茶樹‘龍井43’扦插不定根發(fā)生過程生理機(jī)制研究

左巧麗，谷 星，王超軍，魯占領(lǐng)，鮑 露

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

我國(guó)是世界上最大的產(chǎn)茶國(guó)，茶（Camellia sinensis）產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路是實(shí)現(xiàn)良種無性繁殖，這種繁殖方式被廣泛應(yīng)用于植物中，尤其是木本植物。目前，短穗扦插也成為茶樹無性繁殖的主要方式。茶樹扦插的成活率主要在于不定根的形成，茶樹不定根的產(chǎn)生過程，從形態(tài)上大致分為愈傷組織形成期、根原基形成期、根端伸長(zhǎng)期以及根系形成期。它屬于一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，并同時(shí)受到內(nèi)外不同因素的調(diào)控。內(nèi)在因素主要在于內(nèi)源激素的變化、酶活性的變化以及酚類物質(zhì)含量的變化等，而吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）是目前公認(rèn)的與不定根關(guān)系最密切三種酶類。外在因素主要是環(huán)境因子，如溫度、光照、水分等。

有研究報(bào)道認(rèn)為生長(zhǎng)素對(duì)不定根的形成起著關(guān)鍵作用，在茶樹中，生長(zhǎng)素萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)不定根的形成，柴紅玲等發(fā)現(xiàn)NAA對(duì)茶樹扦插生根率的提高極顯著優(yōu)于其他外源激素，但是關(guān)于NAA對(duì)茶樹不定根形成過程中的誘導(dǎo)的機(jī)理性研究還較少。本研究以‘龍井43’為試材，用300 mg/LNAA處理插穗，清水處理作為對(duì)照，研究扦插過程中相關(guān)的內(nèi)源激素、酶活性（IAAO、PPO、POD）、茶多酚等多種指標(biāo)變化，主要的目的是通過這些處理來得到在生根過程茶樹生理生化的動(dòng)態(tài)變化，為加快茶樹扦插生根速率提高成活率提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

國(guó)家無性系良種‘龍井43’為試材，選擇當(dāng)年生半木質(zhì)化健壯、無病蟲害的枝條剪取插穗，于陜西省漢中貫山育苗基地進(jìn)行試驗(yàn)，插穗剪下后用300 mg/LNAA處理插穗底部30 min，同時(shí)以清水處理作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)200株插穗。以扦插苗1 d、3 d、5 d、15 d、30 d、45 d以備使用，并測(cè)定生根過程中的內(nèi)源激素含量、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的活性、及茶多酚含量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定內(nèi)源激素含量

內(nèi)源激素含量的測(cè)定采用間接酶聯(lián)免疫法（ELISA）參考唐尚格的方法，其中包括脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、玉米素核苷（ZR）、吲哚乙酸（IAA）水平的測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定酶活性

PPO活性的測(cè)定參考張正竹，酶活以每克樣每分鐘內(nèi)A460增加0.1為一個(gè)活力單位，計(jì)算公式如下：酶活力，A代表反應(yīng)終止時(shí)460nm的吸光度值，m代表干重g，t代表反應(yīng)時(shí)間min。POD活性的測(cè)定參考劉萍的方法，在470nm波長(zhǎng)處測(cè)定A470值的變化。IAAO活性以每克樣每分鐘內(nèi)A470吸光度變化0.01為一個(gè)酶活力單位。IAAO活性以每毫升酶液每小時(shí)分解破壞IAA的量（ug）表示酶活力大小。

1.2.3 茶多酚含量的測(cè)定

采用酒石酸亞鐵比色法，茶多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，在一定波長(zhǎng)下有最大吸收。在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)，多酚的含量與絡(luò)合物的吸光度成正比，故用分光光度法對(duì)茶多酚定量分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 內(nèi)源激素含量的變化

通過對(duì)根系內(nèi)源激素含量的測(cè)定，可以看出經(jīng)過NAA處理的扦插苗和清水對(duì)照處理的扦插苗（圖1）。扦插苗插穗的ABA含量在扦插的過程中有短暫下降的過程，1～5 d的時(shí)候，開始出現(xiàn)上升，之后又再次出現(xiàn)降低，無論是哪種處理，30 d的時(shí)候又進(jìn)入上升的趨勢(shì)（圖2）。經(jīng)過NAA處理的扦插苗的插穗與對(duì)照處理的扦插苗的插穗的韌皮部?jī)?nèi)源GA3活性變化一致，先降低，再高升，后降低的趨勢(shì)（圖3）。經(jīng)過NAA處理的扦插苗的插穗的ZR含量在第5d的時(shí)候出現(xiàn)了高峰，而對(duì)照處理的扦插苗的插穗的ZR含量的高峰期在第30d的時(shí)候出現(xiàn)（圖4）。

2.1.2 酶活性變化

生根的前期NAA處理和CK插穗中

PPO的活性均在第15 d達(dá)高峰，然后出現(xiàn)急劇下降的現(xiàn)象（圖5）。POD活性的變化，在兩個(gè)處理中均表現(xiàn)出下降→上升→下降→上升的變化趨勢(shì)，但NAA處理的較對(duì)照有所提高（圖6）。插穗中IAAO的含量變化情況如圖7，清水對(duì)照處理的插穗葉片和NAA處理插穗葉片IAAO活性均出現(xiàn)先升后降變化情況。

2.1.3 茶多酚含量變化

對(duì)照處理插穗茶多酚含量下降，上升，下降的情況，與NAA相反，茶多酚的含量呈現(xiàn)出下降→上升→下降→上升趨勢(shì)（圖8）。這種情況的出現(xiàn)多是PPO活性升高然后可能催化IAA和酚類物質(zhì)形成“IAA-酚酸復(fù)合物”，最終使茶多酚下降。

2.2 討論

2.2.1 內(nèi)源激素的變化與不定根的形成

扦插后第1 d IAA含量大幅度下降，主要原因可能是與早期的細(xì)胞分裂與根原基的組建有關(guān)，第30 d時(shí)，NAA插穗中的IAA含量高于對(duì)照，達(dá)到了最高峰（圖1）。說明IAA初期的升高在根愈傷形成及不定根發(fā)生過程中非常重要。在生根的過程N(yùn)AA插穗的內(nèi)源IAA的含量高于對(duì)照，生根率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照。由外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA處理的插穗中的內(nèi)源IAA可能被促進(jìn)，從而有利于不定根發(fā)育和伸長(zhǎng)。促進(jìn)不定根的形成萌發(fā)與伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的激素極有可能是內(nèi)源激素IAA，與形成層形成位點(diǎn)誘導(dǎo)和第1次細(xì)胞分裂啟動(dòng)有很大關(guān)系。ABA的含量前期出現(xiàn)上升的情況（圖2），主要可能是降低逆境對(duì)插穗的損傷的原因。在愈傷組織誘導(dǎo)期和根源基誘導(dǎo)期，5～30 d的時(shí)候出現(xiàn)了明顯的下降，這種情況說明低濃度的內(nèi)源ABA對(duì)茶樹生根有促進(jìn)作用。ABA是植物體內(nèi)一種抑制性植物激素，但是低濃度的ABA有促進(jìn)植物生根的作用，高濃度ABA抑制IAA的運(yùn)輸和離體器官的生長(zhǎng)，抑制生根的形成。GA3含量無論是對(duì)照還是處理，在第15～30 d都出現(xiàn)明顯的下降（圖3），此階段根的愈傷明顯形成，說明低濃度的GA3在根愈傷形成期間起到了重要作用，與前人研究結(jié)果一致。NAA處理可以將ZR的高峰期提前（圖4）。

2.2.2 酶活性的變化與不定根的形成

NAA處理的插穗PPO活性高于對(duì)照（圖5）。PPO對(duì)于IAA與酚類物質(zhì)的快速縮合而形成“IAA-酚酸復(fù)合物”有催化作用，這種復(fù)合物對(duì)不定根形成萌發(fā)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。PPO變化的趨勢(shì)（圖5）可以明白在不定根形成的早期PPO活性高，后期PPO活性顯著下降，說明PPO對(duì)根原基形成起著重要作用。NAA處理插穗POD活性變化趨勢(shì)和對(duì)照處理插穗接近一致，呈先下降，再上升，后下降，最后上升，但與對(duì)照相比提高了（圖6）。在茶樹根誘導(dǎo)期，POD活性上升氧化IAA，消除了插穗體內(nèi)過多內(nèi)源IAA，有利于誘導(dǎo)根原基的發(fā)育。插穗的POD活性出現(xiàn)下降，使插穗體內(nèi)IAA含量出現(xiàn)上升的情況，對(duì)不定根的形成有促進(jìn)，隨后POD活性出現(xiàn)升高。就IAAO活性變化水平而言，對(duì)照處理低于激素NAA處理（圖7），變化的趨勢(shì)也更為簡(jiǎn)單。IAA分解的專一性的酶是IAAO，這種酶通過O2對(duì)IAA氧化。高活性IAAO對(duì)植物體內(nèi)IAA的水平有降低的功效。

2.2.3 茶多酚含量變化與不定根的形成

生根過程N(yùn)AA處理的插穗的茶多酚含量的變化與對(duì)照變化的趨勢(shì)稍有不同（圖8）。

3 小結(jié)

茶樹插穗內(nèi)源激素通過自我調(diào)控變化達(dá)到有利于生根的水平。插穗在剛開始時(shí)（脫離母體），內(nèi)源激素等物質(zhì)會(huì)迅速由葉片向生根部位進(jìn)行運(yùn)輸。而且在傷口部位過氧化物酶活性會(huì)增強(qiáng)，在愈傷組織形成及根原基孕育期IAA，ZR含量不斷增加、積累并維持在較高水平,以誘導(dǎo)生根，生根后下降，以利于生長(zhǎng)；研究結(jié)果顯示：內(nèi)源激素與不定根的產(chǎn)生表現(xiàn)出不同的相關(guān)性：其中高含量的IAA、IAA/ABA與不定根產(chǎn)生成正相關(guān)，ZR、GA3、ABA與不定根的產(chǎn)生成負(fù)相關(guān)；就吲哚乙酸氧化酶（IAAO）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）的活性而言，經(jīng)過NAA處理的插穗高于對(duì)照插穗；生根過程N(yùn)AA處理的插穗的茶多酚的含量呈現(xiàn)出的趨勢(shì)為下降→上升→下降，對(duì)照的趨勢(shì)與NAA正好相反，茶多酚的含量呈現(xiàn)出下降→上升→下降→上升的趨勢(shì)。