豬熱休克蛋白40Hsp40基因的克隆及過(guò)表達(dá)和RNA干擾載體的構(gòu)建

卓嚴(yán)玲 顏秋 鄧啟霞

摘要：熱休克蛋白（Hsp）是在各種生物體內(nèi)廣泛分布的一類具有高度保守性、短時(shí)性、多樣性等特點(diǎn)的熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞的多種生理生化活動(dòng)。已有研究表明，Hsp40在多種病毒感染細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其對(duì)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）復(fù)制的影響及機(jī)制尚不清楚。為了探究Hsp40在PCV2感染中的生物學(xué)功能，在克隆豬Hsp40基因CDS區(qū)全基因序列的基礎(chǔ)上，采用雙酶切位點(diǎn)法分別構(gòu)建豬Hsp40基因的過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體。該研究為豬Hsp40轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的構(gòu)建搭建好平臺(tái)，同時(shí)也為挖掘豬Hsp40對(duì)PCV2感染的響應(yīng)機(jī)制提供極大的便利。

關(guān)鍵詞：豬熱休克蛋白40;過(guò)表達(dá)載體;RNA干擾載體;豬圓環(huán)病毒2型

中圖分類號(hào)： S852.65+9.2; Q78 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0063-04

豬圓環(huán)病毒2型是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）的主要病原體[1-2]，我國(guó)于2001年首次報(bào)道該病，目前已成為危害我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要傳染病之一[3-4]。然而，直到現(xiàn)在人們對(duì)PCV2的復(fù)制機(jī)理和致病機(jī)制仍然不是很清楚，尤其對(duì)PCV2感染過(guò)程中病毒DNA和蛋白與宿主胞內(nèi)蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)及其所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義更是知之甚少。PCV2作為能夠感染哺乳動(dòng)物的最小病毒之一，其基因組的編碼能力有限，必須依賴于宿主細(xì)胞內(nèi)的酶類才能完成復(fù)制增殖，因此PCV2不得不借助其病毒DNA和蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)的各種基因相互作用來(lái)調(diào)控宿主免疫應(yīng)答，如導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌失調(diào)、免疫抑制和疾病等，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)病毒復(fù)制和致病機(jī)制的調(diào)控[5]。其中，有關(guān)PCV2衣殼蛋白Cap與豬熱休克蛋白40（Hsp40）互作的文獻(xiàn)報(bào)道最早見(jiàn)于2009年，但至今仍無(wú)關(guān)于此研究的新進(jìn)展，特別是它們二者之間是否真的互作以及這種互作所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義目前尚不清楚[5-6]。

Hsp40是一類跨物種存在的蛋白家族，存在于各種生物體的線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，并對(duì)蛋白翻譯、折疊、去折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等起重要作用[7]，同時(shí)還可以通過(guò)與病毒蛋白或病毒復(fù)制復(fù)合體結(jié)合對(duì)多數(shù)病毒的復(fù)制產(chǎn)生影響[8]。其中，不僅有很多動(dòng)物病毒和植物病毒，而且還涵蓋了許多DNA和RNA病毒。因此，既然已有研究表明PCV2 Cap與宿主Hsp40蛋白之間存在相互作用，那么就有必要進(jìn)一步探究Hsp40對(duì)PCV2復(fù)制的影響及機(jī)制。

目前，研究某一基因的生物學(xué)功能往往須要使其正常的表達(dá)量上調(diào)或者下調(diào)，其中最常用的方法就是構(gòu)建其過(guò)表達(dá)和RNA干擾載體，其中雙酶切位點(diǎn)法又是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的最普遍方法。為此，本研究利用雙酶切位點(diǎn)法分別構(gòu)建豬Hsp40基因的過(guò)表達(dá)和RNA干擾載體，從而為其進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為進(jìn)一步明確豬Hsp40基因在PCV2病毒感染過(guò)程中的生物學(xué)功能提供了高效便捷的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織、菌株及載體 脾臟組織采自3日齡美系大白豬，該豬呈CSFV、PRRSV和PCV2陰性;大腸桿菌DH5α，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;真核表達(dá)載體pEGFP-C1和RNA干擾載體pCDH-U6-MCS-EF1-GreenPuro（簡(jiǎn)寫為pCDH-U6），均由西北農(nóng)林科技大學(xué)張彥明教授饋贈(zèng)。本試驗(yàn)于2018年上半年在玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ和BamHⅠ）、T4 ligase、PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser和Trizol，均購(gòu)自TaKaRa公司;膠回收試劑盒、高純質(zhì)粒小量提取試劑盒和UltraPower核酸染料，均購(gòu)自北京百泰克生公司;DL 2000和Trans 2K plus DNA marker，均購(gòu)自北京全式金公司;Pfu高保真擴(kuò)增酶和溴化乙錠（EB），均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司;瓊脂糖，購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬Hsp40基因序列（XM_003131409），利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增豬Hsp40基因的引物，上游引物Hsp40-F：5′-CGGAATTCTATGGCGGCTGCCGCGGAGTGCGATG-3′（下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物Hsp40-R：5′-CGGGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCAAACTGGAAAAAGAAATTC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為Flag標(biāo)簽序列）。待測(cè)出克隆獲得的豬Hsp40基因序列后，利用Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設(shè)計(jì)軟件（https：//rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）設(shè)計(jì)出豬Hsp40基因的5對(duì)干擾序列和1對(duì)陰性對(duì)照序列[9]，引物信息詳見(jiàn)表1。為載體構(gòu)建鑒定需要，本研究參照文獻(xiàn)[9]合成了上游引物5′-TTCTTGGGTAGTTTGCAGTT-3′和下游引物5′-CGGAGCCAGTACACGACA-3′，分別命名為U6-F和U6-R。以上引物全由北京華大基因公司合成。

1.2.2 組織總RNA提取與cDNA的制備 取100 mg豬脾臟組織置于研缽中，加入適量液氮并研磨完全后，將樣品移入離心管中，利用Trizol法抽提總RNA，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。待測(cè)定出所提取總RNA濃度后，按照PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser說(shuō)明書制備cDNA。

1.2.3 豬Hsp40基因的擴(kuò)增 以上述制備的cDNA為模板，Hsp40-F和Hsp40-R為上、下游引物，利用Pfu高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為：Hsp40-F 1.0 μL、Hsp40-R 1.0 μL、2×Pfu高保真酶10.0 μL、cDNA 1.0 μL，ddH2O加至20 μL。反應(yīng)程序包括：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s，68 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃ 結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.2.4 豬Hsp40基因真核表達(dá)載體和RNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定 將上述含有目的基因片段的凝膠用手術(shù)刀快速切下并放置于2.0 mL的離心管中，按照膠回收試劑盒的說(shuō)明書純化出PCR產(chǎn)物，置于-20 ℃保存。將純化后的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pEGFP-C1分別用EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系為：10×K buffer 2.0 μL、BamHⅠ 1.0 μL、EcoRⅠ 1.0 μL、PCR產(chǎn)物或pEGFP-C1載體加至20 μL。反應(yīng)條件為：37 ℃ 2 h，加入2 μL 10×Loading buffer終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物再次經(jīng)電泳和膠回收后，利用T4 DNA連接酶于 4 ℃ 過(guò)夜條件下將PCR產(chǎn)物連入pEGFP-C1載體，反應(yīng)體系為：T4 ligase 1.0 μL、T4 ligase buffer 1.0 μL、pEGFP-C1載體1.5 μL、PCR產(chǎn)物加至20 μL，最終得到重組 pEGFP-Hsp40載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌置于LB液體培養(yǎng)基（Kan+）中擴(kuò)大培養(yǎng) 12～16 h，按高純質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證后，送由北京華大基因公司測(cè)序。應(yīng)用DNA Star軟件（MegAlign）對(duì)克隆獲得的豬Hsp40基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。將測(cè)得的豬Hsp40基因序列拷貝進(jìn)Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設(shè)計(jì)軟件并按其說(shuō)明設(shè)計(jì)出相應(yīng)的RNA干擾序列，將合成的各shRNA干擾序列按照事先設(shè)定好的PCR程序（95 ℃ 30 s;90 ℃ 30 s;85 ℃ 30 s;80 ℃ 30 s;75 ℃ 30 s;70 ℃ 30 s;65 ℃ 30 s;60 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s;50 ℃ 30 s）進(jìn)行退火，然后使用T4 DNA Ligase將其與經(jīng)Eco RI和Bam HI雙酶切過(guò)的pCDH-U6干擾載體進(jìn)行4 ℃過(guò)夜連接，分別得到5條干擾載體（pCDH-U6-Hsp40-sh1、pCDH-U6-Hsp40-sh2、pCDH-U6-Hsp40-sh3、pCDH-U6-Hsp40-sh4、pCDH-U6-Hsp40-sh5）和1條陰性對(duì)照載體（pCDH-U6-Hsp40-shN），分別簡(jiǎn)寫為Hsp40-sh1、Hsp40-sh2、Hsp40-sh3、Hsp40-sh4、Hsp40-sh5和Hsp40-shN，統(tǒng)稱為重組干擾載體。以構(gòu)建的各重組干擾載體及pCDH-U6空載體為模板，利用引物 U6-F/U6-R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物加入12 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行核酸電泳檢測(cè)，檢測(cè)正確后送由北京華大基因公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬脾臟總RNA的提取

利用Trizol法提取豬脾臟組織總RNA后，取5 μL加入12 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果可見(jiàn)3條清晰的電泳條帶，從下往上分別是5S rRNA、18S rRNA和28S rRNA，且條帶亮度28S ∶ 18S≥1（圖1）。經(jīng)核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)，其D260 nm/D280 nm=1.96，濃度為780 mg/L，表明所提取的總RNA純度較高、完整性良好，適用于后續(xù)的cDNA制備。

2.2 豬Hsp40基因的克隆

以豬脾臟組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，Hsp40-F/Hsp40-R為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物加入12 g/L瓊脂糖凝膠中檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)1條大小約為1 485 bp的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 豬Hsp40基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-Hsp40經(jīng)EcoRⅠ和 BamHⅠ 雙酶切，反應(yīng)體系經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)1條大小約為4 700 bp載體片段和1條大小約 1 485 bp 的目的基因片段，與預(yù)測(cè)的片段大小基本一致，說(shuō)明 pEGFP-Hsp40重組過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其正確性，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送北京華大基因公司測(cè)序并將測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道的豬Hsp40基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間的核苷酸序列同源性為99.8%，氨基酸序列同源性為99.4%，說(shuō)明豬Hsp40基因克隆成功且構(gòu)建的pEGFP-Hsp40重組過(guò)表達(dá)載體成功，測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

2.4 豬Hsp40基因RNA干擾載體的構(gòu)建和鑒定

以構(gòu)建好的豬Hsp40基因RNA干擾載體和pCDH-U6空載體為模板，U6-F/U6-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物置于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6?？梢?jiàn)Hsp40-sh1、Hsp40-sh2、Hsp40-sh3、Hsp40-sh4、Hsp40-sh5、Hsp40-shN和pCDH-U6干擾質(zhì)粒經(jīng)引物 U6-F/U6-R PCR擴(kuò)增后分別得到大小約為359、359、359、359、359、359、300 bp的DNA條帶，表明各干擾序列均已被成功插入到pCDH-U6載體，即豬Hsp40基因各重組干擾載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

自dsRNA被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，RNA干擾技術(shù)逐漸稱為研究基因功能的一種有效方法，其形成的發(fā)夾RNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別并降解與之高度保守的同源mRNA，從而使基因沉默[11-14]。近年來(lái)，由于RNA干擾技術(shù)具有高效、簡(jiǎn)便和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，其已被廣泛應(yīng)用于各種生物基因表達(dá)調(diào)控和功能基因的挖掘與鑒定等領(lǐng)域，尤其在動(dòng)物、植物和微生物等的品質(zhì)改良中得到成功應(yīng)用[15-17]。目前，盡管載體構(gòu)建的方法多種多樣，構(gòu)建策略也逐步完善，但傳統(tǒng)的“酶切-連接”方法因其操作簡(jiǎn)便、成本低廉仍是應(yīng)用最普遍的方法。本研究利用“酶切-連接”方法成功構(gòu)建了豬Hsp40基因的真核過(guò)表達(dá)載體和RNA干擾載體。

由于有關(guān)豬Hsp40蛋白生物學(xué)功能的研究相對(duì)較少，所以目前市場(chǎng)上或各大實(shí)驗(yàn)室都還沒(méi)有該蛋白抗體的文獻(xiàn)報(bào)道，筆者在構(gòu)建其真核表達(dá)載體時(shí)，在豬Hsp40基因的C端添加了1個(gè)Flag標(biāo)簽，使將來(lái)便于豬Hsp40蛋白的檢測(cè)。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，插入的Flag標(biāo)簽序列與當(dāng)初設(shè)計(jì)一致，沒(méi)有突變和移碼現(xiàn)象;與此同時(shí)，測(cè)得的豬Hsp40基因序列與GenBank已發(fā)表的豬Hsp40基因的序列同源性達(dá)99.8%，氨基酸同源性達(dá)99.4%，證明克隆獲得的豬Hsp40基因正確，可用于后續(xù)RNA干擾序列設(shè)計(jì)的靶基因。

將克隆獲得的豬Hsp40基因序列放入Thermo Fisher Scientific公司的shRNA在線設(shè)計(jì)軟件，筆者設(shè)計(jì)了其RNA干擾序列，且此干擾序列的設(shè)計(jì)是一次性合成的，既避免了原始的“酶切-連接”方法無(wú)一例外地需要多輪酶切連接反應(yīng)，又盡可能地降低成本。由于設(shè)計(jì)出的每一條shRNA干擾序列引物只有59 bp，因此將合成后的各上、下游引物經(jīng)連續(xù)退火后直接與已經(jīng)雙酶切過(guò)的pCDH-U6干擾載體相連接。鑒于59 bp這個(gè)長(zhǎng)度太短，市場(chǎng)上也很少有如此低標(biāo)準(zhǔn)的DNA marker可用，采用PCR方法和基因測(cè)序法對(duì)插入的各個(gè)shRNA干擾序列進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證是可行的。由于筆者是根據(jù)pCDH-U6干擾載體的全基因序列在其多克隆位點(diǎn)的上游和下游分別設(shè)計(jì)引物（U6-F/U6-R）且擴(kuò)增出來(lái)的基因片段大概為300 bp，因此一旦設(shè)計(jì)出的RNA干擾序列成功插入pCDH-U6干擾載體，那么再用引物（U6-F/U6-R）擴(kuò)增構(gòu)建好的各重組干擾載體時(shí)就將會(huì)得到1條約360 bp DNA電泳條帶，由于在DNA凝膠電泳中360 bp顯著大于300 bp，因此可以根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的高低大致判斷出所構(gòu)建的載體是否正確。圖5、圖6顯示，本研究構(gòu)建的豬Hsp40基因RAN干擾載體經(jīng)PCR鑒定是正確的，目前有關(guān)其遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株系建立的研究尚在進(jìn)行中。本研究的載體構(gòu)建策略以其步驟簡(jiǎn)便、效率可觀等特點(diǎn)可被廣泛運(yùn)用于各生物表達(dá)載體及干擾載體的構(gòu)建當(dāng)中。本研究載體構(gòu)建成功的目的是通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式將pEGFP-Hsp40和Hsp40-shRNA轉(zhuǎn)入PCV2宿主細(xì)胞中并篩選出其相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株系，從而為研究Hsp40對(duì)PCV2復(fù)制的影響和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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