塊菌菌根土壤產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌Streptomyces omiyaensis SCPW03的篩選及其幾丁質酶酶學性質研究

王田田，馬沁沁，苗玉志 ，周 霞

(四川師范大學生命科學學院，四川 成都 610101)

【研究意義】幾丁質來源非常豐富，是自然界中僅次于纖維素的第二大類生物高聚物[1-2]，由于其分解非常緩慢而大量堆積造成環(huán)境嚴重污染[3]。幾丁質酶能高效降解幾丁質，其降解的小分子幾丁寡糖在食品保健、醫(yī)藥、飼料添加劑等方面具有廣闊的應用前景，因而有關幾丁質酶及其產(chǎn)酶微生物的研究非?；钴S[4-5]。傳統(tǒng)上，幾丁質降解的研究主要集中在基于溫和條件及減少污染的酶催化降解方法的開發(fā)，在這些研究中，常常需要對幾丁質原料采用酸或堿預處理，這需要后續(xù)發(fā)酵降解所需微生物酶能夠在酸性或堿性條件下發(fā)揮催化作用，在以往報道的微生物中所產(chǎn)幾丁質酶以中性居多[6]，近來分離得到了產(chǎn)堿性幾丁質酶的微生物[7]，而產(chǎn)酸性幾丁質酶微生物的研究報道極少[8]，加之現(xiàn)有微生物的酶學性質仍不能滿足工農業(yè)應用的需要[9]，因此提高幾丁質酶的產(chǎn)酶水平和性能已成為該領域研究的熱點[10-11]?！厩叭搜芯窟M展】迄今，已有許多幾丁質酶的相關報道[12-13]，而在產(chǎn)幾丁質酶放線菌的研究中，由于放線菌所產(chǎn)幾丁質酶具有獨特的酶學特征，表現(xiàn)出對熱、pH較強的穩(wěn)定性，但這些酶基本上為中性幾丁質酶[14]，所以開展高產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌的研究具有重要的現(xiàn)實意義。大量研究表明，放線菌廣泛分布于不同的土壤生態(tài)環(huán)境中[15]，它們通過產(chǎn)生各種酶高效調節(jié)土壤中有機質的分解或合成，改善土壤肥力，促進植物生長[16-18]?！颈狙芯壳腥朦c】塊菌(Tuberspp.)作為典型的地下外生菌根真菌，同微生物及植物間相互作用、協(xié)同共生，具有重要的生態(tài)作用，其偏酸性的菌根土壤中豐富的幾丁質是塊菌生長所需的重要多糖類營養(yǎng)源之一，它們被特定功能的微生物降解后釋放單糖物質并促進塊菌的生長[19]。此外，在該環(huán)境中生活的微生物為適應這種特定生境，必然具備相應的催化活性的酶系，因而塊菌根際土壤中富含大量產(chǎn)幾丁質酶的放線菌[20-22]。迄今，雖然有關塊菌菌根土壤微生物及其功能研究不斷有新發(fā)現(xiàn)，但極少針對塊菌菌根土壤特定功能放線菌多樣性的研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究從我國西南塊菌自然產(chǎn)區(qū)特定生境菌根土壤中分離篩選高產(chǎn)酸性幾丁質酶的放線菌并鑒定，對菌株的酶學性質進行研究，旨在獲得具有特定酶學性質的酸性幾丁質酶的放線菌，為幾丁質酶的工業(yè)化應用提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 土壤樣本采集于四川攀枝花地區(qū)印度塊菌自然產(chǎn)區(qū)具有代表性的3個生態(tài)位點的菌塘(26°35′02N/101°66′76E，26°38′96N/101°67′01E，26°62′66N/101°51′44E)。在每個位點，用無菌小鏟于5～8 cm處取約200 g菌根土壤樣品混合均勻作為土樣，存放于無菌樣品袋帶回實驗室貯藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①放線菌分離培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 20、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、K2HPO40.5、NaCl 0.5、KNO31.0、瓊脂15，補充50 mg/L的制霉菌素和50 mg/L萘啶酮酸抑制真菌和其他細菌的生長；②幾丁質酶產(chǎn)生菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：膠體幾丁質 12.5、蛋白胨 2、K2HPO40.5、KNO31、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、瓊脂 15.0；③種子培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，KNO31.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；④發(fā)酵培養(yǎng)基：粉狀幾丁質 12.5、蛋白胨 2、K2HPO40.5、KNO31、NaCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01。

1.1.3 主要試劑及儀器TaqDNA 聚合酶和DNA marker：上海英俊生物公司；細菌DNA提取試劑盒：天根生物公司；細粉幾丁質：成都康迪生物公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖和大豆粉：博奧維新試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。恒溫培養(yǎng)箱(THZ-300)：上海恒科儀器有限公司；自動壓力蒸汽滅菌器(G154DW)：廈門致微儀器有限公司；7200型可見分光光度計：上海尼龍柯儀器有限公司；梯度熱循環(huán)PCR擴增儀：德國耶拿公司；凝膠成像系統(tǒng)：Bio-RAD公司。

1.2 產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌的分離和鑒定

1.2.1 產(chǎn)幾丁質酶放線菌的分離 取約1.0 g樣本土壤用無菌水適度稀釋后分別涂布于放線菌分離平板28 ℃培養(yǎng)5 d，挑取單個菌落進行菌株相似性初篩后，涂布幾丁質酶產(chǎn)生菌分離平板，于28 ℃培養(yǎng)72 h，挑選透明圈明顯的單個菌落分別接入液體篩選培養(yǎng)基，于28 ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵72 h，結束后測定發(fā)酵液的酶活力。

酶活力測定參考Imoto方法[23]進行：取5 mL發(fā)酵液于3000 r/min離心10 min，取上清液1.0 mL加入用磷酸緩沖液(pH 7.0)配制的1.0 %膠體幾丁質溶液1 mL，30 ℃水浴30 min，加DNS試劑2.0 mL，沸水浴10 min，迅速冷卻至室溫，測定OD540，根據(jù)N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準曲線計算酶活力。酶活單位定義(U)：在標準條件下，1 min催化產(chǎn)生相當于1 μmol的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.2.2 產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌的篩選 為獲得產(chǎn)酸性幾丁質酶的放線菌，在40 ℃條件下，分別測定去重復后的各菌株在pH 2.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中幾丁質酶活力，以酶活力最高者為100 %，計算各菌株在酸性條件下的相對酶活力，獲取產(chǎn)酸性幾丁質酶菌株。

1.2.3 產(chǎn)酸性酶菌株的16S rDNA鑒定 菌株的16S rDNA基因組采用試劑盒提?。籔CR擴增采用通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)，擴增體系為：10×Buffer 2.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq酶(5 U/μl) 0.2 μl，dNTPs (2.5 mmol/μl) 2 μl，引物 (10 pmol/μl)各1 μl，補水至25 μl。反應條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴增得到的16S rDNA 片段用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳分離，送成都擎科生物公司測序，所得序列通過GenBank進行BLAST比對，選取參比菌株用MEGA6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過NCBI獲取序列登錄號。

1.3 酶學性質研究

1.3.1 幾丁質酶的SDS-PAGE檢測 幾丁質酶的純化及檢測參照張新軍等[24]的方法稍作修改：吸取1 mL 3 %膠體幾丁質加入到1.5 mL離心管中，8000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入幾丁質酶發(fā)酵上清液1 mL，將膠體幾丁質沉淀重懸，于30 ℃恒溫10 min(讓幾丁質酶充分吸附于膠體幾丁質顆粒表面)，8000 r/min 離心5 min，棄上清液，沉淀用蒸餾水重懸，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，溫育 72 h，讓幾丁質酶把膠體幾丁質充分降解，然后12 000 r/min離心5 min 除去未被降解的雜質，即為待測幾丁質酶樣品，該樣品采用SDS-PAGE電泳檢測其大小。

1.3.2 初始pH和溫度對酶活力的影響 分別將200 μl純化幾丁質酶液與800 μl不同pH值(pH 3～10)的緩沖液混勻， 在不同溫度 (35～80 ℃，間隔5 ℃)條件下測酶活力，以酶活力最高者為100 %，計算不同pH、不同溫度條件下的相對酶活力，確定最適反應pH和溫度。

1.3.3 金屬離子對酶活力的影響 在幾丁質酶與底物反應的體系中，分別添加終濃度為50 mmol/L的不同金屬離子(Ag+、Cs+、Cu2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+、Al3+和Ni+)，最適溫度下水浴30 min測酶活力，以不加金屬離子反應體系的酶活力為100 %，計算相對酶活。

1.3.4 蛋白抑制劑對酶活力影響 在反應體系中，分別加入終濃度為0.5 mol/L的蛋白抑制劑EDTA、尿素、SDS和β-巰基乙醇，最適溫度下水浴30 min，分別測定各反應體系中幾丁質酶活力，以不加任何抑制劑的酶活力為100 %，分別計算相對酶活力。

1.3.5 pH和熱穩(wěn)定性試驗 將純化幾丁質酶液于pH 3～10的條件下保溫60 min取樣，于最適pH和溫度下測定幾丁質酶活力；另將酶液分別置于25、35、45、55和65 ℃的溫度下保溫10、20、30、40、50和60 min，然后迅速冷卻至最適反應溫度，在最適pH和溫度下測定幾丁質酶活力。以未處理的酶液酶活力為100 %，分別計算各pH和溫度下幾丁質酶的殘存酶活力的百分比。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株分離

采用放線菌分離培養(yǎng)基，從土壤樣本中分離到125株放線菌，經(jīng)純化后再平板培養(yǎng)獲得各菌株單菌落，對各菌株菌落形態(tài)和顯微涂片觀察，根據(jù)各菌株菌落形態(tài)和顯微結構初篩去重復得到57株放線菌，對這些菌株依次編號為SCPW01-SCPW57，經(jīng)產(chǎn)酶篩選平板培養(yǎng)后測定透明圈直徑，選取透明圈大于5 mm的單菌落，經(jīng)純化培養(yǎng)后搖瓶發(fā)酵，測定幾丁質酶活力，得到17株產(chǎn)幾丁質酶活力相對較高的放線菌菌株，結果見圖1。

由圖1可知，包括有SCPW01、SCPW03、SCPW19、SCPW20、SCPW50和SCPW55等在內的部分菌株的透明圈直徑和幾丁質酶活呈正相關性，透明圈直徑越大幾丁質酶活力越高；但是SCPW02、 SCPW10、SCPW30、SCPW39、SCPW49和SCPW54等菌株的透明圈直徑和幾丁質酶活相關性極小。另外，獲得了一些初酶活力相對較高的菌株，如編號為SCPW03的菌株酶活力為30.2 U/mL，菌株SCPW30酶活力為19.1 U/mL。

2.2 產(chǎn)酸性幾丁質酶菌株篩選

對17株產(chǎn)幾丁質酶的放線菌所產(chǎn)酶酶活采用不同pH緩沖液(pH 2、pH 3、 pH 4、 pH 5和pH 6)處理，酶活測定結果見圖2。由圖2可知，菌株SCPW31、SCPW49、SCPW53和SCPW54在pH 2～6內均沒有活性；菌株SCPW01、SCPW10、SCPW17、SCPW30和SCPW55在pH 2～4沒有活性，而在范圍pH 5～6內表現(xiàn)出輕微的催化活性，且隨pH值增加催化活性逐漸增強；菌株SCPW34和SCPW39在pH值為 5～6范圍內有48.1 %～85.2 %的活性外，其它菌株SCPW02、SCPW03、SCPW19、 SCPW20、SCPW38和SCPW50在pH 2～6的范圍內都表現(xiàn)出相對較強的酶活性。因此，通過試驗共獲得了8株酸性幾丁質酶產(chǎn)生菌，并對其進行了分子鑒定。此外，我們發(fā)現(xiàn)菌株SCPW03所產(chǎn)幾丁質酶在pH 3～4范圍內催化活性極高，超過95.4 %，而在pH 2的酸性條件下相對酶活性也大于75 %，表明該酶在極低酸值環(huán)境條件下能夠充分保持其酶活性，為嗜酸幾丁質酶。因而擬對該菌株進行了酶學性質研究。

2.3 產(chǎn)酸性幾丁質酶菌株的鑒定

對8株產(chǎn)酸性幾丁質酶菌株進行16S rDNA基因測序，測序結果同NCBI中的核酸序列比對并進行序列相似度分析，8株放線菌同GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性最高的菌株的相似性在97 %～100 %，其中相似度低于98 %的有2株菌，相似度在98 %～100 %的有4株，1株菌的相似度為100 %，但沒有相似度低于97 %的菌株獲得，基因序列登錄NCBI獲得登錄號(表1)。

圖1 產(chǎn)幾丁質酶菌株的篩選結果Fig.1 Screening of producing-chitinase strains

圖2 17株菌所產(chǎn)幾丁質酶在酸性條件下的相對酶活力Fig.2 Relative activity of chitinase from 17 strains under acidic condition

系統(tǒng)發(fā)育進化分析顯示8株產(chǎn)酶放線菌產(chǎn)生了2個不同的分類單元，這些菌株能夠被完全區(qū)分開，但所有菌株都歸于鏈霉菌屬(Streptomyces)，分布于可能的8個種，表明這些菌株間存在不同的遺傳多樣性，也表明了一個相對較遠的遺傳關系(圖3)?；谶M化樹分析，8株幾丁質酶放線菌產(chǎn)生菌被鑒定和暫命名(表1)。

2.4 S. omiyaensis SCPW03酶學性質

2.4.1 SDS-PAG及酶譜分析 菌株S.omiyaensisSCPW03發(fā)酵粗酶液的酶譜分析(圖4 Lane 1)和純化所得幾丁質酶蛋白SDS-PAGE電泳(圖4 Lane 2)所示。由圖4 Lane 1可知，發(fā)酵液里包含有至少5個蛋白條帶， 圖4 Lane 1表明該菌株至少產(chǎn)生并向胞外分泌5種以上不同分子質量的幾丁質酶，其中部分條帶在SDS-PAG凝膠上顯示不是很清晰，但呈現(xiàn)明顯條帶，推測其具有較高的酶活性。這與塊菌生境菌根土壤中該菌株高效降解幾丁質有密切關系。經(jīng)過純化后得到優(yōu)勢帶Lane 2，對照蛋白質 Marker可知該蛋白分子量約為54 kDa的蛋白為S.omiyaensisSCPW03分泌的優(yōu)勢酸性幾丁質酶。

表1 8株產(chǎn)幾丁質酶放線菌16S rRNA基因分析及親緣關系

圖3 基于8個菌株的16S rDNA 序列同源性的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 8 strains based on 16S rDNA sequences between the representative actinobacteria and the nearest type strains

2.4.2 pH和溫度對酶活力的影響 如圖5-A 所示，菌株S.omiyaensisSCPW03分泌的幾丁質酶經(jīng)不同pH緩沖液處理后，發(fā)現(xiàn)該酶在pH 3～9范圍內催化活性均>70 %，而在pH 3～4時能夠保持極高的酶活，相對酶活性均超過95 %，該酶具有較廣泛的保持活性的pH范圍，而在較低的pH條件下活性最大，再次表明該酶屬于嗜酸性幾丁質酶。

如圖5B 所示，菌株S.omiyaensisSCPW03產(chǎn)生的幾丁質酶在25～45 ℃的溫度范圍內催化活性最高(>95 %)，而在45～65 °C范圍內也具有較高的催化活性(>80 %)。繼續(xù)升高溫度酶活性明顯降低，這是由于高溫能夠改變蛋白酶的空間結構，進而影響酶的活性。因此，菌株S.omiyaensisSCPW03具有較寬的催化溫度，最適催化溫度為25～45 ℃，該酶為中溫酶。

Lane 1：幾丁質酶粗酶液的酶譜，Lane 2：純化幾丁質酶M: prestained protein ladder, Lane 1: the zymogram of the crude chintinase of S. omiyaensis SCPW03, lane 2: purified protein圖4 菌株SCPW03產(chǎn)幾丁質酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of chitinase from SCPW03

圖5 pH和溫度幾丁質酶活力的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on chitinase activity

2.4.3 金屬離子和化學抑制劑對酶活力的影響 如圖6A所示，終濃度均為50 mmol/L的Ag+，Cs+，Cu2+，F(xiàn)e2+， Mn2+、Zn2+、Mg2+，Ca2+、K+、Na+、Al3+和Ni+對菌株S.omiyaensisSCPW03產(chǎn)生的酶活性具有明顯不同的作用。其中，Ag+、Cs+、Mg2+、Al3+和Ni+對酶活力抑制作用顯著(P<0.05)，相對酶活性均低于45 %；而Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+對酶活性影響較小，相對酶活性均大于85 %；Fe2+、Mn2+則能夠顯著促進幾丁質酶活性。

化學抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對酶活性影響較小(圖6B)，表明S.omiyaensisSCPW03對這些化學抑制劑具有較好的抗性；而尿素對酶活性具有一定的抑制作用，這可能是因為尿素破壞了蛋白質分子中的氫鍵，導致蛋白質分子結構松弛，從而使其變性。

2.4.4 酶的pH和熱穩(wěn)定性 將粗酶液分別于pH 3.0～10.0范圍內，在35 ℃條件下保溫60 min取樣，于最適pH和溫度條件下測定幾丁質酶活力，結果表明幾丁質酶在pH 6.0的偏酸性條件下最穩(wěn)定，pH低于5.0或者大于7.0后酶活力迅速降低，說明該pH對幾丁質酶的穩(wěn)定性影響很大(圖7A)；熱穩(wěn)定性實驗結果表明(圖7B)，25和35 ℃保溫60 min，相對酶活保持在90 %以上，當溫度超過45 ℃，幾丁質酶活力在30 min以內其相對酶活仍然保持在90%，當超過30 min后酶活力迅速下降，可見該酶具有較寬的pH和溫度作用范圍。

3 討 論

功能微生物的研究有利于人類更好地挖掘和利用微生物資源。特定生境土壤是探索和分離鑒定幾丁質降解細菌最具活力的自然資源[25]。細菌幾丁質酶是幾丁質降解的主要因素，比如芽孢桿菌屬細菌是眾所周知的產(chǎn)高水平幾丁質酶的生產(chǎn)者[26-27]。由于產(chǎn)幾丁質酶放線菌潛在的生物活性，近年來得到了大量研究[ 28]。然而，很少關于產(chǎn)酸性幾丁質放線菌的研究報道[8]。

當前研究從攀枝花地區(qū)塊菌菌根土壤中分離到8株產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌，其酶產(chǎn)量范圍為5.5～30.0 U/mL，這一結果相比來源于其它大多數(shù)野生型細菌和真菌所產(chǎn)幾丁質酶要高，比如Conidioboluscoronatus(0.26 U/mL)[29]、Streptomycessp. (0.27 U/mL)[30]和Bacillussp. (2.24 U/mL)[31])、Verticilliumlecanii(18.2 mU/mL)[32]、Lecanicilliummuscarium(0.243 U/mL)[33]、Paenibacillussp. (11.86 U/mL)[34]。由于攀枝花地區(qū)塊菌生境菌根土壤為偏酸性土壤，而來源于塊菌菌根土壤的放線菌可能與塊菌的生長密切相關，因而從菌株篩選結果來看攀枝花地區(qū)塊菌菌根土壤是分離產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌的理想之地。

圖6 金屬離子和蛋白抑制劑對酶催化活性的影響Fig.6 Effect of metal ions and protein inhibitor on chitinase activity

圖7 pH(A)和溫度(B)對幾丁質酶的穩(wěn)定性影響Fig.7 Effect of pH and temperature on stability of chitinase

通過對高產(chǎn)酸性幾丁質酶菌株S.omiyaensisSCPW03的酶學性質研究表明，該菌所產(chǎn)幾丁質酶蛋白純化后的分子大小為54.0 kDa，其大小明顯低于其它細菌所產(chǎn)幾丁質酶蛋白(70.0、74.0 kDa)[35-36]，但是關于該菌所產(chǎn)酸性幾丁質酶的基因及其表達后蛋白性質還需要進一步研究。菌株S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)酶對不同金屬離子表現(xiàn)出明顯不同的作用，其中，Ag+、Cs+、Mg2+、Al3+和Ni+對酶活力抑制作用顯著，相對酶活性均低于45 %；而Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+對酶活性影響較??；Fe2+、Mn2+能夠顯著提高其活性?；瘜W抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對酶活性影響較小，而尿素對酶活性具有一定的抑制作用，這可能是因為尿素破壞了蛋白質分子中的氫鍵，導致蛋白質分子結構松弛，從而使其變性。

S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)幾丁質酶的最佳活性pH值范圍為3.0～4.0，該數(shù)值比已經(jīng)報道的來源于Paenibacillussp. D1的酸性幾丁質酶(pH 5.0)要低[37]，接近于Microbisporasp. V2(pH 3.0)[38]，表明該菌株所產(chǎn)酶是嗜酸幾丁質酶。菌株S.omiyaensisSCPW03所產(chǎn)幾丁質酶的最佳活性pH是6.0，具有較寬的pH穩(wěn)定范圍為4.0～9.0，這和其它酸性幾丁質的pH穩(wěn)定性相近[8]。該菌株所產(chǎn)幾丁質酶的最佳活性溫度范圍為25～45 ℃，最佳溫度為35 ℃，該溫度明顯低于Pseudomonassp. TKU015 (60 ℃)[39]和BacilluscereusIO8 (65 ℃)[40]，低溫更加有利于工業(yè)發(fā)酵；對熱穩(wěn)定性表明在低于65 ℃下持續(xù)30 min都較穩(wěn)定。

4 結 論

本研究從四川攀枝花塊菌菌根土壤中共分離到17株產(chǎn)幾丁質酶放線菌，通過在pH 2.0～6.0的酸性條件下的酶活力檢測，得到8株產(chǎn)酸性幾丁質酶放線菌?；?6S rDNA基因測序鑒定表明8株菌均為鏈霉菌屬的8個種，并對其命名。從中篩選出一株產(chǎn)酶量最高的S.omiyaensisSCPW03菌株進行酶學性質分析，該菌株所產(chǎn)幾丁質酶的分子量約為54 kDa；酶活最適反應溫度為35 ℃，在25～65 °C的溫度范圍內具有較高的催化活性；最適反應pH為4.0，該酶具有較寬的pH穩(wěn)定作用范圍(pH 3.0～9.0)；金屬離子Cu2+、Zn2+、Ca2+、K+、Na+及化學抑制劑EDTA、SDS和β-巰基乙醇對酶活性影響較小，而Fe2+、Mn2+則能顯著促進幾丁質酶活性，表明該酶對化學抑制劑較好的抵抗力。該菌所產(chǎn)酸性酶具有較多的優(yōu)良特征及較高的產(chǎn)量。今后可進一步采用基因工程技術克隆該酸性幾丁質酶基因，構建基因工程菌實現(xiàn)幾丁質酶的高效表達，提高幾丁質酶活力，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎。