ALT與凋亡因子檢測(cè)在乙肝急性期的臨床價(jià)值探討

胡曉梅 王小中

1 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 （江西 贛州 341000）2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 （江西 南昌 330006）

內(nèi)容提要： 目的：分析乙肝患者急性期血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與凋亡因子表達(dá)的相關(guān)性及其臨床價(jià)值。方法：抽取剛?cè)朐阂腋位颊?0例作為觀察對(duì)象，同時(shí)選取體檢健康人員50名作為對(duì)照組，采集兩組研究對(duì)象的血液樣本，對(duì)ALT等指標(biāo)進(jìn)行觀察。結(jié)果：觀察組乙肝患者在急性期，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，升高趨勢(shì)明顯，組間差異（P＜0.05），與ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系。與對(duì)照組健康人員進(jìn)行對(duì)比，觀察組乙肝患者外周血清中sDR5水平降低水平顯著，組間差異（P＜0.05），與TRAIL表達(dá)存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：在乙肝患者臨床診斷中，需要對(duì)患者進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與膽紅素等檢查，同時(shí)還需要借助于血清學(xué)檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物結(jié)果作出最終診斷。而本次研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL表達(dá)與ALT水平存在正相關(guān)關(guān)系，代表急性期乙肝患者存在肝細(xì)胞凋亡增加的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，sDR5水平與正常人對(duì)比明顯較低，與TRAIL表達(dá)存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，代表肝細(xì)胞核內(nèi)DR5的表達(dá)存在上調(diào)可能。

以往有學(xué)者提出，乙肝患者急性期sDR5水平與TRAIL表達(dá)會(huì)出現(xiàn)異常表現(xiàn)。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是被發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子的其中一個(gè)構(gòu)成部分，能夠在與受體結(jié)合后，短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與病毒感染細(xì)胞的凋亡。在本次研究中，針對(duì)50例乙肝患者及50例體檢健康人員相關(guān)檢查結(jié)果進(jìn)行了調(diào)查，探究凋亡分子及其可溶性受體與ALT之間的相關(guān)關(guān)系，報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

在2017年3月～2018年3月收治在本院的乙肝患者中，隨機(jī)抽取出50例作為本次研究的觀察組，同時(shí)選取健康體檢人員50例作為對(duì)照組。觀察組50例患者中：男28例，女22例，年齡20～64歲，平均（42.26±6.68）歲。對(duì)照組：男27例，女23例，年齡21～64歲，平均（43.05±6.07）歲。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為乙肝；ALT大于正常水平超過兩倍。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)檢查排除乙肝；臨床資料完整。對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩組研究對(duì)象的年齡及性別分布情況均無(wú)明顯差異，可做對(duì)比研究。

1.2 方法

（1）Ficoll法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞

抽取靜脈血3mL，后加入同樣量的PBS液促使血液被稀釋，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液提取患者與正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞。分離血清檢測(cè)可溶性sDR5。

（2）總RNA的抽提

將預(yù)備提RNA的細(xì)胞沉淀并加入Trizol試劑后反復(fù)吹打溶解細(xì)胞。應(yīng)用苯酚-氯仿-異丙醇方法抽提總RNA，用VASTECH NV3000 C核酸定量?jī)x檢測(cè)制備RNA樣品濃度與純度。

表1. 引物序列

（3）逆轉(zhuǎn)錄

采 用 Prime Script?RT Reagent Kit逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑（TaKaRa），按試劑盒說明書操作，依據(jù)以上總RNA為模板制備cDNA。

（4）PCR檢測(cè)

引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank庫(kù)中TRAIL相應(yīng)cDNA序列進(jìn)行，以β-actin為內(nèi)參基因（表1），由上海生工合成。采用SYBR Premix Ex Taq?II熒光定量PCR試劑（TaKaRa），按試劑盒說明書以cDNA為模板加入上下游引物和Taq酶在SLAN96S熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。TRAIL的表達(dá)水平以2-ΔΔCt方式計(jì)算。

（5）sDR5檢測(cè)

上清液sDR5的檢測(cè)用ELISA方法，試劑為上海江萊生物科技有限公司提供，依據(jù)說明書進(jìn)行后用酶標(biāo)儀做吸光度讀數(shù)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出濃度。

1.3 儀器

本次研究中所用儀器為，中科中佳KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)，上海百典數(shù)顯電熱恒溫水浴箱，VASTECH NV3000 C核算定量?jī)x；上海宏石熒光定量PCR儀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本次研究當(dāng)中的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用±s表示，以t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 兩組對(duì)象TRAIL表達(dá)對(duì)比

如圖1所示，觀察組乙肝患者在急性期，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，升高趨勢(shì)明顯，組間差異（P＜0.05），與ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系。

圖1. 兩組TRAIL表達(dá)情況

2.2 兩組對(duì)象外周血清中sDR5水平對(duì)比

如圖2所示，與對(duì)照組健康人員進(jìn)行對(duì)比，觀察組乙肝患者外周血清中sDR5水平降低水平顯著，組間差異（P＜0.05），與TRAIL表達(dá)存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2. 兩組對(duì)象外周血清中sDR5表達(dá)情況

3.討論

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是被發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子的其中一個(gè)構(gòu)成部分，能夠在與受體結(jié)合后，短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與病毒感染細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，多數(shù)組織細(xì)胞均無(wú)毒性，在機(jī)體中的免疫監(jiān)督效果較為顯著。TRAIL受體有5個(gè)，而參與凋亡反應(yīng)的主要是死亡受體DR4與DR5等。以往有研究資料顯示，乙肝患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡的發(fā)生率要明顯大于健康人群，分析其可能為乙肝慢性化關(guān)鍵因素之一[1]。而本次研究中也發(fā)現(xiàn)，觀察組乙肝患者在急性期，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，升高趨勢(shì)明顯，組間差異（P＜0.05），與ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系。外周血單個(gè)核細(xì)胞大量凋亡的機(jī)制在現(xiàn)代臨床中還未有明確的解釋，但認(rèn)為其與T細(xì)胞抗原受體異常活化之間具有某種聯(lián)系。TRAIL是一種在FASL之后被明確的腫瘤壞死因子中一個(gè)部分，其主要特征在于能夠分布到眾多組織及細(xì)胞中。TRAIL還具有著顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，可在與死亡受體的結(jié)合下，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞與病毒感染細(xì)胞的凋亡[2]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRAIL的基本功能，且其與其他家族成員進(jìn)行對(duì)比，分子結(jié)構(gòu)較為相似。有報(bào)道顯示，HBV全基因組與HBx能夠經(jīng)由上調(diào)凋亡通路分子Bax的表達(dá)，preS2蛋白經(jīng)由活化ERK通路，強(qiáng)化TRAIL誘導(dǎo)的凋亡，而HBc蛋白能夠經(jīng)由下調(diào)死亡受體DR5水平，對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡加以抑制[3]。在本次研究中，乙肝患者急性期外周血單個(gè)核細(xì)胞中的TRAIL表達(dá)與正常人群對(duì)比明顯升高，同時(shí)與ALT水平存在正相關(guān)關(guān)系。此結(jié)果所代表的是，乙肝急性期中，可能會(huì)出現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡的增加，而凋亡的增加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)疾病的發(fā)展，形成惡性循環(huán)。但值得關(guān)注的問題是，患者外周血清中可溶性配體sDR5水平呈現(xiàn)出差異化，與對(duì)照組健康人員進(jìn)行對(duì)比，觀察組乙肝患者外周血清中sDR5水平降低顯著，組間差異（P＜0.05），與TRAIL表達(dá)存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此結(jié)果所代表的是，肝細(xì)胞核內(nèi)DR5的表達(dá)存在上調(diào)的可能性，表達(dá)上調(diào)的DR5屬于TRAIL升高引發(fā)負(fù)反饋現(xiàn)象，但是，此種變化會(huì)致使外周分泌水平的下降。以往有研究結(jié)果顯示，在影響靶細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡敏感性的因素中，受體水平因素影響屬于一個(gè)方面，另外胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑中還存在諸多分子的參與[4,5]?；诖?，針對(duì)影響HBV感染后外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)TRAIL凋亡敏感性的機(jī)制還需要展開更為深入的探究。本次研究成果對(duì)分析乙肝疾病發(fā)展具有積極作用，能夠?yàn)槲磥?lái)乙肝所導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究提供參考。

綜上所述，在乙肝患者臨床診斷中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶需要對(duì)患者進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）與膽紅素等檢查，同時(shí)還需要借助于血清學(xué)檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)志物結(jié)果作出最終診斷。而本次研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL表達(dá)與ALT水平存在正相關(guān)關(guān)系，代表急性期乙肝患者存在肝細(xì)胞凋亡增加的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，sDR5水平與正常人對(duì)比明顯較低，與TRAIL表達(dá)存在負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，代表肝細(xì)胞核內(nèi)DR5的表達(dá)存在上調(diào)可能。