金葉女貞棒孢葉斑病菌的生物學(xué)特性、致病性及系統(tǒng)發(fā)育

王樹(shù)和，周彩勤，張奎望，劉慧迪

（河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南 洛陽(yáng)471023）

金葉女貞Ligustrum×vicaryi又名英國(guó)女貞，新葉呈金黃色，在園林綠化中作為色葉樹(shù)種和造型樹(shù)種被廣泛栽植［1-2］。為了達(dá)到觀賞效果，在園林設(shè)計(jì)和施工中金葉女貞常被高密度栽植，從而使病害發(fā)生嚴(yán)重。由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的葉斑病是金葉女貞上新見(jiàn)的一種嚴(yán)重病害，葉片感染后，出現(xiàn)輪紋病斑并伴隨大量落葉，嚴(yán)重影響景觀和生態(tài)價(jià)值［3］。多主棒孢是一種寄主范圍廣泛的重要植物病原菌，可侵染380個(gè)屬內(nèi)的530余種植物，包括黃瓜Cucumis sativus，番茄Solanum lycopersicum，辣椒Capsicum annuum和茄S.melongena等重要經(jīng)濟(jì)作物［4］。對(duì)不同寄主分離的棒孢菌株進(jìn)行寄主范圍及致病力測(cè)定，結(jié)果表明：多主棒孢種內(nèi)存在寄生?；F(xiàn)象，來(lái)源于同一寄主的多主棒孢致病力具有高度的相似性，與其他來(lái)源的菌株存在顯著的差異［5-6］。進(jìn)一步的遺傳多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析表明：相同寄主來(lái)源菌株同源性較高，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與各菌株間的致病力具有一定的相關(guān)性，說(shuō)明多主棒孢的種內(nèi)分化可能與其寄主來(lái)源有關(guān)［7-8］。病原菌寄生?；缘挠袩o(wú)決定了不同寄主間是否存在交叉侵染的可能，對(duì)于制定防治策略具有重要意義。為研究金葉女貞上分離多主棒孢是否對(duì)其他經(jīng)濟(jì)作物有致病性，明確其與其他主要經(jīng)濟(jì)作物上分離棒孢的親緣關(guān)系，本試驗(yàn)從河南省洛陽(yáng)市分離的多主棒孢中選取代表菌株進(jìn)行致病性測(cè)定并對(duì)其核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS），β-微管蛋白（β-tubulin）基因和延伸因子（ef-1α）基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析，為該病害的深入研究提供理論依據(jù)。另外，針對(duì)新見(jiàn)的金葉女貞葉斑病，對(duì)其病菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并對(duì)病原菌形態(tài)描述補(bǔ)充了更為詳實(shí)的研究方法和結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 病害標(biāo)本采自河南省洛陽(yáng)市隋唐遺址植物園、洛浦公園及開(kāi)元大道兩旁綠化帶，保存在河南科技大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室；供試菌株（ST1，ST2，ST3）由采集的病葉分離、純化，經(jīng)柯赫氏法則確認(rèn)后備用。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基，配方參考方中達(dá)［9］的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌形態(tài)觀察 病葉保濕培養(yǎng)后，刮取病原菌子實(shí)體在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照，隨機(jī)分別選取100個(gè)分生孢子梗和分生孢子測(cè)量其大小，參照田雪亮等［10］方法觀察孢子萌發(fā)。將分離獲得純培養(yǎng)供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)2周后，顯微觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)特征，并隨機(jī)分別選取100個(gè)分生孢子測(cè)量其大小。

1.2.2 病原菌生物學(xué)特性研究 ①溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。將供試菌株ST1轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)6 d，用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打出菌餅，接種于PDA平板后分別置于5，10，15，20，25，30，35和40℃共8個(gè)溫度處理下培養(yǎng)。每處理重復(fù)5次，6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。②pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。PDA培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃左右時(shí)，用1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4，5，6，7，8，9，10和11并制成平板，轉(zhuǎn)接ST1菌株菌餅后25℃培養(yǎng)6 d。每處理重復(fù)5次，6 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。③光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。設(shè)置全黑暗、全光照（25 W日光燈）、黑暗光照交替（12 h黑暗+12 h光照）3種光照條件。其他同②。④碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。以Czapek培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉、木糖和D-果糖替換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，制成不同碳源的培養(yǎng)基平板，其他同②。⑤氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響。以Czapek培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用蛋白胨、酵母膏、尿素、L-天冬氨酸、硝酸銨和硫酸銨替換Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，制成不同氮源的培養(yǎng)基平板，其他同②。

1.2.3 不同寄主致病性測(cè)定 參考劉以道等［11］方法，選取金葉女貞、黃瓜、番茄、辣椒和茄的健康葉片（金葉女貞為枝條上部嫩葉，其他為2～4片真葉期葉片），用體積分?jǐn)?shù)為0.8%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次，正面向上平放在保鮮盒內(nèi)，葉柄用少許滅菌棉花包住，滴加無(wú)菌水保濕。采用菌餅接種法接種供試植物的離體葉片，同一葉片主脈對(duì)稱位置設(shè)有傷和無(wú)傷及對(duì)照，葉片左邊上為有傷接種菌餅，下為有傷無(wú)菌對(duì)照（有傷接種用消毒后接種針刺傷）；葉片右邊上為無(wú)傷接種菌餅，下為無(wú)菌對(duì)照。接種時(shí)用直徑5 mm的打孔器在生長(zhǎng)6 d的菌落上距離中心相同位置打菌餅，再將菌餅接種于消毒后葉片上，對(duì)照為直徑5 mm的PDA培養(yǎng)基圓碟，每種植物接種10片葉，試驗(yàn)重復(fù)1次。接種葉片放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)25℃條件下保濕培養(yǎng)。接種后每天記錄供試植物的發(fā)病情況，連續(xù)觀察6 d。

1.2.4 病原菌DNA提取、擴(kuò)增及核苷酸序列測(cè)定 采用改良CTAB法［12］提取供試菌株ST1，ST2和ST3基因組 DNA。以引物 ITS1/ITS4，tub-F1/tub-R2和EF1-728F/EF1-986R（表1）分別擴(kuò)增核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）， β-微管蛋白（β-tubulin）和延伸因子（ef-1α）基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 本研究中所用引物序列及其來(lái)源Table 1 Primers used in this study,with sequences and sources

1.2.5 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將得到序列拼接，在GenBank中利用BLAST進(jìn)行序列分析，根據(jù)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)［5］，選擇下載合適序列與本研究供試菌株序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用軟件ClustalX 1.83對(duì)各菌株的rDNA-ITS，β-tubulin和ef-1α基因序列進(jìn)行多重比較后，應(yīng)用SequenceMatrix進(jìn)行序列串聯(lián)［15］，以C.smithii的相應(yīng)基因序列為外群，用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析［16］，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，最后應(yīng)用自舉法（bootstrap）重復(fù)抽樣1000次以評(píng)估各分支節(jié)點(diǎn)的可靠性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征及菌落特征

發(fā)病葉片保濕培養(yǎng)2～3 d后葉兩面產(chǎn)生大量子實(shí)體，分生孢子梗褐色或淺褐色，單生或幾根簇生，直立或略彎曲，有2～9個(gè)分隔，基部膨大成球形，孢梗長(zhǎng)98.5～768.6 μm（平均423.4 μm），孢梗寬4.5～6.6 μm（平均5.3 μm）（圖1A）；偶見(jiàn)有層出梗孢（圖1B）；分生孢子淺褐色或淺橄欖色，形態(tài)以柱狀為主， 偶見(jiàn)倒棍棒狀， 直或稍彎曲， 孢子長(zhǎng) 78.8～317.3 μm（平均173.5 μm）， 孢子寬 5.3～12.6 μm（平均7.9 μm），橫隔數(shù)3～19個(gè)（平均11.9個(gè)）（圖1C）。分生孢子萌發(fā)方式主要從孢子兩端長(zhǎng)出芽管，偶見(jiàn)只從一端長(zhǎng)出芽管（圖1D）。

PDA培養(yǎng)基上通常培養(yǎng)7～8 d以后可產(chǎn)生少量分生孢子，2周后產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子淺褐色到褐色，長(zhǎng)橢圓形或倒棍棒形，較直，有橫隔（圖1E）；孢子長(zhǎng)14.8～147.8 μm（平均47.3 μm），孢子寬 4.8～9.5 μm（平均 6.9 μm）， 橫隔數(shù)： 0～10 個(gè)（平均2.8個(gè)）（圖1E）。分生孢子產(chǎn)生于由菌絲特化的分生孢子梗上，單生或2～6個(gè)串生（圖1F）。

圖1 Corynespora cassiicola形態(tài)特征Figure 1 Morphology of C.cassiicola

2.2 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

在10～25℃內(nèi)，隨著溫度升高病原菌生長(zhǎng)速度增加，25℃時(shí)菌落直徑最大，達(dá)到（7.27±0.10）cm，顯著高于其他溫度條件下菌落直徑（P＜0.05）；30℃之后隨著溫度升高生長(zhǎng)速度下降，40℃生長(zhǎng)6 d后菌落直徑僅為（1.08±0.37）cm；病原菌在5℃不能生長(zhǎng)（圖2）。

圖2 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 2 Effect of temperature on radial hyphal extension of C.cassiicola on PDA

2.3 不同pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌能在較廣的pH值范圍內(nèi)生長(zhǎng)。pH值為4～11時(shí)菌絲均能生長(zhǎng)，以pH值為6～8時(shí)生長(zhǎng)最好，菌落直徑顯著大于其他pH值條件下的菌落直徑（P＜0.05）；在pH值為4時(shí)菌絲生長(zhǎng)較緩慢，菌落直徑為（5.84±0.08）cm，顯著小于其他pH值條件下菌落直徑（P＜0.05）（圖 3）。

圖3 不同pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 3 Effect of pH on radial hyphal extension of C.cassiicola on PDA

2.4 不同光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌菌絲在光暗交替（12 h光照/12 h黑暗）下生長(zhǎng)較好，菌落直徑為（7.26±0.21）cm，顯著大于連續(xù)黑暗條件下菌落直徑（P＜0.05），連續(xù)光照和光暗交替條件下病菌菌落大小沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）（圖 4）。

2.5 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌在供試的7種碳源上均可生長(zhǎng)，但對(duì)各碳源利用程度不同（圖5）。以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，菌落直徑為（7.04±0.07）cm，顯著大于其他碳源條件下菌落直徑（P＜0.05）；其次是以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基。病原菌在D-果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較慢，其菌落直徑顯著低于以麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、可溶性淀粉和木糖為碳源的菌落直徑（P＜0.05）（圖5）。

2.6 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

在氮素營(yíng)養(yǎng)利用方面，蛋白胨作為氮源病菌菌絲生長(zhǎng)最好，其次是酵母膏，兩者顯著優(yōu)于尿素、L-天冬氨酸、硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨（P＜0.05）；病原菌在以銨鹽硝酸銨和硫酸銨為氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑顯著小于其他氮源（P＜0.05）（圖6）。

2.7 ST1菌株對(duì)不同寄主致病性測(cè)定

接種試驗(yàn)結(jié)果表明：C.cassiicola菌株ST1除了侵染金葉女貞外，還可侵染黃瓜、番茄、辣椒和茄，不同植物葉片上的顯癥時(shí)間存在差異（表2）。如圖7所示：金葉女貞、辣椒、番茄和黃瓜葉片有傷接種1～2 d后都可見(jiàn)病斑，金葉女貞上病斑擴(kuò)展最快（圖7A）。辣椒葉片無(wú)傷接種2～3 d后出現(xiàn)褐色小斑點(diǎn)，近圓形或不規(guī)則，病斑周?chē)悬S色暈圈（圖7B）。番茄葉片無(wú)傷接種5 d后出現(xiàn)水漬狀病斑（圖7C）。黃瓜葉片無(wú)傷接種最早出現(xiàn)癥狀，病斑呈水漬狀小斑點(diǎn)，擴(kuò)展后略凹陷、近圓形或不規(guī)則，病斑后期變?yōu)楹稚車(chē)悬S色暈圈（圖7D）。茄葉片無(wú)傷接種顯癥最晚，5～6 d后出現(xiàn)水漬狀小斑點(diǎn)（圖7E）。

圖4 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 4 Effect of light on radial hyphal extension of C.cassiicola on PDA

圖5 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 5 Effect of various carbon sources on radial hyphal extension of C.cassiicola

圖6 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Figure 6 Effect of various nitrogen sources on radial hyphal extension of C.cassiicola

圖7 不同寄主植物接種6 d后癥狀Figure 7 Symptom in pathogenicity test after 6 days of inoculation

2.8 基于ITS，β-tubulin基因和ef-1α基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)源自于金葉女貞、黃瓜、辣椒、番茄和茄上的多主棒孢菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，采用NJ法基于ITS，β-tubulin基因和ef-1α基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖8）。圖8表明：同一寄主植物的分離物以較高的置信度相聚在一起，來(lái)自5個(gè)寄主植物上的多主棒孢菌株形成3個(gè)大分枝，寄主為辣椒和茄的分離物聚在1個(gè)分枝A（自展支持率為99%），番茄上的分離物獨(dú)自聚為1個(gè)分枝B（自展支持率為99%）。本研究獲得的3個(gè)分離物ST1，ST2和ST3在進(jìn)化關(guān)系上與黃瓜上分離的所有菌株親緣關(guān)系最近，以較高的自舉值（自展支持率為100%）聚為一個(gè)分枝C。

表2 C．cassiicola對(duì)不同寄主葉片的致病性Table 2 Pathogenicity of C．cassiicola to leaves of different hosts

3 討論

本研究觀察發(fā)現(xiàn)：在自然發(fā)病葉片上多主棒孢形成的分生孢子與PDA培養(yǎng)基上形成的孢子在形態(tài)、大小方面有很大的差異，發(fā)病葉片上形成的分生孢子形態(tài)以柱狀為主，偶見(jiàn)倒棍棒狀，直或稍彎曲，孢子平均長(zhǎng)173.5 μm，孢子平均寬7.9 μm，橫隔膜平均11.9個(gè)；PDA培養(yǎng)基上形成的分生孢子形態(tài)為長(zhǎng)橢圓形或倒棍棒形，較直，孢子較短，平均長(zhǎng)僅為47.3 μm，孢子平均寬6.9 μm，橫隔膜平均2.8個(gè)。這與潘羨心等［17］報(bào)道的結(jié)果較一致，自然侵染橡膠Hevea brasiliensis樹(shù)葉片上產(chǎn)生的多主棒孢分生孢子比在PDA培養(yǎng)基上的形成分生孢子更長(zhǎng)，具有更多的隔膜。由此可見(jiàn)，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)多主棒孢分生孢子形態(tài)影響較大，由于棒孢屬內(nèi)種的劃分主要依據(jù)分生孢子梗的形態(tài)、大小、層出梗的多少以及分生孢子的大小、顏色、形狀及假隔膜數(shù)［18］。筆者建議多主棒孢的鑒定以自然寄主上形態(tài)特征為準(zhǔn)。

圖8 基于ITS，β-tubulin和ef-1α基因序列采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 8 Phylogenetic tree based on the combined nucleotide sequences of ITS,β-tubulin and ef-1α genes

本研究表明：金葉女貞葉斑病原菌多主棒孢可生長(zhǎng)的溫度為10～40℃，適宜生長(zhǎng)溫度為25℃，與橡膠［17］， 甜瓜Cucumis melo［19］， 廣藿香Pogostemon cablin［20］等其他寄主植物上多主棒孢生長(zhǎng)的適宜溫度一致，這與該病在洛陽(yáng)地區(qū)5月下旬開(kāi)始發(fā)病，7-8月高溫多雨季節(jié)有利于病害迅速傳播蔓延的發(fā)病規(guī)律相吻合。病原菌在pH值為4～11的范圍菌絲均能生長(zhǎng)，在酸性條件pH值為4和5，堿性條件pH值為10和11時(shí)生長(zhǎng)狀況稍差，但仍有一定的生長(zhǎng)量，可見(jiàn)該病菌既耐酸又耐堿，適應(yīng)范圍較廣。

碳源和氮源在病原菌生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中具有非常重要的作用，碳源是構(gòu)成其細(xì)胞骨架的主要物質(zhì)，也是生命活動(dòng)所需能源的提供者，而氮源則是其用來(lái)進(jìn)行核酸、蛋白質(zhì)、酶類以及含氮代謝產(chǎn)物合成的物質(zhì)［21］。不同菌物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶種類、活性存在差異，因此對(duì)碳源和氮源的利用也存在差異［22］。本研究表明：金葉女貞葉斑病病原多主棒孢對(duì)麥芽糖的利用最好，與張春霞等［23］和張賀等［24］的研究結(jié)果一致。在氮源利用上，病菌對(duì)無(wú)機(jī)氮源銨鹽利用能力最低，有機(jī)氮源蛋白胨和酵母膏最適合該病菌，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)氮營(yíng)養(yǎng)豐富且成分復(fù)雜，除含有氮素外還含有其他生長(zhǎng)因子，更有利于微生物的生長(zhǎng)。

多主棒孢寄主范圍很廣，可以寄生在許多不同科屬的植物上［4，7］，但其中一些菌株卻只能對(duì)某種植物致病，種內(nèi)存在寄生專化現(xiàn)象［6,8］。本研究結(jié)果表明：從金葉女貞上分離的多主棒孢菌株對(duì)供試植物都有致病性，但是致病力存在明顯差異，ST1菌株對(duì)金葉女貞致病力最強(qiáng)，其他依次是黃瓜、辣椒、番茄和茄。據(jù)此結(jié)果，建議在黃瓜、辣椒、番茄和茄等蔬菜園周?chē)灰灾步鹑~女貞，避免交叉感染。進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，相同寄主來(lái)源菌株同源性較高，聚在一個(gè)分枝上，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致［5,7］；另外，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示金葉女貞上分離的多主棒孢菌株與黃瓜上分離的菌株親緣關(guān)系很近，以較高的自舉值（自展支持率為100%）和黃瓜上分離的所有菌株聚為一簇。SUMABAT等［8］對(duì)分離自美國(guó)東南部地區(qū)8個(gè)寄主植物上的多主棒孢進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，也發(fā)現(xiàn)同一寄主植物上分離的多主棒孢在遺傳上往往具有更高的一致性；不同寄主上多主棒孢菌株間親緣關(guān)系有差異，棉花上分離的多主棒孢菌株與大豆上的菌株親緣關(guān)系更近，聚為一族（自舉檢驗(yàn)值94%/貝葉斯后驗(yàn)概率100%）。