超聲預處理小麥蛋白與殼聚糖復合物膠體穩(wěn)定性研究

李素云，劉興麗，張艷艷，張華，李星科，吳燕青

(鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院,鄭州 450002)

1 概述

小麥蛋白又稱面筋蛋白，是小麥淀粉加工的副產(chǎn)物，由于其具有較強的粘彈性、延伸性、薄膜成型性、吸脂乳化性等多種獨特物理性質，因此在食品工業(yè)中具有重要應用[1]。但是小麥蛋白分子遇水極易交聯(lián)形成粘彈性強的網(wǎng)絡狀結構，分散性差，不溶于水，這些特性使得小麥蛋白的應用具有一定的局限性。因此，許多研究利用物理、化學和生物等技術改變蛋白質的空間結構和分子排布，進而改善蛋白質的功能特性[2,3]。

本文擬通過超聲處理小麥蛋白過程中產(chǎn)生的動態(tài)剪切、空化等作用改變其空間結構，促進蛋白質與多糖的相互作用，協(xié)同對蛋白質的結構進行修飾，從而改善蛋白的功能、界面性質和乳化性質。通過超聲協(xié)同殼聚糖改善后的小麥蛋白有許多用途，比如用于保鮮的可食用膜以及微膠囊包埋營養(yǎng)物質和調味料等[4，5]。

本文的研究思路是利用濁度法、掃描電鏡分析法、紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法研究超聲處理作用調控小麥蛋白與殼聚糖所形成的復合物結構，解析不同pH值下小麥蛋白-殼聚糖復合物在加熱、鹽離子、不同復合比等條件下的狀態(tài)變化和作用機理，為研究超聲作用下的蛋白和陽離子多糖的相互作用提供理論基礎。

2 實驗材料與方法

2.1 實驗材料與試劑

小麥蛋白(蛋白質含量82%)：徐州澳凱小麥淀粉有限公司；殼聚糖(食品級)：平均分子量在150～500 kDa，脫乙酰度大于90%，水分8.0%，灰分0.7%：鄭州優(yōu)然食品配料有限公司；主要試劑冰乙酸、氫氧化鈉等：均為化學試劑，天津市大茂化學試劑廠。

2.2 實驗儀器與設備

VCX750超聲波細胞破碎儀 上海苑勝儀器設備有限公司；UV-3200S紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本日立公司；SEM、JSM-6490LV掃描電鏡 日本JEOL公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 小麥蛋白的超聲處理

稱取一定質量的小麥蛋白分散于去離子水中,配制成蛋白濃度為5 mg/mL，然后進行超聲預處理。超聲參數(shù)為：超聲功率169 W/cm2，超聲10 min，間歇比為4/2 s，得到超聲預處理的小麥蛋白溶液。

2.3.2 小麥蛋白-殼聚糖溶液的制備

制備濃度為10 mg/mL的殼聚糖溶液：稱取一定質量的殼聚糖溶解在濃度為0.1 mol/L、pH為3.0的乙酸緩沖液中，在室溫下(20 ℃)攪拌3 h，放入冰箱中水化靜置12 h。

小麥蛋白-殼聚糖溶液的制備：將蛋白與殼聚糖按照一定質量比、不同比例混合后，通過補足乙酸緩沖液，調節(jié) pH 的方式制得。本文討論的復合溶液是在不同pH(3.0～8.0)、不同蛋白質-殼聚糖復合比(簡稱不同復合比)、不同離子強度(氯化鈉)和加熱條件下(60 ℃)形成的。通過觀察其濁度來表征復合溶液的穩(wěn)定性。

2.3.3 復合物濁度的測定

利用分光光度計來檢測小麥蛋白-殼聚糖復合溶液的濁度。復合溶液靜置穩(wěn)定30 min后將待測樣品倒入比色皿中，在600 nm處測其吸光值，每組樣品平行3次，取平均值。

2.3.4 復合物粉末的制備

在pH為6的條件下將殼聚糖、小麥蛋白、小麥蛋白-殼聚糖(WP-CS)、超聲處理的小麥蛋白-殼聚糖(超聲WP-CS)溶液進行真空冷凍干燥處理，得到固體粉末。

2.3.5 復合物的熒光光譜分析

將依據(jù)2.3.4制得的凍干粉末用0.1 mol pH為7的磷酸緩沖液溶解稀釋，使蛋白質含量為0.25 mg/mL，離心取上清液。采用F-7000型熒光光譜儀進行熒光測定，實驗選擇260 nm下激發(fā)，掃描范圍為270～450 nm，掃描速度為240 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬為5 nm，所用樣品池長為1.0 cm。

2.3.6 復合物溶液紫外-可見吸收光譜分析

將2.3.5制得的上清液用0.1 mol pH為7的磷酸鹽緩沖液適度稀釋，使得蛋白質含量為0.06 mg/mL，用于紫外-可見光譜分析，光波波長設定范圍為220～400 nm，分辨率為0.5 nm，測定時以磷酸鹽緩沖液作為空白。

2.3.7 復合物掃描電鏡分析

使用SEM測復合物的微觀形態(tài)。首先取少量均勻的粉末狀樣品用雙面膠固定，將固定后的樣品放入離子濺射裝置中涂金作為導電膜，時間設定為120～130 s。

3 結果分析

3.1 不同pH值對小麥蛋白-殼聚糖復合體系溶解性的影響

體系的pH值對大生物聚合物電荷密度影響很大，從而影響聚合強度。不同pH 值對殼聚糖、小麥蛋白和WP-CS(2∶1)溶解性的影響見圖1。

圖1 不同pH 值對殼聚糖、小麥蛋白和小麥蛋白-殼聚糖(2∶1)溶解性的影響

由圖1可知，溶液體系有澄清、半透明、渾濁，部分相分離和完全相分離狀態(tài)。CS在pH 7～8時狀態(tài)為渾濁，其他狀態(tài)都是澄清的，這是因為隨著 pH 增高并達到 CS 的 pKa 值以后，CS所帶的正電荷逐步降低，發(fā)生聚集并產(chǎn)生渾濁狀態(tài)。小麥蛋白在 pH 7～8時發(fā)生部分相分離，這是由小麥蛋白的等電點決定的。當在WP溶液中加入CS時，相分離的pH 范圍從pH 5～7上升到 pH 6～8。這是由于當pH值大于等電點時小麥蛋白攜帶負電荷，隨著帶有陽離子性質的殼聚糖的增加，混合物出現(xiàn)了不同程度的凝聚現(xiàn)象。

3.2 超聲預處理小麥蛋白對復合物在不同復合比條件下膠體穩(wěn)定性的影響

圖2 超聲預處理小麥蛋白-殼聚糖復合物在不同復合比條件下的膠體穩(wěn)定性

研究證實，體系中蛋白與多糖的比例會影響其復合物的穩(wěn)定性[6]。由圖2(a)可知，未經(jīng)過超聲處理的復合物，復合體系的濁度隨著pH值的增加而變大，當pH達到6時，濁度最大；但是隨著復合比中蛋白含量的增加，濁度出現(xiàn)先增大后減少的趨勢，并在復合比為2∶1時達到最高。這是因為蛋白過高會導致過多的蛋白聚集在復合物表面，產(chǎn)生排斥力，因而濁度下降，此研究結果和Dickinson E等[7]研究的β-乳球蛋白與黃原膠的復合體系結論相似。

由圖2(b)可知，經(jīng)過超聲處理的WP-CS復合體系，其濁度的變化趨勢和未超聲的復合物體系相同，但是濁度的最大值與未超聲處理相比顯著降低?？赡苁且驗槌曌饔檬沟鞍踪|內(nèi)部的氨基酸殘基暴露在外，增加了蛋白質的表面電荷，加大了與殼聚糖的結合，進而改變復合物的溶解性。Yang等[8]研究表明，超聲處理能夠明顯提高蛋白質的溶解性、蛋白質懸浮液的乳化、蛋白質亞基的聚合。綜上所述，選擇復合比為2∶1進行其他影響因素研究。

3.3 超聲預處理小麥蛋白-殼聚糖復合物在加熱條件下對膠體穩(wěn)定性的影響

溫度是影響蛋白質-殼聚糖復合物膠體穩(wěn)定性的另一個重要因素，WP-CS復合物通過加熱處理會在短時間內(nèi)改變體系間相互作用力的平衡，從而改變復合體的穩(wěn)定性[9]。

圖3 超聲預處理小麥蛋白-殼聚糖復合物在加熱條件下對膠體穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，僅對復合物進行加熱處理可以引起體系濁度的降低，這是由于熱處理在短時間內(nèi)會引起蛋白質的變性，使處在蛋白質分子內(nèi)部的部分疏水基團裸露在外部，導致蛋白質與殼聚糖之間的疏水作用增強；當超聲和加熱協(xié)同作用時，和未超聲相比，濁度在低pH和高pH沒有顯著性差異，但是在pH 6～8之間，加熱聯(lián)合超聲使復合體系的濁度急劇下降，推測原因可能是超聲的空穴效應加大了與液體的接觸面積并且形成的大量氣泡使蛋白質周圍的壓強增大[10]，促使親水氨基酸暴露出來，聚合體更加穩(wěn)定，從而使復合體系的濁度降低。

3.4 超聲預處理小麥蛋白對復合物在鹽離子條件下膠體穩(wěn)定性的影響

鹽離子的存在會屏蔽殼聚糖鏈上的正電荷，改變蛋白質氨基酸側鏈上的電荷分布，使蛋白質與殼聚糖的相互作用減小，造成結合能力降低。

圖4 超聲預處理小麥蛋白-殼聚糖復合物在鹽離子條件下對膠體穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，鹽離子的存在導致復合體系濁度降低，這可能是小麥蛋白中的球蛋白溶于鹽溶液的原因。但是超聲對復合體系的濁度影響是在低pH時升高的，在高pH時濁度降低，原因可能是低pH時超聲導致球蛋白溶解性降低，在較高pH 時使部分蛋白聚集成大分子，從而使?jié)岫冉档汀?/p>

3.5 超聲預處理小麥蛋白對復合物凝膠體系的熒光強度影響

內(nèi)源性熒光對蛋白質的色氨酸殘基的微環(huán)境變化和空間結構變化具有較高的靈敏度和選擇性等優(yōu)點[11]，成為研究WP-CS復合體系相互作用最有效的方法。

圖5 小麥蛋白-殼聚糖復合物溶液的熒光光譜

由圖5可知，殼聚糖的加入以及超聲處理都對小麥蛋白產(chǎn)生一定的影響，復合物的熒光強度明顯大于純蛋白，且峰值發(fā)生輕微的藍移。推測可能是由于殼聚糖的加入使小麥蛋白色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生輕微的變化。超聲處理后的WP-CS復合物較未超聲處理的復合物熒光強度降低，說明超聲處理改變了蛋白質的三級空間結構，使酪氨酸和色氨酸殘基暴露，進而影響了與殼聚糖之間的相互作用，使熒光強度較未超聲處理的降低。

3.6 超聲預處理小麥蛋白對復合物凝膠體系的紫外-可見吸收光譜影響

紫外-可見光譜法是研究蛋白質的三級構象是否發(fā)生改變的一種最常用的實驗手段，通過對其進行紫外分析來獲得更多蛋白質結構變化的信息[12]。

圖6 小麥蛋白-殼聚糖復合體系的紫外可見吸收光譜

由圖6可知，隨著殼聚糖的加入，WP-CS復合體系的最大吸收峰增加并發(fā)生了輕微的紅移，可能是由于蛋白質與殼聚糖之間的相互作用改變了蛋白質所處的微環(huán)境。同時，超聲處理WP-CS復合體系，使最大吸收峰降低并發(fā)生了紅移，這說明蛋白質的三級構象發(fā)生改變，這是由于超聲處理使氨基酸殘基向更加疏水的環(huán)境中移動。

3.7 超聲預處理小麥蛋白對復合物凝膠體系的微觀結構影響

圖7 小麥蛋白-殼聚糖復合體系的電鏡分析

通過掃描電鏡觀察復合物的微觀結構可以推測出蛋白分子的功能性質如何改變。由圖7(a)可知，殼聚糖呈扁平狀分布，體積較大；圖7(b)中蛋白質呈無規(guī)則顆粒、球狀，體積較?。欢鴪D7(c)呈現(xiàn)出蛋白附著在扁平塊狀上，這是因為蛋白質溶液在高于其等電點時開始帶負電荷，與殼聚糖帶正電荷相互靜電作用，出現(xiàn)了凝聚現(xiàn)象。圖7(d)中復合物經(jīng)過超聲處理，與圖7(c)相比，顆粒分布均勻，蛋白附著在殼聚糖表面上的顆粒增加。這是因為經(jīng)過超聲處理，使更多的疏水基團暴露于蛋白表面，蛋白質分子打開，增大了與殼聚糖的溶解性，使復合物形成一種致密的網(wǎng)絡結構。

4 結論

本研究選擇超聲和未超聲的小麥蛋白與殼聚糖形成復合水溶液體系，并通過調控 pH 值、復合比、溫度和離子強度來對比研究WP-CS和UWP-CS所形成的復合體系的相行為，得到如下結論：

WP-CS和UWP-CS形成穩(wěn)定膠體的最佳條件均是WP∶CS為2∶1，pH為6，溫度為20 ℃，無鹽離子情況下，在低超聲功率下，UWP-CS的穩(wěn)定性強于WP-CS。在加熱和添加鹽離子的條件下，UWP-CS復合體系的濁度要低于WP-CS，說明超聲處理使蛋白質結構部分打開，柔性增強，加大了與殼聚糖結合的能力；通過紫外-可見吸收光譜、熒光光譜和掃描電鏡對WP-CS和UWP-CS復合物結構性質分析可知，與未超聲的復合物相比，超聲處理可使蛋白質的三級構象和所處的微環(huán)境改變，凝聚物減少，可溶性復合物增加，與殼聚糖的相互作用加強，從而影響復合體系的穩(wěn)定性及其他相關性質。