荷花淹水脅迫下實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因的驗(yàn)證

徐君 江君 王歡

摘要：旨在篩選荷花淹水脅迫過程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，使不同脅迫處理下荷花目標(biāo)基因的定量更為準(zhǔn)確。以不同淹水脅迫時(shí)間的荷花葉片為材料，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證5個(gè)植物常用內(nèi)參基因，包括18S rRNA（18S）、actin（ACT）、elongation factor 1α（EF1α）、Histone H3（HIS）及β-tubulin（TUB）的表達(dá)水平，結(jié)合GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)其表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將優(yōu)選的2個(gè)內(nèi)參基因（18S和ACT）應(yīng)用于荷花轉(zhuǎn)錄因子基因ERFB2-1（ethylene responsive factor B2-1）和ERFB2-2的淹水脅迫表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)趨勢(shì)一致，驗(yàn)證了可靠性。本研究對(duì)荷花淹水脅迫過程中關(guān)鍵基因表達(dá)的qRT-PCR分析有重要的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：荷花;淹水脅迫;qRT-PCR;內(nèi)參基因

中圖分類號(hào)： S682.320.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0050-04

荷花（Nelumbo nucifera）是蓮科蓮屬的多年生挺水植物，是我國十大名花之一[1]。荷花原產(chǎn)我國，具有分布范圍廣、種質(zhì)資源豐富、群體花期時(shí)間長及葉色碧綠等特點(diǎn)，深受人們的喜愛，加上經(jīng)濟(jì)用途廣泛，文化底蘊(yùn)深厚，因而成為極好的水景美化植物和家庭園藝常用植物[2]。荷花是一種水生花卉，環(huán)境的變化使荷花時(shí)常要面對(duì)淹水脅迫影響[3]，因此，耐淹水脅迫資源和基因的挖掘是荷花育種目標(biāo)之一。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，功能基因研究已成為植物耐脅迫育種的重要輔助手段，而基因的表達(dá)分析則是植物功能基因研究的基礎(chǔ)[4-5]。在比較耐淹荷花品種和淹水敏感型荷花品種功能基因差異表達(dá)的研究過程中，較多的涉及到應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，簡稱qRT-PCR）驗(yàn)證和分析基因的表達(dá)模式和水平，為了校正不同樣本RNA提取效率、質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增效率上的差異，試驗(yàn)中需要用到在實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞中能夠恒定表達(dá)的基因也就是內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，因此，篩選淹水脅迫條件下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因?qū)RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果的可靠性有著關(guān)鍵的作用。

迄今，國內(nèi)外對(duì)黃花蒿[8]、天藍(lán)苜蓿[9]、牡丹[10]等多種植物在不同試驗(yàn)條件下進(jìn)行了內(nèi)參基因的篩選，對(duì)荷花花瓣著色過程中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也有研究報(bào)道[11]，但對(duì)荷花在淹水脅迫條件下內(nèi)參基因的篩選則沒有報(bào)道。本研究選取了植物研究中常用的內(nèi)參基因18S核糖體RNA（18S）、肌動(dòng)蛋白（ACT）、轉(zhuǎn)錄延伸因子（EF1α）、組蛋白H3（HIS）及微管蛋白（TUB）作為候選基因，研究荷花不同淹水脅迫時(shí)間下這5個(gè)基因的表達(dá)，利用內(nèi)參基因穩(wěn)定性參考軟件BestKeeper[12]、GeNorm[13]及NormFinder[14]對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為后續(xù)探索荷花耐淹水脅迫條件下的基因表達(dá)分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2015年9月在河北白洋淀原生境收集的荷花“白洋淀紅蓮”種子為材料，種子曬干后保存。2017年5月，對(duì)種子尾部破殼，在25 ℃及16 h/d光照條件下浸種，胚軸發(fā)生1～2周后，選取芽長度一致的小苗用于淹水脅迫試驗(yàn)。淹水試驗(yàn)在培養(yǎng)箱內(nèi)的水桶中進(jìn)行，以小苗全部浸沒水中為處理組，淹水脅迫時(shí)間為1、2、4、12 h，以未淹水處理荷花幼苗作對(duì)照。采集葉片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 葉片總RNA提取及cDNA第一鏈合成

葉片總RNA提取方法參照上海生工生物工程有限公司（簡稱上海生工）柱式植物總RNA抽提純化試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：B518661-0100）。利用瓊脂糖凝膠電泳及Nano drop2000檢測(cè)總RNA質(zhì)量。cDNA第一鏈合成采用上海生工M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：B532435-0020）。反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)Nano drop檢測(cè)，稀釋至20 ng/μL，放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 內(nèi)參基因選擇及qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

選擇常用的5個(gè)荷花看家基因作為內(nèi)參候選基因，包括18S、ACT、EF1α、HIS及TUB（表1），根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計(jì)原則，采用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)引物，并在NCBI-BLAST上對(duì)引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。合成片段經(jīng)普通PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并經(jīng)熔解曲線分析驗(yàn)證后，用于qRT-PCR試驗(yàn)。

1.4 內(nèi)參基因RT-PCR試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

內(nèi)參基因的RT-qPCR試驗(yàn)在楓嶺FTC-3000 Real-Time PCR儀完成，反應(yīng)參照上海生工2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：B639271-0005）。反應(yīng)體系：2×SG Fast qPCR Master mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA模板1 μL，DNF Buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。每個(gè)樣本重復(fù)3次，擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析。所得結(jié)果分別采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片總RNA提取質(zhì)量及引物特異性鑒定

Nano drop2000檢測(cè)顯示，提取總RNA的D260 nm/D280 nm數(shù)值為1.9～2.0，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。以對(duì)照葉片cDNA為模板，采用表1的7對(duì)引物對(duì)5個(gè)候選基因及2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，且片段大小均在100 bp左右（圖1），與預(yù)期擴(kuò)增大小一致。進(jìn)一步對(duì)cDNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各基因的熔解曲線只有明顯的單一信號(hào)峰（圖2），說明7對(duì)引物均可特異擴(kuò)增相應(yīng)片段，其反應(yīng)特異性高，結(jié)果可靠，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 候選基因CT值 CT值與基因表達(dá)量成反比，CT值越大，表達(dá)量越小。圖3為5個(gè)候選內(nèi)參基因在淹水脅迫處理不同時(shí)間后，在荷花葉片中qRT-PCR反應(yīng)的CT值。結(jié)果

表明，5個(gè)看家基因的CT值為21～32，其中，ACT的CT值最小，為21.244 1～22.666 2，說明該基因平均表達(dá)水平最高;HIS的CT值最大，為27.498 5～31.136 1，說明該基因平均表達(dá)水平最低，且其表達(dá)量要明顯低于另外4個(gè)候選基因。

2.2.2 軟件分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性 BestKeeper、GeNorm和NormFinder是3種常用的內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件。表2為3種軟件對(duì)5個(gè)候選內(nèi)參基因在荷花葉片不同時(shí)間淹水脅迫處理時(shí)間下qRT-PCR反應(yīng)的表達(dá)量穩(wěn)定性分析結(jié)果。BestKeeper根據(jù)內(nèi)參基因的CT值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），SD值越小，則表示該基因穩(wěn)定性越好，根據(jù)該軟件分析結(jié)果，18S與ACT的SD值最小，表明二者的表達(dá)量在荷花淹水脅迫處理過程中最為穩(wěn)定，其次為EF1α和TUB，而HIS的表達(dá)穩(wěn)定性較差。GeNome根據(jù)平均表達(dá)穩(wěn)定性指數(shù)M確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，M值越大，基因的穩(wěn)定性越低，根據(jù)該軟件分析結(jié)果顯示，ACT的M值最小，表達(dá)穩(wěn)定性最高，其次為18S，HIS的M值最大， 表達(dá)穩(wěn)定性最差。NormFinder使用Excel軟件計(jì)算基因的穩(wěn)定值M，M值越小，則該基因越穩(wěn)定，該軟件分析結(jié)果與GeNome一致，5個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性從高到低排序?yàn)锳CT>18S>EF1α>TUB>HIS。綜合表現(xiàn)看，ACT和18S為淹水脅迫不同時(shí)間處理下表達(dá)量最穩(wěn)定的2個(gè)基因。而HIS在荷花淹水脅迫過程中表達(dá)最不穩(wěn)定。

2.2.3 優(yōu)選內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選內(nèi)參基因基因18S和ACT在荷花淹水脅迫過程中對(duì)qRT-PCR計(jì)算結(jié)果的影響，分別以18S和ACT為內(nèi)參基因，以淹水脅迫1、2、4 h的荷花白洋淀紅蓮幼苗為材料，未淹水材料為對(duì)照，采用qRT-PCR檢測(cè)了荷花ERFB2-1和ERFB2-2基因在不同脅迫時(shí)間處理下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示，隨著淹水脅迫時(shí)間的延長，ERFB2-1表達(dá)量先明顯增加，后呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢(shì);而ERFB2-2的表達(dá)量則較為穩(wěn)定。以18S為內(nèi)參時(shí)，目的基因ERFB2-1和ERFB2-2在荷花不同時(shí)間淹水脅迫處理下表達(dá)模式與以ACT為內(nèi)參時(shí)的變化規(guī)律一致。

3 討論與結(jié)論

qRT-PCR技術(shù)以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)目的基因的表達(dá)量，具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，目前已成為研究中檢測(cè)或比較基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)[12]。在植物研究中，ACT、EF1α等是常用的內(nèi)參基因，但近年來越來越多的研究顯示，真正恒定表達(dá)的基因不存在，脅迫條件不同，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也不盡相同。如大豆在干旱脅迫條件下，穩(wěn)定表達(dá)的基因?yàn)門UB和EF1α[13];在鹽脅迫下穩(wěn)定的內(nèi)參基因則為ACT[14];低磷脅迫下則是18S和TUB最為穩(wěn)定[15]。因此，qRT-PCR試驗(yàn)前提是選擇合適的內(nèi)參基因，以確保在不同因素下基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果的可靠和穩(wěn)定。

本研究分析了荷花白洋淀紅蓮在淹水脅迫下內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，GeNorm和NormFinder的分析結(jié)果一致，而與BestKeeper的分析結(jié)果存在差異，雖然3種軟件分析結(jié)果略有不同，但對(duì)大部分候選基因穩(wěn)定性的分析結(jié)果一致，其中HIS在淹水脅迫不同時(shí)間表達(dá)差異較為劇烈，而18S和ACT在荷花淹水脅迫過程中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。18S核糖體RNA由于在植物體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定、豐度高，而被認(rèn)為是合適的內(nèi)參基因。但近期有研究顯示，在部分植物，如小麥、苜蓿中，18S的CT值均小于15，表達(dá)豐度過高，容易忽視背景造成的差異從而影響基因定量的準(zhǔn)確性[16]。本研究試驗(yàn)條件下，荷花葉片18S的CT值在24左右，表達(dá)豐度適中，適于作為內(nèi)參基因。而ACT則是最為常用的內(nèi)參基因，在荷花花瓣色素形成過程中也是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一[11]。本研究中，以18S和ACT分別作為內(nèi)參時(shí)，2個(gè)目的基因表達(dá)趨勢(shì)均一致，說明在荷花淹水脅迫qRT-PCR試驗(yàn)過程中，以18S或ACT作為內(nèi)參基因具有可靠性。

綜上所述，本研究認(rèn)為，在運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)研究荷花淹水脅迫下基因表達(dá)時(shí)，可選用18S或ACT作為內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析關(guān)鍵基因在荷花應(yīng)對(duì)淹水脅迫中的作用研究提供了參考。

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