鈣通道抑制介導(dǎo)軸突穩(wěn)定對視神經(jīng)損傷修復(fù)作用的研究進展

喻哲昊，王鵬飛，曹 霞

0引言

外傷性視神經(jīng)損傷是導(dǎo)致不可逆失明的主要原因，并且可造成因視神經(jīng)軸突變性和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)凋亡而導(dǎo)致的進行性視力損害。迄今為止，無論是藥物治療還是手術(shù)治療都沒有很好的療效，無法阻止視力丟失。軸突再生是視神經(jīng)損傷后視覺功能恢復(fù)的關(guān)鍵，視神經(jīng)損傷后，RGCs軸突通常不能再生，進而導(dǎo)致視覺功能喪失。軸突的再生對于神經(jīng)連接的恢復(fù)以及損傷后視覺系統(tǒng)功能的重建至關(guān)重要。與其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突相似，視神經(jīng)具有非常有限的再生能力。到目前為止，還沒有有效的治療方法促進軸突向遠端再生，修復(fù)視覺通路的軸突連接[1]。

最初的損傷導(dǎo)致鈣迅速流入軸突，激活鈣蛋白酶系統(tǒng)、c-Jun N-末端激酶(JNK)系統(tǒng)以及Akt信號途徑來發(fā)揮促凋亡功能，造成軸突變性和RGC凋亡。已有研究表明，引發(fā)急性軸突變性(AAD)的主要事件之一是軸突內(nèi)鈣的流入，而當鈣離子流入被抑制時可顯著減輕軸突變性[2]。本文通過研究鈣通道抑制劑對軸突變性、RGCs存活和軸突再生的影響, 對鈣通道抑制與視神經(jīng)損傷修復(fù)方面的研究和進展做一綜述。

1鈣蛋白酶途徑

1.1鈣蛋白酶鈣蛋白酶是細胞內(nèi)鈣濃度依賴型的中性半胱氨酸內(nèi)肽酶。在胞內(nèi)，鈣蛋白酶活性通過鈣離子濃度增加而增強。鈣蛋白酶可以裂解各種細胞成分，主要作用于細胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶，還參與細胞內(nèi)的信號傳遞。軸突內(nèi)低水平的Ca2+濃度由Ca2+-ATP酶和Na+/Ca2+泵來維持，兩者都直接或間接地依賴于一個恒定的能量供給。損傷影響軸突能量生成和供給，導(dǎo)致軸突內(nèi)鈣離子逐漸積累，最終會激活鈣蛋白酶系統(tǒng)[3]。Zhang等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)發(fā)生AAD的早期，鈣離子迅速流入軸突內(nèi)，使軸突內(nèi)鈣離子濃度增加，從而激活鈣蛋白酶，導(dǎo)致細胞骨架降解。

1.2鈣蛋白酶抑制細胞內(nèi)游離鈣是鈣蛋白酶活化的主要調(diào)節(jié)劑，但鈣蛋白酶也通過與特異性抑制劑——鈣蛋白酶抑素相互作用來調(diào)節(jié)，鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的所有細胞類型中表達[5]。鈣蛋白酶抑素(calpastatin)是一種由鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因編碼的蛋白質(zhì)，該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制劑，為軸突變性的主要內(nèi)生調(diào)控器。鈣蛋白酶抑素是唯一已知的蛋白酶抑制劑，目前研究表明其專一性地抑制鈣蛋白酶活性，可抑制初始活化和活化后期的鈣蛋白酶活性[6]。鈣蛋白酶抑素在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)被廣泛表達。研究表明物理損傷后，在退化的軸突上發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑素的消耗，從而影響了軸突的存活水平。軸突變性不僅發(fā)生在病理條件下，而且還發(fā)生在正常神經(jīng)發(fā)育過程。在視神經(jīng)內(nèi)，鈣蛋白酶抑素調(diào)節(jié)正常RGCs軸突的重塑。Yang等[7]通過將對照scrambled-shRNA和calpastatin-shRNA質(zhì)粒電穿孔到野生型小鼠的RGC中來確定內(nèi)源鈣蛋白酶抑素在軸突重塑中的功能，發(fā)現(xiàn)calpastatin-shRNA靶向的絕大多數(shù)軸突已經(jīng)發(fā)生重塑，表明內(nèi)源性鈣蛋白酶抑素在體內(nèi)自主調(diào)節(jié)發(fā)育軸突變性。鈣蛋白酶抑素亦可調(diào)節(jié)軸突內(nèi)的沃勒氏變性。Ma等[8]在視神經(jīng)軸突中表達人鈣蛋白酶抑制素(hCAST)(內(nèi)源性鈣蛋白酶抑制劑)的轉(zhuǎn)基因小鼠上研究了鈣蛋白酶抑素與Wallerian變性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)橫斷后5d，hCAST轉(zhuǎn)基因小鼠相較于對照小鼠其視神經(jīng)絲蛋白水解降低且神經(jīng)-肌肉連接的形態(tài)完整性有所提高。這些結(jié)果提供了直接證據(jù)表明鈣蛋白酶抑制對軸突Wallerian變性有積極的影響。同時，為了測試內(nèi)源性鈣蛋白酶抑素在體內(nèi)Wallerian變性中是否具有調(diào)節(jié)作用，對視神經(jīng)橫斷后軸突中的蛋白水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑素有顯著的消耗。這些發(fā)現(xiàn)表明，在損傷和發(fā)育過程中，內(nèi)源性鈣蛋白酶抑素是在損傷誘導(dǎo)和發(fā)育性退化過程中軸突生存的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[7]。近期有研究證實， 拉坦前列素，一種治療眼內(nèi)壓增加的藥物，可以減弱軸突變性后的鈣蛋白酶抑素的分解，從而保護RGCs免受創(chuàng)傷后神經(jīng)元變性的影響[9]。

1.3鈣蛋白酶抑制對視神經(jīng)損傷的影響鈣蛋白酶的抑制減弱了髓磷脂和軸突蛋白的損失，減少軸突變性[10]。鈣蛋白酶抑制也可保證少突膠質(zhì)細胞存活率，防止軸突神經(jīng)纖維蛋白的退化，改善視網(wǎng)膜上RGC的存活率[11]。近年來，對于鈣蛋白酶抑制在視神經(jīng)損傷方面的研究一直在繼續(xù)。在MAPK級聯(lián)反應(yīng)上游的銜接蛋白Sarm1是激活該MAPK級聯(lián)所必需的。Sarm1-MAPK途徑觸發(fā)局部能量缺失，導(dǎo)致軸突退化變性。Yang團隊通過使用鈣蛋白酶抑制劑在切斷軸突2h后處理軸突發(fā)現(xiàn)，該方法強烈抑制鈣蛋白酶的活化和軸突變性，但均未改善受損軸突的能量缺乏。該實驗表明鈣蛋白酶在ATP消耗的下游發(fā)揮功能，軸突中的局部能量缺乏先于鈣蛋白酶激活和損傷后的形態(tài)變性，并且是其原因[3]。Ma等[12]通過使用病毒載體介導(dǎo)的RGC轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠?qū)⑻禺愋詢?nèi)源性鈣蛋白酶抑素遞送至最大損傷部位(前彎曲視神經(jīng)軸突)，從而使應(yīng)變誘導(dǎo)的軸突內(nèi)鈣蛋白酶活性降低，減輕逆行運輸?shù)闹苯訐p害。經(jīng)研究證實，小鼠的鈣蛋白酶激活加速了軸突損傷和RGCs的凋亡，應(yīng)用鈣蛋白酶抑制劑可以減弱這一過程，結(jié)果表明鈣蛋白酶抑制劑對軸突變性引起的RGC死亡具有保護作用。這條途徑可能是預(yù)防損傷后軸突退化變性的重要治療手段[13]。鈣通道的抑制通過阻斷鈣離子內(nèi)流而降低損傷視神經(jīng)的鈣蛋白酶活性，因此鈣通道抑制減少鈣蛋白酶的活性可以為軸突變性和RGC存活提供一種機械的聯(lián)系[14]。

2 JNK/c-Jun途徑

2.1 JNK/c-Jun信號通路的作用JNK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，JNK信號是一種被激活的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)家族的一個組成部分。Eph/ephrin信號通路涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育至關(guān)重要的一系列過程，研究發(fā)現(xiàn)ephrin A5與EphB2的相互作用導(dǎo)致JNK的持續(xù)激活，其控制細胞凋亡和細胞增殖的平衡，這是在眼睛早期形態(tài)發(fā)生過程中正確關(guān)閉視神經(jīng)裂縫所必需的[15]。而轉(zhuǎn)錄因子c-Jun是JNK的主要目標，由于Jun是轉(zhuǎn)錄因子，所以Jun可能是控制了導(dǎo)致Bax基因激活的表達，一旦激活，Bax就會對線粒體造成無法修復(fù)的損害，同時會引發(fā)下游事件，從而結(jié)束一個垂死的神經(jīng)節(jié)細胞[16]。Jun是RGCs的一個主要轉(zhuǎn)錄中心，控制著生存、支持死亡和支持再生的途徑。因此，JNK/c-Jun信號通路作為一個凋亡信號通路在軸突損傷和神經(jīng)元胞體變性之間有一個重要的作用[17]。最新研究表明，DDIT3(DNA damage-inducible transcript 3)和Jun具有相似功能，同樣是RGC中獨立調(diào)節(jié)的凋亡信號分子，并與Jun共同占據(jù)了軸突損傷后RGCs中絕大多數(shù)凋亡信號。與Jun或DDIT3單獨缺陷相比，Jun和DDIT3聯(lián)合缺失對RGCs的長期存活提供了更大的保護[18]。JNK/c-Jun信號通路的激活還可以在多種細胞應(yīng)激下發(fā)生，例如在阿爾茨海默病(AD)患者的視網(wǎng)膜和腦中，Aβ寡聚體、P-APP和P-Tau特異性地積聚在RGCs層激活JNK途徑，從而導(dǎo)致RGCs變性[19]。從神經(jīng)損傷到神經(jīng)營養(yǎng)缺失的DLK(dual leucine zipper kinase)激活，導(dǎo)致了c-Jun N-末端激酶(JNK)信號的激活[20]；ONC通過TNF-α在RGC中誘導(dǎo)激活了JNK信號通路等。此外， 除了c-Jun，胞質(zhì)內(nèi)還有Bcl-2家族(Bcl-2、Bcl-XL、Bim、BAD)，核內(nèi)有ATF-2、Elk-1、c-My2 等蛋白亦為其底物[21]。

2.2鈣通道抑制與JNK/c-Jun信號通路活性的關(guān)系根據(jù)目前的研究指出，鈣離子流入是激活JNK/c-Jun信號通路的一種附加機制。鈣離子信號在MAPK磷酸酶(MKP)mRNA的轉(zhuǎn)錄延伸中起著重要作用[22]，并且已知其可以上調(diào)MKP-1[23]。軸突損傷導(dǎo)致鈣離子增加，鈣離子增加引發(fā)了MAPKs的激活，并顯著激活JNK信號通路[24]。已有研究表明，JNK信號傳導(dǎo)在損傷的軸突變性早期發(fā)揮作用[25]。在其早期激活之后，以Jun磷酸化的形式在軸突受損的RGC中觀察到持續(xù)的JNK信號傳導(dǎo)，在其磷酸化后立即損傷軸突。最近Ribas等[14]在軸突損傷模型應(yīng)用鈣通道抑制劑發(fā)現(xiàn)JNK/c-Jun信號通路的活性可以通過抑制鈣通道而減弱。因此，鈣通道抑制引起的JNK/c-Jun活性降低可能是減少軸突變性和RGC死亡的另一種機制。此外，KCa3.1，即中電導(dǎo)鈣激活鉀通道，參與許多細胞類型的激活。KCa3.1的激活在細胞活化過程中調(diào)節(jié)鉀流出，膜超極化和鈣流入[26]。之前的研究已經(jīng)證明了KCa3.1在通過c-Jun/JNK MAPK信號通路來調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的過程中起著關(guān)鍵作用[27]。KCa3.1通道的阻斷也顯示出減弱了Aβ誘導(dǎo)的JNK MAPK途徑，導(dǎo)致阿爾茨海默病小鼠模型中腦部炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2的下調(diào)[28]。這也從側(cè)面反映出了鈣通道對JNK信號通路的影響作用。

圖1在鈣通道阻斷劑的作用下，胞內(nèi)鈣離子濃度下降，使鈣蛋白酶和JNK/c-Jun活化減少，而Akt活化增加來減少軸突變性和RGC凋亡，促進軸突再生和RGC存活。

3 Akt信號途徑

3.1 Akt信號通路的作用Akt，即蛋白激酶B(PKB)，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶。Akt的激活由生長因子受體酪氨酸激酶刺激的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介導(dǎo)。Akt(PKB)是PI3K的一個下游效應(yīng)因子。免疫熒光顯示在DRG(dorsal root ganglia)細胞體和軸突生長錐中存在活化的Akt，PI3K抑制劑顯著降低自發(fā)生長的神經(jīng)元存活和軸突生長，神經(jīng)生長因子或神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生因子引起的生長增加也顯著降低[29]。Akt在激活過程中瞬時定位于質(zhì)膜，一旦激活，它就會誘導(dǎo)一些細胞核和胞質(zhì)蛋白的磷酸化，從而調(diào)控多種細胞功能，包括細胞生長、存活、增殖和分化。Akt通過對Bcl-2家族成員和線粒體活性的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[30]。Akt可以加速軸突再生，促進軸突延伸和分支，抑制神經(jīng)元凋亡[31]。目前研究認為，Akt主要通過促進哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、GSK-3等下游底物磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其中包括抗凋亡、促細胞生存等[32-33]。在軸突橫斷的RGCs中激活mTOR信號傳導(dǎo)促進軸突生長超過幾毫米，一些軸突到達視交叉，即視覺通路的中點[34]。值得注意的是，磷酸酶和張力蛋白同系物PTEN(phosphatase and tensin homolog)在RGCs中的缺失促進了視神經(jīng)損傷后軸突的再生[35]。RGCs中PTEN/mTORC1通路的調(diào)節(jié)促進視神經(jīng)損傷后的軸突再生和RGC存活。糖原合成酶激酶3(GSK3)是Akt的信號傳感器。Akt通過將GSK3α的Ser21磷酸化或GSK3β的Ser9磷酸化使GSK3的激酶活性失活。研究顯示GSK3β是RGC中PTEN/Akt信號傳導(dǎo)的主要下游靶標，而GSK3β的底物eIF2Be(真核翻譯起始因子2Bε亞基)在所有真核細胞中翻譯起始蛋白質(zhì)，AKT-GSK3b-eIF2Be信號模塊在確定成熟CNS神經(jīng)元的內(nèi)在軸突生長能力方面發(fā)揮著核心作用[36]。

3.2鈣通道與Akt信號通路活性的關(guān)系p-Akt是一種支持生存的激酶[37]，科研人員在大鼠視神經(jīng)擠壓傷(ONC)模型上研究了鈣通道與Akt活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在鈣通道抑制劑治療的神經(jīng)節(jié)細胞層中，可以觀察到支持生存的Akt信號的激活(磷酸化)，表明Akt在神經(jīng)細胞的生存信號傳遞中有一個關(guān)鍵作用，以及包括RGC生存在內(nèi)的軸突生長。因此，鈣通道抑制引起的Akt活化的增加可以解釋對RGC存活和軸突再生的影響[14]。Akt信號可以阻斷軸突損傷后的不同退化信號，通過限制下游的JNK信號激活來調(diào)節(jié)退化的應(yīng)答[3]。越來越多的證據(jù)表明，在受傷的視網(wǎng)膜中Akt信號通路在支持神經(jīng)元存活方面有著重要的作用[38](圖1)。

4總結(jié)與展望

鈣離子的流入是軸突變性退化調(diào)節(jié)至關(guān)重要的因素。損傷后軸突中鈣水平的升高代表了一種亞穩(wěn)態(tài)的中間狀態(tài)，而不是一個緊急且不可改變的毀滅過程。軸突的損失可以通過阻止鈣的流入或鈣的產(chǎn)生來抑制，即使不在早期也可發(fā)揮作用[39]。鈣通道抑制劑可以刺激神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子泵，使胞內(nèi)的鈣離子濃度趨于穩(wěn)定，減輕鈣離子濃度異常對細胞的損傷[40]。目前大量研究表明，鈣通道抑制劑的應(yīng)用阻止鈣在早期的升高，阻止了大部分軸突的退化變性，同時也有效減少細胞水腫和血管痙攣，避免視神經(jīng)損傷的加重[41]，所以通過阻斷鈣通道從而控制胞內(nèi)鈣的流入是非常重要的?？傊?，通過鈣通道抑制對視神經(jīng)損傷后軸突和RGCs進行保護是一種有效的手段，也是近年來全球?qū)W者研究的熱門領(lǐng)域。當然，鈣通道抑制劑對于損傷部位遠端的繼發(fā)變性效果不明顯等一些缺點目前還沒有攻克，對其機制的研究和開發(fā)還不夠深入，臨床試驗和應(yīng)用也還有待完善，但其對于以保持損傷后軸突的完整性為目標的干預(yù)是非常重要的。當下也是視神經(jīng)損傷后針對軸突變性和RGC凋亡進行組合治療策略的重要步驟。相信在不久的將來，在國內(nèi)外學(xué)者的共同努力下，鈣通道手段治療ONC會逐步從科學(xué)理論走向臨床實踐，為視神經(jīng)損傷的患者帶來福音。