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    凍存復(fù)蘇及4℃存放對(duì)成纖維細(xì)胞的影響

    2019-11-13 01:36:11李瑩王英羅浩虹吳娟英
    科技視界 2019年29期

    李瑩 王英 羅浩虹 吳娟英

    【摘 要】目的:探索凍存復(fù)蘇及4℃存放對(duì)細(xì)胞活性的影響。方法:培養(yǎng)細(xì)胞,凍存復(fù)蘇后,利用臺(tái)盼藍(lán)染色和MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性。結(jié)果:臺(tái)盼藍(lán)染色顯示,未凍存的活力平均為96.57±1.21(%),而凍存細(xì)胞的細(xì)胞活力平均為74.29±2.14(%),兩組有顯著性差異(P<0.01)。4℃保存的細(xì)胞存放超過3h以上(第4h開始),細(xì)胞的存活顯著降低。兩組細(xì)胞之間的吸光度也出現(xiàn)同樣趨勢(shì)。

    結(jié)論:細(xì)胞在4℃保存,3h內(nèi)可保持活力不變。

    【關(guān)鍵詞】成纖維;臺(tái)盼藍(lán);MTT

    中圖分類號(hào): R114 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 2095-2457(2019)29-0210-001

    DOI:10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.29.099

    隨著生物及細(xì)胞類制劑的增多,細(xì)胞在越來越多方面應(yīng)用,而細(xì)胞的存放往往限制了細(xì)胞的應(yīng)用。成纖維細(xì)胞是臨床常用的一種細(xì)胞,可以促進(jìn)細(xì)胞表皮遷移、增殖和分化[1],培養(yǎng)方法相對(duì)成熟,性狀穩(wěn)定,存活能力強(qiáng),是細(xì)胞制劑中的種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)以小鼠成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象,初步確定了復(fù)蘇后以及4℃保存狀態(tài)下的細(xì)胞狀態(tài),為細(xì)胞的臨床使用提供了依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    主要試劑:IMDM培養(yǎng)基,PBS(pH=7.4),胎牛血清,L-谷氨酰胺,青鏈霉素抗生素,0.25%胰蛋白酶(invitrogen,美國(guó)),多聚賴氨酸(sigma,美國(guó)),0.5%MTT溶液、20%SDS,臺(tái)盼藍(lán)試劑(sigma,美國(guó))。

    主要儀器:CO2培養(yǎng)箱(Thermo,德國(guó))、低速離心機(jī)、6孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板(Corning,美國(guó)),倒置顯微鏡(Olympus,日本)、酶標(biāo)分析儀、超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 成纖維細(xì)胞的制備

    取無菌條件下的小鼠皮膚組織2塊,分離真皮,剪成小塊,加0.25%胰蛋白酶反復(fù)吹打消化,用含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基清洗,離心1200r/min,8min,棄上清,按1×105/ml細(xì)胞濃度加10%牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁,據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況傳代和換液。

    1.2.2 細(xì)胞的凍存

    收集培養(yǎng)好的細(xì)胞,加入細(xì)胞凍存液(5%DMSO+45%胎牛血清),采用梯度降溫法凍存:現(xiàn)象細(xì)胞置于4℃冰箱內(nèi)放置1h,-20℃冰箱內(nèi)放置2h,-80℃超低溫冷凍過夜,最后置于液氮中保存。

    1.2.3 凍存后復(fù)蘇

    取凍存3個(gè)月的細(xì)胞,37℃水浴,快速解凍,離心洗滌后備用。

    1.2.4 臺(tái)盼藍(lán)染色

    將新鮮培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞與復(fù)蘇后的細(xì)胞懸液分別與3μL 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液混合,取少許混合液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池,于普通顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板4個(gè)大方格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。另取一組細(xì)胞,按時(shí)間(時(shí)間間隔為1h)依次取出細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液至1ml,混勻,取其中的90μL細(xì)胞懸液與10μL 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液混合,取少許混合液充至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池,1min內(nèi)讀數(shù),于普通顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板內(nèi)四個(gè)大方格內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù),胞核藍(lán)染者為死細(xì)胞。分別計(jì)算細(xì)胞存活率。

    1.2.5 MTT染色

    分別將上述細(xì)胞的細(xì)胞懸液混合均勻,培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板,每孔100ml,置于37℃,5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育,3-4d后按順序加入10μL 0.5%的MTT溶液,繼續(xù)孵育培養(yǎng)6-8h后,細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶;加入10μL 20%的SDS,繼續(xù)孵育過夜,使結(jié)晶溶解,取出用酶標(biāo)儀570nm比色,讀取各組吸光度值,算取平均值為橫坐標(biāo),時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制折線圖。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    各組計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS軟件(9.0版本)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色

    細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后,普通顯微鏡下可見活細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核透亮,死細(xì)胞核藍(lán)染。未凍存的細(xì)胞活力平均為96.57±1.21(%),而凍存細(xì)胞的細(xì)胞活力平均為74.29±2.14(%),兩組有顯著性差異(P<0.01)。將4℃存放的細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)可見,4℃保存3h以內(nèi),細(xì)胞的存活率無顯著性差異(P>0.05),而存放超過3h以上(第4h開始),細(xì)胞的存活率有顯著性差異(P<0.05)。

    2.2 MTT染色

    活細(xì)胞中的琥珀酸脫氧酶可使MTT分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀甲瓚顆粒,聚集于細(xì)胞內(nèi)或其周圍,其吸光度值與細(xì)胞數(shù)呈正比,間接反應(yīng)細(xì)胞的增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,4℃保存的細(xì)胞,在3h以內(nèi)的各組細(xì)胞吸光值之間無顯著性差異(P>0.05),4h后各組的細(xì)胞吸光值之間有顯著性差異,并有明顯的下降趨勢(shì)。

    3 討論

    細(xì)胞屬于生物制品,因此在臨床應(yīng)用中的使用不像藥品,需要注意存放的溫度,存放時(shí)間等。在本文的實(shí)驗(yàn)研究中,我們著重解決了兩個(gè)問題,一是凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率問題,二是用于臨床的細(xì)胞在4℃存放的最長(zhǎng)有效時(shí)間問題。細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中遇到的常規(guī)問題。由于組織的取材受時(shí)間地點(diǎn)等因素的限制,加之細(xì)胞的培養(yǎng)需要一定的時(shí)間,培養(yǎng)好的細(xì)胞不一定馬上應(yīng)用于臨床,因此常將細(xì)胞低溫凍存。成纖維細(xì)胞的凍存方法較多,目的是盡量減少凍存后對(duì)細(xì)胞的損傷。保護(hù)劑的選擇、溫度的控制及冷凍程序等的不同都會(huì)影響細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率、活性及克隆形成?,F(xiàn)已證實(shí),液氮凍存比-80℃冰箱的凍存效果好[2]。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們采用5%DMSO+45%胎牛血清的凍存液,確保最佳凍存效果[3]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,凍存復(fù)蘇后細(xì)胞的細(xì)胞存活率及細(xì)胞活力較未凍存細(xì)胞均有顯著性差異,說明液氮凍存對(duì)細(xì)胞的確存在損傷,但復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率仍可達(dá)到70%左右,而4℃保存3h以內(nèi),細(xì)胞活力不變。

    【參考文獻(xiàn)】

    [1]陳渴,張會(huì)波.原代人尿道狹窄成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2019,14(5):1225-1227.

    [2]游小燕,何琦琳,劉雪芹,等.一種無血清凍存液在豬胎兒成纖維細(xì)胞上的應(yīng)用研究[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2019,25(1):69-73.

    [3]白艷艷,繆競(jìng)誠(chéng),張占英,等.不同凍存方法對(duì)臍血造血細(xì)胞的影響[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2004;24(6):839-840.

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