空吸，達(dá)到清新口氣的作用。

圖8 秀爽煙支結(jié)構(gòu)示意圖Fig.8 Structural sketch of Xiushuang cigarette

管瑩等[6]采用染毒24 h后MTT、細(xì)胞凋亡觀察電子煙煙液進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。劉炘等[16]采用大鼠30 d喂養(yǎng)相當(dāng)于人體推薦攝入量100倍觀察沸玉菁茶安全性。通過(guò)與國(guó)家成都新藥安全性評(píng)價(jià)中心專(zhuān)家溝通，結(jié)合食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)教材指導(dǎo)建議：“在新藥安全性評(píng)價(jià)中，試驗(yàn)期限等于或小于14 d”，加之研究經(jīng)費(fèi)原因，本研究參照新藥安全性評(píng)價(jià)方式，依從CFDA的GLP規(guī)范，對(duì)寬窄益德成秀爽進(jìn)行為期14 d的大鼠口鼻暴露吸入毒理學(xué)評(píng)價(jià)。根據(jù)消費(fèi)者每日推薦使用量換算大鼠暴露計(jì)量，最大暴露量為成人62倍，暴露時(shí)間為成人10倍。研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠連續(xù)14 d、每天連續(xù)5 min、15 min、50 min以口鼻暴露方式吸入103.5 mg/kg劑量的寬窄益德成秀爽（正紅），暴露結(jié)束后恢復(fù)4 w，各組大鼠一般狀況、體重、攝食量、眼科檢查、血液學(xué)及血液生化檢查、尿液檢查、臟器重量及系數(shù)、大體解剖觀察及組織病理學(xué)檢查均未見(jiàn)明顯異常。由此推測(cè)在本研究劑量范圍內(nèi)，寬窄益德成秀爽是安全的無(wú)煙氣煙草制品。

煙草行業(yè)普遍采用30 d或90 d的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行口鼻暴露的卷煙煙氣毒理學(xué)研究。臨床藥物進(jìn)入申報(bào)流程一般需要提供4 w毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但在用藥劑量選擇中普遍采用7 d或14 d的毒性實(shí)驗(yàn)。本研究因經(jīng)費(fèi)有限，結(jié)合臨床藥物劑量選擇最低要求，觀察大鼠14 d口鼻暴露寬窄益德成秀爽的實(shí)驗(yàn)研究。因染毒周期較短，研究結(jié)論存在一定的偏差，以期在后續(xù)研究中延長(zhǎng)染毒周期，結(jié)合免疫組織化學(xué)、PCR等技術(shù)觀察寬窄益德成秀爽使用安全性。

此外，本研究中爆珠香味成分為MCT溶劑萃取法提取秀爽中揮發(fā)性有效成分，本研究只對(duì)秀爽顆粒成分進(jìn)行吸入安全性評(píng)價(jià)，未對(duì)整個(gè)秀爽煙支結(jié)構(gòu)及爆珠進(jìn)行捏碎后的吸入安全性評(píng)價(jià)。后續(xù)研究中會(huì)針對(duì)這個(gè)煙支結(jié)構(gòu)及爆珠進(jìn)行相關(guān)安全性評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

采用HRH-MNE3026型組合式單濃度動(dòng)物口鼻吸入暴露系統(tǒng)建立大鼠口鼻暴露吸入毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方案。經(jīng)過(guò)14 d連續(xù)暴露寬窄益德成秀爽（正紅），與空白對(duì)照組相比，各受試組大鼠日常狀態(tài)、生理代謝指標(biāo)、血液理化指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查等無(wú)明顯異常，為秀爽系列產(chǎn)品的使用安全性提供了依據(jù)。