炎性相關因子誘導卵巢癌細胞增殖信號和蛋白酶表達的實驗研究

李 莉， 劉 潔， 艾貴海， 秦錦龍， 丁金曄， 程忠平

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，也是導致婦女癌癥相關性死亡的第5大原因[1]。盡管經(jīng)過基礎研究和臨床研究多年來的共同努力，卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在25%～30%，是致死率最高且預后最差的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅著女性生命的健康[2]。然而，對于卵巢癌的病理發(fā)生機制至今尚未明確。

炎癥是癌癥的重要特征，越來越多的研究表明炎性微環(huán)境參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。腫瘤微環(huán)境中存在大量免疫細胞浸潤，特別是腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TANs)和腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages, TAMs)。它們通過自分泌和旁分泌產(chǎn)生的炎性因子及趨化因子等激活炎性信號形成動態(tài)網(wǎng)絡，同時激活多種細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8等)、趨化因子、蛋白水解酶(基質(zhì)金屬蛋白酶9、中性粒細胞蛋白酶、組織蛋白酶等)以及細胞表面受體(Toll樣受體等)，使細胞外基質(zhì)的降解，刺激新生血管形成，調(diào)節(jié)細胞黏附，最終導致腫瘤細胞快速增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[5-6]。

卵巢癌的起源及發(fā)生機制目前尚未明了。在轉(zhuǎn)化醫(yī)學和精準醫(yī)學的醫(yī)學背景下，探索炎性微環(huán)境與卵巢癌病理發(fā)生機制之間的聯(lián)系，為卵巢癌的靶向治療提供新的研究思路[7-8]。近年來，越來越多的研究表明卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與炎性病理機制密切相關，并且?guī)缀跎婕奥殉材[瘤發(fā)展的各個階段[9-10]。傳統(tǒng)學說認為，卵巢排卵期間卵巢濾泡附近的上皮細胞廣泛增殖、破壞和凋亡，導致卵泡壁的破裂損傷和隨后重塑修復，最終導致潛在的炎癥反應和細胞基因突變；據(jù)推測，卵巢排卵過程會引起氧化應激、增加炎性相關因子的濃度[11]；還有研究表明卵巢癌的發(fā)生與輸卵管起源和盆腔炎性疾病相關[12]。炎癥及炎性介質(zhì)與卵巢癌的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、化學耐藥及不良預后密切相關[13-15]。然而，炎性微環(huán)境中的炎性相關因子在卵巢癌發(fā)生發(fā)展的確切機制仍然不是很明確。

本實驗旨在研究炎性相關因子(TLR4外源性配體LPS和經(jīng)典炎性細胞因子TNF-α)對卵巢癌細胞炎性增殖增生信號的表達，以及與卵巢癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關的蛋白酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix meta-lloproteinase-9， MMP9)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase， NE)和組織蛋白酶G(cathepsin-G，Cath-G)的表達。探討腫瘤微環(huán)境中的炎性相關因子對卵巢癌胞內(nèi)信號及細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

卵巢癌漿液性細胞系HEY購自美國標準培養(yǎng)收集所；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；異丙醇、無水乙醇及氯仿購自中國國藥集團；脂多糖(LPS)購買于美國Sigma公司(L2630)；Toll樣受體4(Toll-like receptors 4， TLR4)拮抗劑VIPER(NBP2-26244)購自美國Novus公司；TNF-α購自美國Pepro Tech公司(300-01A)，TNF-α拮抗劑GSK2982772購自美國Selleck公司(S8484)；一抗： Anti-TLR4(ab13556)、Anti-TNF-α受體1(TNFR1，ab19139)、Anti-TNFR2(ab109322)、Anti-NF-κB/p65(ab16502)、Anti-MMP9(ab38898)、Anti-NE抗體(ab68672)和Anti-Cath-G抗體(ab231149)均購自美國Abcam公司；Anti-JNK(#9252)、Anti-p-JNK(#9251S)、Anti-p38(#8690)、Anti-p-p38(#9211)、Anti-ERK(#4695)、Anti-p-ERK(#4370)和Anti-GAPDH(#5174)均購自美國Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標記二抗購自上海碧云天公司；MMP9(XY-E11105)和NE(XY-E11079)ELISA試劑盒購自上海信裕生物科技公司；Cath-G的ELISA試劑盒(IC-CTSG-Hu)購自美國ImmunoClone公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和處理

漿液性卵巢癌細胞系HEY采用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。完全培養(yǎng)液中含10%的胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。細胞系置于37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。觀察細胞的生長狀態(tài)和密度，待卵巢癌細胞融合度達到70%～80%，按照1∶3的比例進行細胞傳代。參考以往文獻選擇10ng/mL的LPS刺激卵巢癌細胞48h，2.5ng/mL的TNF-α處理細胞24h，設置該組為刺激組；采用10ng/mL的LPS加200nmol/L TLR4拮抗劑VIPER、2.5ng/mL的TNF-α加1nmol/L TNF-α拮抗劑處理細胞，該組為拮抗劑組；采用的培養(yǎng)液加入細胞中培養(yǎng)相同時間該組為對照組。于100倍光學顯微鏡下分別記錄刺激組、拮抗劑組和對照組的細胞生長情況。

1.3 方法

1.3.1 RNA的提取和real-time PCR 采用TRIzol提取細胞總RNA，測定RNA的濃度和純度，隨后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒進行PCR擴增。Real-time PCR反應根據(jù)以下條件擴增： 95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 45s，共40個循環(huán)。Real-time PCR引物見表1。采用ABI Prism 7300 SDS Software進行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內(nèi)參比較目的基因的表達高低。

表1 Real-time PCR的引物

1.3.2 Western印跡法 分別收集3組細胞，加入RIPA裂解液，4℃，12000r/min，離心半徑8cm，離心15min，抽提蛋白并用BCA試劑進行蛋白定量后儲存于-80℃的冰箱中。將樣品中的蛋白煮沸變性5min后，按15μL/孔蛋白量上樣，隨后將10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC膜)上。5%脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉1h后加入相應的一抗Anti-TLR4(1∶500)、Anti-TNFR1(1∶1000)、Anti-TNFR2(1∶1000)、Anti-NF-κB/p65(1∶1000)、Anti-JNK(1∶1000)、Anti-p-JNK(1∶1000)、Anti-p38(1∶1000)、Anti-p-p38(1∶1000)、Anti-ERK(1∶1000)、p-ERK(1∶1000)、Anti-MMP9(1∶500)、Anti-NE(1∶500)、Anti-Cath-G(1∶500)和Anti-GAPDH(1∶2000)，置于4℃冰箱過夜。洗滌后加入二抗(1∶1000)，室溫封閉1h后，采用化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence, ECL)顯影，并使用Tanon-5200成像系統(tǒng)測定條帶灰度值。

1.3.3 ELISA 分別收集3組細胞培養(yǎng)上清液，按照MMP9、NE和Cath-G的ELISA試劑盒的說明書操作，用酶標儀檢測上清液中MMP9、NE和Cath-G在450nm波長處各孔的去密度值(D450)。根據(jù)MMP9、NE和Cath-G的標準曲線及各孔去密度值計算每孔相應的濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 炎性相關因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細胞增殖信號mRNA的表達及蛋白的激活

采用real-time PCR檢測LPS和TNF-α刺激細胞增殖信號mRNA的表達，結(jié)果顯示： 與對照組比較，在經(jīng)10ng/mL的LPS處理48h的卵巢癌細胞和2.5ng/mL的TNF-α處理24h的卵巢癌細胞中，炎性因子在促進自身受體(TLR4、TNFR1、TNFR2)mRNA表達的同時還誘導炎性增殖信號(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)的表達(P<0.01)，并且該增殖信號應答可分別被LPS受體拮抗劑和TNF-α受體拮抗劑所抑制(P<0.01)，見圖1A、圖1B。Western印跡法結(jié)果顯示： 與對照組相比，在LPS和TNF-α處理卵巢癌細胞中，LPS和TNF-α的相應受體以及增殖信號蛋白p-JNK1/2、p-p38、p-ERK1/2、NF-κB/p65的表達增加，而JNK1/2、p-38、ERK1/2的蛋白表達無明顯變化，見圖1C、圖1D。此外，于100倍光鏡下分別記錄3組細胞生長情況，結(jié)果顯示，炎性相關因子LPS和TNF-α明顯刺激卵巢癌細胞增殖，見圖2。

圖1 LPS和TNF-α對卵巢癌細胞中增殖信號mRNA及蛋白的影響Fig.1 The effect of LPS and TNF-α on the expression of cell proliferation signal mRNA and protein in ovarian cancer cells 與對照組及添加拮抗劑組比較，**P<0.01

圖2 LPS和TNF-α對卵巢癌細胞增殖的影響Fig.2 The effect of LPS and TNF-α on cell proliferation in ovarian cancer cells

2.2 炎性相關因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細胞蛋白酶mRNA及蛋白的表達

分別采用real-time PCR、Western印跡法及ELISA檢測炎性相關因子LPS和TNF-α刺激卵巢癌細胞蛋白酶MMP9、NE和Cath-G的mRNA及蛋白的表達。結(jié)果顯示： 與對照組比較，LPS和TNF-α刺激卵巢癌細胞蛋白酶(MMP9、NE和Cath-G)的mRNA及蛋白(包括細胞和上清液中的蛋白酶蛋白)的表達，該侵襲轉(zhuǎn)移信號可分別被LPS和TNF-α受體拮抗劑所抑制，見圖3。

3 討 論

炎癥是腫瘤公認的標志性特征，越來越多的研究表明慢性炎癥形成的腫瘤炎性微環(huán)境參與腫瘤的起始和進展。在腫瘤微環(huán)境中，慢性遷延的炎癥狀態(tài)被形象的描述為“smouldering”，即“悶燃”或“悶燒”狀態(tài)[16]。局部免疫反應和全身性炎癥反應通過復雜的相互作用與腫瘤的進展及患者的生存預后密切相關[17]。慢性炎癥通過誘導基因不穩(wěn)定性和基因突變、組織異常修復、細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學效應與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關；并且全世界癌癥患者中高達20%的病例與微生物感染相關[18-19]。此外，腫瘤細胞外基質(zhì)中涉及腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的蛋白水解包括尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑復合物、基質(zhì)金屬蛋白酶以及組織蛋白酶等在腫瘤中作為預后標志物具有一定的臨床價值[20]。新近，越來越多的研究表明炎癥參與卵巢癌潛在的生物學機制[21]。然而關于炎性相關疾病與卵巢癌發(fā)生風險的關聯(lián)仍然不確定。

圖3 LPS和TNF-α對卵巢癌細胞中蛋白酶mRNA及蛋白的影響Fig.3 The effect of LPS and TNF-α on the expression of proteases mRNA and protein in ovarian cancer cellsLPS、TNF-α刺激后，卵巢癌細胞中蛋白酶(MMP9、NE、Cath-G)mRNA(A、B)，蛋白(C、D)的表達及細胞上清液中的蛋白酶的表達(E、F)；與對照組及添加拮抗劑組比較，P>0.05(ns)，**P<0.01

尚未有報道采用LPS刺激卵巢癌細胞觀察LPS對卵巢癌細胞的影響，因此，本研究選擇TLR4外源性配體LPS和經(jīng)典細胞因子TNF-α刺激卵巢癌細胞，并通過real-time PCR、Western印跡法和ELISA檢測結(jié)果進行分析，證明了炎性相關因子LPS誘導卵巢癌細胞炎性增殖信號(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)的激活，并促進及腫瘤細胞侵襲相關的蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)表達。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用TLR4外源性配體LPS刺激子宮肌瘤基質(zhì)成纖維細胞和子宮腺肌病間質(zhì)細胞能夠活化TLR4/NF-κB/p65信號途徑，促進實驗細胞的炎性增殖并獲得侵襲表型[22-23]。本研究結(jié)果初步從細胞信號層面佐證了炎性相關因子LPS刺激能夠?qū)е侣殉舶┘毎砻媸荏wTLR4表達增多，同時激活炎性增殖信號(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)及與侵襲轉(zhuǎn)移相關的蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)的表達，且此效應可被TLR4受體拮抗劑所抑制。

本研究結(jié)果與之前的研究報道相類似。LPS作為TLR4信號的激活因子，通過激活NF-κB/p65信號通路在TLR4信號適應蛋白MyD88的介導下，參與上皮性卵巢癌的炎性微環(huán)境和上皮性卵巢癌的化學耐藥[24]。Li等[25]采用組織化學染色研究500多名上皮性卵巢癌患者腫瘤中TLR4和MyD88相關標志物的表達，證明在上皮性卵巢癌的TLR4和MyD88高表達以及激活NF-κB/p65信號途徑，提示TLR4/MyD88/NF-κB/p65信號轉(zhuǎn)導可能導致炎性微環(huán)境的驅(qū)動上皮性卵巢癌患者侵襲性表型和不良的臨床結(jié)果。同時，有研究發(fā)現(xiàn)TLR4外源性配體LPS刺激免疫細胞激活細胞內(nèi)MAPKs信號(包括ERK、p38、JNK等)，進一步誘導TLR4、細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-8)和金屬蛋白酶增加(MMP1)[26]。在卵巢癌細胞和組織中ERK、p38、JNK高表達，且呈持續(xù)激活狀態(tài)，參與卵巢癌的進展[27]。綜上，TLR4外源性配體LPS刺激卵巢癌細胞ERK、p38、JNK以及NF-κB/p65的激活，共同參與卵巢癌細胞的炎性微環(huán)境?？傊?，此次實驗研究發(fā)現(xiàn)TLR4外源性配體LPS作用于卵巢癌細胞，刺激NF-κB/p65和MAPKs信號的激活，佐證了TLR4激動劑LPS刺激卵巢癌細胞炎性細胞增殖信號表達的生物學效應。

TNF-α作為急性和慢性炎癥的經(jīng)典炎性細胞因子在卵巢癌微環(huán)境中過表達，并通過刺激細胞因子、促血管生成因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達促進卵巢癌的進展[28-29]。Choi等[30]發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過NF-κB信號的激活刺激炎性細胞因子的釋放，并且與卵巢癌的進展密切相關；TNF-α在卵巢癌血清和組織的高表達，并參與調(diào)節(jié)卵巢癌腫瘤微環(huán)境形成。本實驗運用經(jīng)典炎性細胞因子TNF-α刺激卵巢癌細胞，結(jié)果顯示TNF-α刺激受體TNFR1、TNFR2以及炎性增殖信號(JNK、ERK、p38、NF-κB/p65)和侵襲相關蛋白酶(MMP9、NE、Cat-G)的表達增加，卵巢癌細胞的炎性增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移效應可以被TNF-α受體抑制。與之前發(fā)現(xiàn)TNF-α通過NF-κB/p65信號參與卵巢癌腫瘤發(fā)生發(fā)展相似。

本研究發(fā)現(xiàn)，炎性相關因子影響卵巢癌細胞的炎性增殖增生信號及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關蛋白表達，進而影響卵巢癌細胞內(nèi)信號的改變。本次實驗研究存在許多局限性。此次研究僅僅探索了炎性相關因子作用于卵巢癌細胞與細胞增殖信號及蛋白酶的關系，還需要進行更深入的實驗研究： 采用CCK-8或MTT實驗，檢測炎性細胞因子對卵巢癌細胞活性及細胞增殖的變化；采用細胞劃痕實驗和Transwell細胞體外侵襲實驗檢測卵巢癌細胞在炎性因子刺激下的細胞遷移和侵襲能力；電鏡下觀察炎性因子刺激卵巢癌細胞發(fā)生的形態(tài)變化、細胞程序性壞死及細胞凋亡等情況，從多方面驗證炎性相關因子對卵巢癌細胞生物學行為的影響。此外，還需要進一步探索腫瘤微環(huán)境中的多種炎性相關因子協(xié)同作用與卵巢癌細胞信號及生物學行為的確切關系和調(diào)控機制；進一步利用生物信息學分析及組織學分析(包括多重標記染色)建立卵巢癌組織(包括卵巢癌組織學亞型)樣本中的炎性相關因子的表達與細胞增殖侵襲相關分子表達的相關性。雷月等[31]的研究顯示，聯(lián)合檢測血清中腫瘤標志物CA125、CA199和HE4可提高非良性卵巢癌早期檢測率，后續(xù)研究應進一步關聯(lián)卵巢癌血清炎性因子表達水平、臨床病理分期、細胞分化、轉(zhuǎn)移復發(fā)及生存時間等主要臨床參數(shù)，最終解釋炎性因子參與的腫瘤微環(huán)境與卵巢癌發(fā)生進展以及生存預后的相關性，為卵巢癌的治療提供切實有力的科學依據(jù)。