HIV/HBV共感染者HBV前C區(qū)肝病進(jìn)程相關(guān)的變異分析

莫思柏，羅賢鑫，陳廷憲，陳勇毅，陳建仁

(陽江市公共衛(wèi)生醫(yī)院,廣東 陽江 529500)

由于傳播途徑相似，HIV、HBV共感染常見。據(jù)報道，全球HIV/HBV共感染率約為5%～20%[1]，我國共感染率則為4.2%～19.4%[2]。HIV感染可加速HBV所致的肝硬化、肝癌等終末性肝病進(jìn)程，肝臟疾病已成為HIV感染者死亡的首要原因，但具體機(jī)制不明[3, 4]。研究報道，在HBV單一感染中，HBV基因組前C區(qū)的G1613A、C1653T、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A變異，尤其是A1762T、G1764A變異，與HBV所致的肝病進(jìn)程相關(guān)[5]。來自美國的Audsley J等報道[6]，HIV/HBV共感染者中HBVA1762T、G1764A變異較單一感染常見，但該研究人群以白種人和HBV基因A型為主，與我國人群HIV/HBV共感染人群特點(diǎn)存在明顯差異。截止目前，在中國尚缺乏相關(guān)的前C區(qū)變異數(shù)據(jù)報道，共感染者肝病進(jìn)程加速是否與上述的位點(diǎn)變異相關(guān)有待深入探討。因此，本研究擬以直接堿基測序法，對HIV/HBV共感染者前C區(qū)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，并以HBV單一感染者為對照，研究HIV/HBV共感染者前C區(qū)的肝病進(jìn)程相關(guān)的變異，為深入探討HIV/HBV共感染者疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸的致病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2017年12月我院收治的慢性HBV感染者，依據(jù)治療前HIV抗體檢測結(jié)果分為HIV/HBV共感染組和HBV單一感染組。艾滋病和慢性HBV感染的診斷見參考文獻(xiàn)[7, 8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：抗HIV和HBV治療；肝硬化、肝癌等終末性肝??；有其他肝炎病毒的感染和AIDS相關(guān)性的明顯的機(jī)會性感染。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者已知情、簽訂知情同意書。

1.2 方法

血清HBV DNA提?。翰杉颊呖共《局委熐把?，用EDTA抗凝管收集，3 000 r/min，離心10 min，取上清液。采用QIAamp DNA mini Kit(250)試劑盒從200 μl血清中提取HBV DNA。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

HBV前C區(qū)PCR擴(kuò)增：巢式PCR法擴(kuò)增HBV前C區(qū)，均采用50 μl反應(yīng)體系。第一輪PCR取15 μL HBV DNA純化產(chǎn)物作為模板，PCR第一輪反應(yīng)：上游引物5’-TCGCATGGAGACCACCGTGA-3’；下游引物5’-ATAGCTTGCCTGAGTGC-3’，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 變性15 s，退火68 ℃ 45 s，延伸72℃ 3 min 20 s (循環(huán)30次)。第二輪PCR采用第一輪產(chǎn)物1 μL，PCR第二輪反應(yīng)：上游引物5’-CATAAGAGGACTCTTGGACT-3’；下游引物5’-GAAAGAAGTCAGAAGGC-3’，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；95℃ 變性15 s，退火68 ℃ 45 s ，延伸72 ℃ 7 min (循環(huán)30次)。

1.3 基因測序和分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后條帶清晰、大小正確后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序方法為Sanger雙氧鏈末端終止法測序。采用Vector NTI Suite9.0軟件對基因序列與參考序列進(jìn)行比對，計(jì)數(shù)含有位點(diǎn)變異的序列數(shù)。參考株序列號：B1 D00329；B2 AF121249；B3 M54923；B4 AY033072；B5 AB219429；C1 AY057947；C2 AY217378；C3 X75665；C4 AB048705；C5 AB241111。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料以K-S法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差描述集中趨勢，比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述集中趨勢，比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。定性資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基本信息

成功擴(kuò)增前C區(qū)的抗病毒治療前的慢性HBV感染者共126例，其中HIV/HBV共感染者74例，HBV單一感染52例。CD4+T淋巴細(xì)胞(簡稱CD4細(xì)胞)計(jì)數(shù)38.6(14.5-88.65)(/μl)(以中位數(shù)加四分位間距描述，以下同)，CD8+T淋巴細(xì)胞(簡稱CD8細(xì)胞)計(jì)數(shù)623.5(326.25-779)(/μl)，CD4+T/CD8+T比值0.067(0.033-0.161)。兩組患者性別組成、年齡、HBV基因型、HBeAg狀態(tài)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)比較均無差異(P值均>0.05)，基線信息具有可比性，檢測結(jié)果見表1。

2.2 HIV/HBV共感染組與HBV單一感染組患者前C區(qū)的肝病進(jìn)展相關(guān)變異發(fā)生比較

74例HIV/HBV共感染組中，發(fā)生G1613A、C1653T、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A分別有13例(17.5%)、4例(5.4%)、27例(36.5%)、27例(36.5%)、16例(21.6%)、22例(29.7%)、7例(9.5%)；52例HBV單一感染組中，發(fā)生G1613A、C1653T、A1762T、G1764A、A1846T、G1896A、G1899A分別有6例(11.5%)、2例(3.8%)、10例(19.2%)、10例(19.2%)、9例(17.3%)、19例(23.1%)、3例(5.8%)。HIV/HBV共感染組所有的上述位點(diǎn)變異整體偏高于HBV單一感染組，其中A1762T、G1764A具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.384,P=0.035；χ2=4.384,P=0.035)。變異發(fā)生率比較見圖1。

表1 兩組患者基本資料比較

注：年齡、ALT、AST、TBIL以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)描述

HIV/HBV(n=74)HIV(n=52)**403020100Variationratio(%)G1899AG1613AC1653TA1762TG1764AA1846TG1896A

圖1 兩組變異發(fā)生率的比較

3 討論

由于HIV和HBV有共同相似的傳播途徑(性接觸、血液傳播、垂直傳播)，HIV感染者常合并HBV感染。目前用于治療HIV的HAART雖可同時抑制患者HIV和HBV復(fù)制，但HIV/HBV共感染者長期終末性肝病的風(fēng)險仍明顯增加，HBV所致的終末性肝病成為世界HIV/AIDS患者死亡的首要原因[3, 4]。我國流行HBV基因型以B型、C型為主，易致肝硬化及肝癌，相對A型、D型預(yù)后更差，HBV相關(guān)的終末性肝病導(dǎo)致的死亡在我國尤為嚴(yán)重[2, 9]。因此，研究HIV/HBV共感染人群也應(yīng)充分考慮到各國人群的獨(dú)特性。

在本部分研究中，HIV/HBV共感染者與HBV單一感染者患者的基本信息匹配，其中包括HBeAg、基因型、性別等可能與基因變異發(fā)生率相關(guān)的因素，有效的排除了混雜因素的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV/HBV共感染者所有已報道的前C區(qū)的位點(diǎn)變異發(fā)生率偏高于HBV單一感染者。在HBV單一感染的研究中，HBV前C區(qū)突變可直接影響到病毒復(fù)制能力和HBeAg的表達(dá)，與肝病進(jìn)程密切相關(guān)[10]。在未經(jīng)治療的HIV感染者胃腸道CD4+T淋巴細(xì)胞的消耗導(dǎo)致微生物易位增加，引起循環(huán)中脂多糖水平升高，進(jìn)而可結(jié)合toll樣受體4并激活核因子kB等其他通路，導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和免疫過度的慢性活化[11, 12]。因此，本研究發(fā)現(xiàn)HIV/HBV共感染者前C區(qū)變異較高推測可能是宿主免疫壓力下作用下選擇的結(jié)果。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV/HBV共感染者A1762T、G1764A變異發(fā)生率明顯高于HBV單一感染者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與既往來自美國的Audsley J等報道結(jié)果是一致[6]。A1762T、G1764A雙突變是前C區(qū)最常見的突變，A1762T、G1764A導(dǎo)致肝病進(jìn)展的研究比較多，有研究認(rèn)為A1762T、G1764A通過調(diào)節(jié)前C區(qū)或肝細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子水平增加HBV復(fù)制能力而導(dǎo)致肝癌，也有研究認(rèn)為A1762T、G1764A通過改變HBxAg來促進(jìn)免疫耐受，影響機(jī)體對HBV的免疫清除[13, 14]。

綜上所述，本研究通過分析HIV/HBV共感染組與HBV單一感染組HBV的前C區(qū)肝病進(jìn)程變異差異，提示合并HIV感染更差發(fā)生肝病進(jìn)程相關(guān)的變異，尤其是A1762T、G1764A，具體作用機(jī)制有待深入研究。