嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌J03對(duì)烤煙二氯喹啉酸藥害的修復(fù)作用

周挺，郭學(xué)清，田佩玉，陳鳳平，顧鋼

1 福建省煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建福州北環(huán)中路133號(hào) 350003；2 福建省龍巖市煙草公司，長(zhǎng)汀分公司，福建長(zhǎng)汀汀州鎮(zhèn)環(huán)城中路25號(hào) 366300；3 福建農(nóng)林大學(xué)，植物病毒研究所，福建福州上下店路15號(hào) 350002

二氯喹啉酸是德國(guó)巴斯夫公司上世紀(jì)80年代生產(chǎn)的一種激素型喹啉酸類除草劑，是防除稻田稗草的特效選擇性除草劑，具有良好的除草效果和較長(zhǎng)的持效期[1]，在稻田使用普遍。已有研究表明二氯喹啉酸在土壤中殘留量較大，半衰期長(zhǎng)，易對(duì)后茬作物產(chǎn)生藥害[2-3]。

我國(guó)南方煙區(qū)多實(shí)行水旱輪作，即煙－稻輪作的耕作模式，連年種煙導(dǎo)致土壤酸化，在pH＜4.5的環(huán)境中，前茬水稻施用的二氯喹啉酸殘留較易以分子形式通過煙株質(zhì)膜在體內(nèi)富集[4]，二氯喹啉酸可通過抑制土壤中和煙株體內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致烤煙在生長(zhǎng)中發(fā)生畸形、變黃等藥害癥狀[5-6]。發(fā)生藥害的煙株，葉片發(fā)生畸形，變窄變厚，不能伸展，葉寬受到抑制，邊緣向葉背翻轉(zhuǎn)皺縮，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)線狀或鼠尾狀葉型[7]。廣東煙區(qū)曾報(bào)道稻田施用二氯喹啉酸引起大面積后茬烤煙煙葉畸形[8]。福建煙區(qū)近年也時(shí)常出現(xiàn)除草劑殘留危害烤煙的情況。

二氯喹啉酸在田間的降解與多種因素有關(guān)。其在稻田水中的主要消解途徑是光解，與光照和光氧化酶有關(guān)[9]；在土壤中消解動(dòng)態(tài)與土壤種類、結(jié)構(gòu)、酸堿度、微生物等有關(guān)[2]。二氯喹啉酸在堿性、質(zhì)地疏松的土壤中，其消解速度較酸性、質(zhì)地緊密的土壤中快[10]。土壤濕度通過影響二氯喹啉酸的可溶性和活性，從而影響其降解速率[11]。已有研究表明，自然界中存在的微生物是環(huán)境中二氯喹啉酸殘留降解的重要因素。研究人員從不同環(huán)境中分離獲得了一些可降解二氯喹啉酸的細(xì)菌，包括博德特氏菌屬（Bordetella sp.）細(xì)菌[12]、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenessp．）細(xì)菌[13]、 泛菌屬（Pantoea sp.） 細(xì)菌[14]、 節(jié) 稈菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌[15]、分支桿菌屬（Mycobacterium sp.）細(xì)菌[16]、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）細(xì)菌[17]等。部分菌株已被證明對(duì)烤煙二氯喹啉酸藥害具有一定修復(fù)作用[18-19]。本文從福建省龍巖市長(zhǎng)汀縣植煙土壤中富集分離二氯喹啉酸降解菌并進(jìn)行鑒定；同時(shí)，開展溫室盆栽及田間小區(qū)試驗(yàn)研究該菌株對(duì)受害煙草的修復(fù)能力，為解決南方煙區(qū)水旱輪作煙田二氯喹啉酸殘留危害問題提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

土樣：采自福建省龍巖市長(zhǎng)汀縣近年發(fā)生過二氯喹啉酸藥害的煙田耕作層土壤；

無機(jī)鹽培養(yǎng)基[20]：MgSO4?7H2O 0.2 g/L, KH2PO41.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L, CaCl20.01 g/L，F(xiàn)eSO4trace，NaNO30.5 g/L，調(diào)節(jié)pH至7-7.5；

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L；

二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）：沈陽(yáng)化工研究院；

50%二氯喹啉酸可濕性粉劑：江蘇省激素研究所股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 二氯喹啉酸降解菌的分離

稱取0.1 g土樣與100 mL 液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基混合，加入二氯喹啉酸使其終濃度為100 μg/mL，30℃條件下，150 r/min培養(yǎng)7 d；取培養(yǎng)液1 mL加入100 mL含同樣濃度二氯喹啉酸的新鮮培養(yǎng)基中，同時(shí)于固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基劃線以確認(rèn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，同樣條件培養(yǎng)7 d；連續(xù)繼代培養(yǎng)10次后，經(jīng)平板劃線分離，獲得單菌落菌株J03。

1.2.2 J03菌株Biolog代謝芯片鑒定

參照使用說明書，采用Biolog GEN Ⅲ測(cè)定J03菌株的碳源利用，接種48 h 后通過Biolog MicrostationTM全自動(dòng)細(xì)菌鑒定程序讀取數(shù)據(jù)，記錄結(jié)果。

1.2.3 J03菌株的系統(tǒng)發(fā)育鑒定

J03菌株于 LB 培養(yǎng)平板上培養(yǎng)24 h 后，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物（F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' / R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'） 進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增，引物由生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Taq 酶 0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物各 1 μL，模板 1 μL，ddH2O 17.2μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95℃ 45 s，56℃ 40 s，72 ℃ 90 s，28 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果于NCBI上進(jìn)行Blastn比對(duì)，選取GenBank中同源性較高的序列，采用MEGA6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分離菌株的分類地位。

1.2.4 菌株J03對(duì)二氯喹啉酸降解效率的測(cè)定

參考胡楊等[21]的方法，設(shè)置HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相為甲醇＋0.5%乙酸（體積比為65∶35）；流速為1.0 mL/min；柱溫為40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm；進(jìn)樣體積為10 μL；色譜分離柱為C18柱（4.6 nm×250 nm，5 μm，安捷倫）。

以不加菌液只含相同濃度二氯喹啉酸的無機(jī)鹽培養(yǎng)基和不加二氯喹啉酸只加J03菌株的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照；利用高效液相色譜法測(cè)定添加J03菌株且含5 μg/mL 二氯喹啉酸處理和對(duì)照培養(yǎng)液中的二氯喹啉酸，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為純度為99.9%的二氯喹啉酸，取樣時(shí)間分別為第7 d 和第21 d，樣品體積為1 mL；將樣品在8000 r/min 條件下離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后用于HPLC分析，通過下列公式求得二氯喹啉酸降解率，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 J03菌株對(duì)二氯喹啉酸脅迫下烤煙葉片生長(zhǎng)的修復(fù)

將J03菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃，150 r/min培養(yǎng)24 h 獲得菌懸液，再用LB液體培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)整為108cfu/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

配制濃度為0.1 mg/L的二氯喹啉酸母液，備用。取未施用過二氯喹啉酸的山土，裝入花盆，每盆2.5 kg，土壤設(shè)4個(gè)處理：T1：噴施250 mL 二氯喹啉酸母液并混合均勻使其終濃度為0.01 mg/kg 土壤；T2：噴施250 mL 二氯喹啉酸母液并混合均勻使其終濃度為0.01 mg/kg 土壤，再加入200 mL 濃度為108cfu/mL 的菌懸液混勻；T3：只加入200 mL 108cfu/mL 的菌懸液混勻；T4：只加入200 mL LB培養(yǎng)基；3次重復(fù)，以土壤不做任何處理為對(duì)照，所有處理和對(duì)照均澆水保持土壤濕潤(rùn)。

選取生長(zhǎng)一致的煙苗，于土壤處理后2 d移栽入上述花盆中。30 d后測(cè)量有效葉第5、6、7葉的長(zhǎng)、寬，按照以下公式計(jì)算葉面積及修復(fù)效果：葉面積（S）=長(zhǎng)×寬×0.6345；修復(fù)效果=（ST2-ST1） /SCK[22]。

1.2.6 菌株J03對(duì)烤煙二氯喹啉酸藥害的防治效果

二氯喹啉酸藥害修復(fù)田間小區(qū)試驗(yàn)設(shè)在福建省長(zhǎng)汀縣濯田鎮(zhèn)。起壟后按照900 g / hm2的用量在畦面上噴施50%二氯喹啉酸可濕性粉劑后蓋膜。15 d 后打穴，將濃度為108cfu/mL 的J03菌液200 mL 施于移栽穴中，2 d 后移栽，移栽后30 d 調(diào)查藥害發(fā)生情況，3次重復(fù)，每小區(qū)30株，以噴施50%二氯喹啉酸而不施用J03菌液為對(duì)照。

按《煙草除草劑藥害分級(jí)及調(diào)查方法》（YC/T 526-2015）[7]進(jìn)行藥害嚴(yán)重度分級(jí)，計(jì)算藥害指數(shù)（I）。

按以下公式計(jì)算田間藥害防治效果：防治效果=（I對(duì)照- I處理） / I對(duì)照

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSSv18.0 數(shù)據(jù)處理軟件分析各處理之間的差異顯著性。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 二氯喹啉酸降解菌的分離與富集

經(jīng)連續(xù)繼代培養(yǎng)10次后，經(jīng)平板劃線分離，獲得單菌落菌株，菌落呈黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊（圖1），編號(hào)為J03。

2.2 菌株J03的Biolog代謝芯片鑒定

菌株J03經(jīng)Biolog Microstation TM全自動(dòng)細(xì)菌鑒定程序分析，系統(tǒng)將其匹配為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），PROB=0.996，SIM=0.731，可代謝利用糊精、D-纖維二糖等27種碳源（圖2）。

圖1 菌株J03在LB平板上培養(yǎng)24 h 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain J03 cultured on LB plate for 24 hours

2.3 菌株J03的系統(tǒng)發(fā)育鑒定

NCBI核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示：菌株J03的16S rDNA 的核苷酸序列（GenBank MK333286）與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）UPMPR7 菌株(GenBank Accession No.MF197702.1)的相似度為99.9%。進(jìn)化樹顯示菌株J03與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌親緣關(guān)系最為緊密，聚類于同一進(jìn)化分支?；谛蛄斜葘?duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析認(rèn)定菌株J03為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

圖2 J03菌株Biolog GenⅢ微孔板測(cè)試結(jié)果Fig.2 Biolog GenⅢ multi-trait test results of strain J03

圖3 菌株J03的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain J03

2.4 菌株J03對(duì)二氯喹啉酸的降解效率

測(cè)定結(jié)果如圖4所示，培養(yǎng)7 d 后，菌株J03對(duì)二氯喹啉酸的降解率為10.30%；培養(yǎng)21 d 后，對(duì)二氯喹啉酸的降解率為33.50%。

圖4 菌株J03在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)二氯喹啉酸的降解率Fig.4 Degradation rate of quinclorac by strain J03 in liquid mineral salt medium

2.5 菌株J03對(duì)二氯喹啉酸脅迫下烤煙葉片生長(zhǎng)的修復(fù)

各處理所測(cè)量葉片的葉面積和（表1）表現(xiàn)為T3＞T2＞CK＞T1＞T4。菌液處理和二氯喹啉酸+菌液處理，葉面積均顯著高于對(duì)照，而二氯喹啉酸處理和培養(yǎng)基處理，葉面積均顯著低于對(duì)照，表明菌株J03可以修復(fù)二氯喹啉酸脅迫下烤煙葉片的生長(zhǎng)，修復(fù)效果為33.46%。

2.6 菌株J03對(duì)二氯喹啉酸藥害的防治效果

田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明，移栽前穴施J03菌液處理組烤煙的藥害指數(shù)為57.84，對(duì)照組藥害指數(shù)則高達(dá)91.70，J03菌液處理對(duì)烤煙二氯喹啉酸田間藥害的防治效果為36.92%（圖5）

圖5 菌株J03對(duì)烤煙二氯喹啉酸藥害的防治效果（a：田間長(zhǎng)勢(shì)；b：藥害指數(shù)）Fig.5 Control efficacy of strain J03 on quinclorac injury in tobacco(a: tobacco growth in the field; b: Phytotoxicity index)

表1 菌株J03對(duì)二氯喹啉酸脅迫下烤煙葉面積的影響Tab.1 Effect of strain J03 on the area of tobacco leaves under the stress of quinclorac

3 討論

二氯喹啉酸的半衰期長(zhǎng)，在偏酸、質(zhì)地緊密的土壤中降解速率慢的特點(diǎn)，與煙稻輪作制的煙區(qū)發(fā)生藥害的現(xiàn)象總體趨勢(shì)上是吻合的。

本研究篩選獲得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)為革蘭氏陰性菌，屬嚴(yán)格需氧桿菌，在系統(tǒng)分類學(xué)上屬于細(xì)菌界、變形菌門、變形菌綱、黃單胞菌目、黃單胞菌科、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬，在自然界中分布廣泛。盡管已有研究表明嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可降解二氯喹啉酸[23]，但其對(duì)二氯喹啉酸的降解效率和對(duì)二氯喹啉酸脅迫下烤煙生長(zhǎng)的作用尚未見報(bào)道。此外，有研究表明同屬不同種的寡養(yǎng)單胞菌對(duì)除草劑磺?；锹【哂休^好的降解能力[24]。

本研究表明寡養(yǎng)單胞菌J03菌株對(duì)二氯喹啉酸在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的降解效率在21 d 后為33.5%，與前人報(bào)道的其他降解菌對(duì)二氯喹啉酸的降解效率相差較大。例如Li等[16]報(bào)道1株分支桿菌在7 d 時(shí)間內(nèi)對(duì)二氯喹啉酸的降解率達(dá)到97.38%； Lang等[17]報(bào)道1株鏈霉菌在18 d 時(shí)間內(nèi)對(duì)二氯喹啉酸的降解率達(dá)到97.2%。造成該種差異與多種因素有關(guān)，如試驗(yàn)過程中的接菌量、培養(yǎng)條件及菌株本身降解能力差異等。然而，盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株能有效緩解二氯喹啉酸對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響，添加菌株和二氯喹啉酸的煙株生長(zhǎng)健康無受害狀，而僅添加藥液的處理，煙草受害明顯，僅添加LB培養(yǎng)的處理，煙株受害可能與培養(yǎng)基中的高鹽含量有關(guān)；田間小區(qū)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)施用J03菌株可有效降低田間煙株的二氯喹啉酸藥害程度，防治效果為36.92%。為此，該菌在大田生產(chǎn)上具有修復(fù)烤煙田間二氯喹啉酸藥害的應(yīng)用潛力。

煙草生長(zhǎng)受二氯喹啉酸危害可能與活性氧中毒有關(guān)。已有研究表明二氯喹啉酸可引起稗草活性氧中毒現(xiàn)象[25]，即二氯喹啉酸脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞產(chǎn)生活性氧從而對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生危害。有研究表明在二氯喹啉酸脅迫下，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可超表達(dá)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶[23]，該酶是生物有機(jī)體活性氧清除系統(tǒng)的重要組成部分，可使細(xì)胞免受或降低因活性氧造成的傷害。同時(shí)，已有研究表明不同微生物對(duì)于降低活性氧危害的機(jī)制有所不同[26]。本研究結(jié)果證實(shí)從福建植煙土壤中富集分離獲得的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌可修復(fù)二氯喹啉酸對(duì)煙草的危害，一方面可能是由于該菌株的降解作用使土壤中的二氯喹啉酸濃度降低，另一方面也可能是由于該菌株在二氯喹啉酸脅迫下產(chǎn)生超氧化物歧化酶和過氧化氫酶，緩解了活性氧對(duì)煙株細(xì)胞的危害。

4 結(jié)論

從福建植煙土壤中分離獲得的二氯喹啉酸降解菌為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），在室內(nèi)條件下培養(yǎng)21 d后，對(duì)二氯喹啉酸的降解效率為33.5%；盆栽條件下能有效修復(fù)二氯喹啉酸脅迫下烤煙葉片的生長(zhǎng)，修復(fù)效果為33.46%；小區(qū)試驗(yàn)中，噬麥芽寡養(yǎng)單胞菌J03對(duì)烤煙二氯喹啉酸藥害的防治效果為36.92%。